技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中，外泌体的制备及构建外泌体小RNA文库的方法。
相关背景技术
[0002] 1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为外泌体“exosome”。现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，其具有在细胞之间传递信息的功能。不同的细胞分泌的外泌体可能包含特异性的蛋白质、DNA和RNA。研究表明在血液(血清、血浆)、尿液、乳汁、羊水、恶性肿瘤腹水等体液以及所有培养的细胞上清中均存在外泌体。
[0003] 外泌体中主要的遗传物质是RNA(miRNA、LncRNA、CircRNA)，其中90％都是小RNA。目前外泌体小RNA高通量测序研究中的一个难点是外泌体的富积与外泌体RNA的提取，因为现有方法提取出的外泌体RNA很难满足传统小RNA的建库的要求。
[0004] 目前存在的分离外泌体的方法主要有以下几种：
[0005] 第一种方法是利用不同的超速离心速度(Théry C et al.Curr Protoc Cell Biol,2006；3:1–29)或者是密度梯度离心(Tauro BJ et al.Methods 2012；56:293–304.)。目前该方法是被认为是外泌体分离的金标准，用此方法分离的外泌体的纯度高，但此方法提取出的外泌体RNA含量非常低，且超速离心机价格昂贵无法普及，并且此方法提取的外泌体结构可能被破坏(Linares R et al.J Extracell Vesicles2015；4:29509)。
[0006] 第二种方法是超滤法(Merchant ML et al.Proteomics-Clin Appl 2010；4:84–96)。此方法虽然操作简单。但是得到的外泌体的纯度不高(Danqi Wang and Wei Sun,Proteomics,2014；14,1922-1932)。
[0007] 第三种方法是商品化的试剂盒，此种方法，可以分为两类，一类是将抽提试剂加入到样品中，离心得到外泌体的沉淀(Lobb RJ et al.J Extracell Vesicles2015；4:27031)，另一类方法是将样品加入到柱子中(Bo AN et al.J Extracell Vesicles2014；3:
23430)，在通过柱子的过程中，样品中的蛋白质等杂质会进入到柱子中，而粒径较大的外泌体会先从柱子中流出，这样能较快速的得到纯度较高的外泌体。市售试剂盒虽然提取的外泌体纯度没有超速离心法纯度高，但是对于普通的RNA研究可以满足，且提取操作简单，时间短。但是，有一些复杂样本，例如尿液、乳汁、细胞上清，从少量的上述样本中提取的外泌体的量实在太少，无法达到一些大规模筛选或表达检测的实验要求，而且，市售的试剂盒价格昂贵，一瓶50mL的外泌体提取液售价达4000多元，而提取过程中要求体液与试剂的比例是1:1，这样要提取到满足后续检测测序要求的外泌体的费用太高，在实际中很难推广应用，很大层度限制了这种方法的应用；血浆、血清外泌体富积也是存在同样的问题，不仅提取试剂昂贵，而且一般需要5mL血浆用于外泌体的富积，不可避免地需要病人抽取大量血液，给病人带来痛苦。
具体实施方式
[0064] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0065] 实施例1、外泌体小RNA文库的构建
[0066] 一、实验所需试剂与器材：
[0067] 1. Ultra-15mL-3KD浓缩管：如图1所示，密理博(millipore)，货号为UFC900324，过滤器中滤膜的截留分子量为3KD，过滤器的容积为15mL。
[0068] 2.Exo Quick Exosome Precipitation Solution：上海吉泰依科赛生物科技有限公司，EXOQ5A。
[0069] 3.Thrombin Plasma Prep for Exosome Precipitation：上海吉泰依科赛生物科技有限公司，TMEXO-1。
[0070] 4.RNAlater,赛默飞，货号是：AM7020。
[0071] 5.Exo Quick-TC for Tissue Culture Media and Urine：上海吉泰依科赛生物科技有限公司，EXOTC10A-1。
[0072] 6.miRNeasy Serum/Plasma Kit(50)：凯杰生物工程(深圳)有限公司，217004。
[0073] 7.NEB Next Small RNA多样本文库制备试剂盒-Illumina(试剂盒1)：NEB，E7300S。
[0074] 二、外泌体的富积
[0075] 所用样本为：100份血浆样本；10份血清样本；5份唾液样本；5份尿液样本；5份乳汁样本；10份细胞上清样本。其中，细胞上清为培养A549肺腺癌细胞系得到的细胞上清液。
[0076] 1.血液、血浆和血清中外泌体的富积
[0077] 1.1血液
[0078] 样本的处理：
[0079] 1)将10mL血液样本从STRECK采血管中转入15mL BD管中；
[0080] 2)步骤1)完成后，将血液样本于1600×g、4℃下离心10min，取上清液；
[0081] 3)步骤2)完成后，将得到的上清液于16000×g、4℃下离心10min，取上清液，即得到血浆样品；
[0082] 外泌体的富积：
[0083] 4)取浓缩管1个(每1个样品用1个管浓缩)，将步骤3)得到的血浆样品加到Ultra-15mL-3KD浓缩管的过滤器中；
[0084] 5)步骤4)完成后，将含有血浆样品的浓缩管于5000×g、4℃下离心1h，弃滤液，将过滤器中液体转移到1.5mL的离心管内，即得到浓缩后的血浆样品；
[0085] 6)去纤维蛋白：步骤5)完成后，用移液器测量浓缩后的血浆样本的体积，按照样品：凝血酶素D＝100:1的体积比加入凝血酶素D(Thrombin Plasma Prep for Exosome Precipitation,4℃保存)，室温孵育5min，10000rpm(相对离心力为11000rcf)、室温下离心5min，取上清液到1.5mL的离心管；
[0086] 7)步骤6)完成后，用移液器测量离心管中得到的上清液的体积，然后加入是上清液体积1/5体积的Exo Quick Exosome Precipitation Solution，轻轻颠倒混匀，得到样品预处理液；
[0087] 8)步骤7)完成后，将得到的样本预处理液于4℃孵育30min，得到混合液；
[0088] 9)步骤8)完成后，将得到的混合液于1500×g、4℃下离心30min，弃上清液，收集沉淀；
[0089] 10)步骤9)完成后，将得到的沉淀继续于1500×g、4℃下离心5min，用200μL移液器小心除去残留的液体，收集沉淀，即得到血浆外泌体；向沉淀中加100μL的0.01M PBS(1×PBS)重悬沉淀，即得到血浆外泌体富积液，-80℃保存。利用电镜观察血浆外泌体富积液，结果显示血浆外泌体富积液含有大量的外泌体。
[0090] 1.2血清
[0091] 样本的处理：所用血清样本的体积为2mL。
[0092] 1)用4mL黄盖采血管(促凝管)收集血液，采集完毕后，轻轻颠倒采血管6次，室温放置；
[0093] 2)将促凝管室温放置40分钟后，1600g室温离心10分钟，离心结束后，在生物安全柜中取上清液，即得到血清样品。
[0094] 外泌体的富积：
[0095] 按照步骤1.1中4)、5)、7)-10)的方法富积得到血清外泌体富积液。利用电镜观察血清外泌体富积液，结果显示血清外泌体富积液含有大量的外泌体。
[0096] 2.唾液外泌体的富积
[0097] 样本的处理：
[0098] 1)取新鲜唾液5mL加到1.5mL的RNAlater中，颠倒混匀，得到混合液；
[0099] 2)步骤1)完成后，加入与混合液等体积的1×PBS颠倒混匀后，然后再加入100μL的蛋白酶K溶液(蛋白酶K浓度为25mg/ml)，65℃水浴5min，得到蛋白酶K处理液；
[0100] 3)步骤2)完成后，将得到的蛋白酶K处理液从水浴锅中取出，于12000×g、4℃下离心10min，收集上清液；
[0101] 4)步骤3)完成后，将上清液用0.22μm的真空过滤器过滤，收集滤液，即得到待富积外泌体唾液样品；
[0102] 外泌体的富积：
[0103] 5)将步骤4)得到的待富积外泌体唾液样品加到 Ultra-15mL-3KD浓缩管的过滤器中，然后于5000×g、4℃下离心1h，弃滤液，将过滤器中液体转移到1.5mL的离心管内，即得到浓缩后的唾液样品；
[0104] 6)向浓缩后的唾液样品中加入是唾液样品1/5体积的Exo Quick Exosome Precipitation Solution，轻轻颠倒混匀，得到样品预处理液；
[0105] 7)步骤6)完成后，将样品预处理液于4℃静置孵育过夜(大于等于12小时)，得到混合液，将该混合液于1500×g、4℃下离心30min，弃上清液，收集沉淀；
[0106] 8)步骤7)完成后，将得到的沉淀继续于1500×g、4℃下离心5min，用200μL移液器小心除去残留的液体，收集沉淀，即得到唾液外泌体；向沉淀中加100μL的0.01M PBS(1×PBS)重悬沉淀，即得到唾液外泌体富积液，-80℃保存。利用电镜观察唾液外泌体富积液，结果显示唾液外泌体富积液含有大量的外泌体。
[0107] 3.尿液外泌体的富积
[0108] 样本的处理：
[0109] 1)将人尿液样品48mL于12000×g、4℃下离心30min，去除细胞碎片，收集上清液；
[0110] 2)步骤1)完成后，将得到的上清液用0.22μm的真空过滤器过滤，收集滤液，即得到待富积外泌体尿液样品；
[0111] 外泌体的富积：
[0112] 3)将步骤2)得到的待富积外泌体尿液样品加到 Ultra-15mL-3KD浓缩管的过滤器中，然后于5000×g、4℃下离心1h，弃滤液，将过滤器中液体转移到1.5mL的离心管内，即得到浓缩后的尿液样品；
[0113] 4)向浓缩后的尿液样品中加入是尿液样品1/5体积的Exo Quick-TC for Tissue Culture Media and Urine，轻轻颠倒混匀，得到样品预处理液；
[0114] 5)步骤4)完成后，将样品预处理液于4℃静置孵育过夜(大于等于12小时)，得到混合液，将该混合液于11000rpm(离心力为1500×g)、4℃下离心30min，弃上清液，收集沉淀；
[0115] 6)步骤5)完成后，将得到的沉淀继续于1500×g、4℃下离心5min，用200μL移液器小心除去残留的液体，收集沉淀，即得到尿液外泌体；向沉淀中加100μL的0.01M PBS(1×PBS)重悬沉淀，即得到尿液外泌体富积液，-80℃保存。利用电镜观察尿液外泌体富积液，结果显示尿液外泌体富积液含有大量的外泌体。
[0116] 4.乳汁外泌体的富积
[0117] 样本的处理：
[0118] 1)取人乳乳汁1.5mL于12000×g、4℃下离心10min，离心两次，去除脂肪和细胞大碎片，收集上清液；
[0119] 2)步骤1)完成后，将得到的上清液于21500×g、4℃下离心40min，去除残留的酪蛋白和脂肪，收集上清液；
[0120] 3)步骤2)完成后，将得到的上清液用0.22μm的真空过滤器过滤，收集滤液，即得到待富积外泌体乳汁样品；
[0121] 外泌体的富积：
[0122] 4)将步骤3)得到的待富积外泌体乳汁样品加到 Ultra-15mL-3KD浓缩管的过滤器中，然后于5000×g、4℃下离心1h，弃滤液，将过滤器中液体转移到1.5mL的离心管内，即得到浓缩后的乳汁样品；
[0123] 5)向浓缩后的乳汁样品中加入是乳汁样品1/5体积的Exo Quick Exosome Precipitation Solution，轻轻颠倒混匀，得到样品预处理液；
[0124] 6)步骤5)完成后，将样品预处理液于4℃静置孵育过夜(大于等于12小时)，得到混合液，将该混合液于1500×g、4℃下离心30min，弃上清液，收集沉淀；
[0125] 7)步骤6)完成后，将得到的沉淀继续于1500×g、4℃下离心5min，用200μL移液器小心除去残留的液体，收集沉淀，即得到乳汁外泌体；向沉淀中加100μL的0.01M PBS(1×PBS)重悬沉淀，即得到乳汁外泌体富积液，-80℃保存。利用电镜观察乳汁外泌体富积液，结果显示乳汁外泌体富积液含有大量的外泌体。
[0126] 5.细胞上清外泌体的富积
[0127] 1)将细胞上清样品涡旋震荡混匀后加至 Ultra-15mL-3KD浓缩管的过滤器中，每次加样量不超过12mL，然后于5000×g、4℃下离心1h，弃滤液，收集过滤器中的液体；重复该步骤，直至48mL细胞上清样品全部浓缩完毕，收集所有的过滤器中的液体，即得到浓缩后的细胞上清样品；
[0128] 2)向浓缩后的细胞上清样品中加入是细胞上清样品1/5体积的Exo Quick-TC for Tissue Culture Media and Urine，轻轻颠倒混匀，得到样品预处理液；
[0129] 3)步骤2)完成后，将样品预处理液于4℃静置孵育过夜(大于等于12小时)，得到混合液，将该混合液于1500×g、4℃下离心30min，弃上清液，收集沉淀；
[0130] 4)步骤3)完成后，将得到的沉淀继续于1500×g、4℃下离心5min，用200μL移液器小心除去残留的液体，收集沉淀，即得到细胞上清外泌体；向沉淀中加100μL的0.01M PBS(1×PBS)重悬沉淀，即得到细胞上清外泌体富积液，-80℃保存。利用电镜观察细胞上清外泌体富积液，结果显示细胞上清外泌体富积液含有大量的外泌体。
[0131] 三、外泌体中总RNA的提取
[0132] 利用miRNeasy Serum/Plasma Kit提取步骤二得到的各外泌体的总RNA，所用QIAzol Lysis Reagent、RWT buffer和RPE bufTer均为试剂盒中试剂，RNeasy Min Elute spin柱子为试剂盒中耗材。具体步骤如下：
[0133] 1)向外泌体富积液中加入是外泌体富积液5倍体积的QIAzol Lysis Reagent，斡旋混匀15s，然后室温孵育5min，得到反应液1；
[0134] 2)步骤1)完成后，向反应液1中加200μL的氯仿，涡旋混匀15s，室温(15-25℃)静置3min，得到反应液2；
[0135] 3)步骤2)完成后，将反应液2于12000×g、4℃下离心5min，收集上清液；
[0136] 4)步骤3)完成后，向收集的上清液中加入是上清液1.5倍体积的无水乙醇，吹打混匀，得到反应液3；
[0137] 5)步骤4)完成后，将反应液3加至RNeasy Min Elute spin柱子中，RNeasy Min Elute spin柱子置于2.0mL的收集管内，然后室温8000×g，离心15s，弃废液；利用同一柱子重复该步骤，直至所用反应液3中的RNA均吸附在柱子上，每次不超过700μl；
[0138] 6)步骤5)完成后，向柱子中加入700μl的RWT buffer，8000×g，离心15s,弃废液；
[0139] 7)步骤6)完成后，向柱子中加入500μl的RPE buffer，8000×g，离心15s,弃废液；
[0140] 8)步骤7)完成后，向柱子中加入500μl的RPE bufTer，8000g离心2min，弃废液；
[0141] 9)步骤8)完成后，将柱子开盖全速离心5min，便于干燥膜，弃废液；
[0142] 10)步骤9)完成后，将柱子置于新的离心管中，然后向柱子中加入16μl无RNA酶水，离心1min，收集洗脱液，即得到外泌体总RNA，-80℃保存。
[0143] 利用Agilent Bioanalyzer 2100和Agilent RNA 6000Pico Kit检测各外泌体总RNA的质量。结果如图2-5所示。
[0144] 图2显示血浆外泌体总RNA的检测结果。RNA的浓度是1,339pg/μl,RNA Integrity Number(RIN)为2.5。
[0145] 图3显示唾液外泌体总RNA的检测结果。RNA的浓度是506pg/μl,RIN为2.4。
[0146] 图4显示乳汁外泌体总RNA的检测结果。RNA的浓度是30,328pg/μl,RIN为2.6。
[0147] 图5显示尿液外泌体总RNA的检测结果。RNA的浓度是1,276pg/μl,RIN为2.6。
[0148] 四、小RNA建库
[0149] 采用NEBNext Small RNA多样本文库制备试剂盒-Illumina(试剂盒1)对步骤三得到的外泌体总RNA进行建库制备小RNA文库，步骤如下：
[0150] 1)连接3’接头：取外泌体总RNA 2.5ng，取3’NEXTflexAdenylated Adapter接头0.5μl，和等体积的Nuclease-free Water(即稀释1倍)0.5μl混合后，70℃，孵育2min，后加入3`Ligation Reaction Buffer(2×)10μl和3`Ligation Enzyme Mix3μl,然后25℃孵育
1hr，进行连接反应，得到连接产物；
[0151] 2)反转录引物退火：取0.5μl SR RT Primer for Illumina和等体积的Nuclease-free Water(即稀释1倍)0.5μl(即稀释1倍)混合后，加至步骤1)得到的连接产物中，在PCR仪中进行反转录的引物退火；
[0152] 3)连接5’接头：取0.5μl 5’SR Adapter和等体积的Nuclease-free Water(即稀释1倍)0.5μl(即稀释1倍)混合后，70℃孵育2min对稀释的接头进行预变性，随后将变性的接头以及5’Ligation Reaction Buffer(10×)1μL以及5’Ligation Enzyme Mix 2.5μL加至步骤2)反应后的体系中，25℃孵育1hr进行连接反应，得到连接产物；
[0153] 4)反转录：对步骤3)得到的连接产物进行反转录，得到反转录产物；
[0154] 5)PCR扩增：对步骤4)得到的反转录产物进行PCR扩增，得到PCR产物，PCR扩增的循环数为18，其余均同试剂盒；
[0155] 6)纯化：利用 PCR Purification Kit纯化步骤5)的PCR产物，得到纯化产物；
[0156] 7)PAGE凝胶电泳：用6％的TBE Gel进行电泳，(胶公司是Invitrogen，货号是EC6265BOX)；
[0157] 8)切胶回收：将带有胶块的胶板放入新配制的EB染胶液中，浸染10-15min，切下140bp-160bp间下边缘的一条带；切胶后进行碎胶，沉淀碎胶粒，吸取上清液即为回收的文库；
[0158] 9)用Linera Acrylamide 1μL,3M NaAc水溶液25μL,100％冰乙醇750μL混合液加入到步骤9)的上清液中，沉淀文库，弃上清液，即得到外泌体小RNA文库。
[0159] 切胶前后的PAGE凝胶电泳如图6所示。结果显示，左图在140bp-160bp有两条白色条带，切清晰带下方的条带为实际位置的小RNA文库，切胶后此处的白色条带消失，可以证明文库被切下。
[0160] 五、测序
[0161] 利用Illumina测序平台步骤四得到的各外泌体小RNA文库进行测序。对提取到的水稻、全血、血浆以及人石蜡包埋人肺癌组织(人FFPE)的总RNA，按照步骤四的方法建的小RNA文库作为对照，按照步骤四的方法，各样本按水稻2.5ng，全血100ng，血浆2.5ng，人FFPE 1.5μg,起始RNA量进行小RNA建库。结果如表1-3、图7和8所示。
[0162] 通过对植物(水稻)、动物(S01:人全血RNA；S02：人血浆RNA；S03：人血浆外泌体RNA；S04：人石蜡包埋组织提取的RNA)不同组织类型提取的RNA进行小RNA建库、测序和分析，从数据质量来看(表1)，除了S04(石蜡包埋组织)样本不确定核苷酸百分比较高(50.11％)(石蜡包埋组织样本质量较差，文库质量低，建库测序结果较差)以外，其它样本Q30即核苷酸正确率在99.9％以上的核苷酸都达到了90％以上，满足小RNA数据质量要求(Q30>85％)；从数据利用率上来看(表2)，rRNA(核糖体RNA，这部分数据需要过滤掉)比例在全血和外泌体RNA中较高，约占总数据的18.75％和25.79％，数据满足小RNA数据质量要求(动物rRNA比例<40％即可)，其它样本例如水稻(8.59％)、人血浆(4.01％)、FFPE(2.8％)样本，rRNA比例都较低；由于小RNA一般都是21-23nt的核酸序列，并且miRNA有其序列特点即首位是U(测序结果为T)，有核苷酸的一个偏好性，从不同长度小RNA首位核苷酸分布(图7)情况来看，图7上为水稻不同长度小RNA核苷酸分布图，长度为22nt的小RNA有U核苷酸的偏好，小RNA分布正常，图7下为所有动物样本不同长度小RNA首位核苷酸分布情况，21-23nt的小RNA有U核苷酸的偏好，小RNA分布正常；从新预测的小RNA长度分布来看，水稻的小RNA长度集中在21和24nt，人新预测的小RNA长度为22nt，属于正常小RNA的长度范围；最后，对人的四个不同组织来源小RNA测序结果进行预测出的小RNA进行比较与正常人的小RNA数据进行比较，发现四种不同组织来源的小RNA已知miRNA数目、新预测的miRNA数量、总的miRNA数量、预测到靶基因的miRNA数、预测到的靶基因数目差异不明显，区别不显著，从而表明人血浆外泌体小RNA文库建库的可靠性。
[0163] 表1：小RNA文库测序数据质量评估
[0164]
[0165]
[0166] 注：SampleID为样本名称，S01为全血(建库起始RNA用量为100ng)，S02为血浆(建库起始RNA用量为2.5ng)，S03为血浆外泌体(建库起始RNA用量为2.5ng)，S04为人FFPE(建库起始RNA用量为1.5μg)，水稻(建库起始RNA用量为2.5ng)；
[0167] ReadSum：总的小RNA Reads数；
[0168] BaseSum：总的核苷酸数；
[0169] GC(％)：GC含量百分比；
[0170] N(％)：不确定核苷酸的百分比；
[0171] Q20(％)：错误识别的概率是1％，即错误率1％，或者正确率是99％；
[0172] Q30(％)：错误识别的概率是0.1％，即错误率0.1％，或者正确率是99.9％。
[0173] 表2：数据利用率
[0174]SampleID Total rRNA Unanno
水稻 9398666 806892(8.59％) 8269225(87.98％)
S01 10145608 1884394(18.57％) 7365562(72.6％)
S02 9357193 375669(4.01％) 8771698(93.74％)
S03 6216133 1603189(25.79％) 4113921(66.18％)
S04 13227534 370501(2.8％) 12435642(94.01％)
[0175] 注：S01为全血，S02为血浆，S03为血浆外泌体，S04为FFPE；Total为总小RNA的种类数；rRNA为注释为rRNA的种类及比例；Unanno为没有注释上的小RNA的种类及比例。
[0176] 表3：预测出的小RNA比较
[0177] S01 S02 S03 S04 Normal‐human
Known miRNA 967 888 778 1074 397
Novel miRNA 194 240 214 138 134
Total 1161 1128 992 1212 531
miRNA with targets 898 872 767 870 444
Target genes 19362 19460 19251 18841 17595
[0178] 注：S01为全血，S02为血浆，S03为血浆外泌体，S04为FFPE；Total为总小RNA的种类数；Normal-human为正常人小RNA表达情况；
[0179] Known miRNA：已知miRNA数目；Novel miRNAs：新预测的miRNA数量；Total：总的miRNA数量，miRNA with Target：预测到靶基因的miRNA数；Target_gene：预测到的靶基因数目。
