[0001] 本发明涉及外泌体分泌促进剂、外泌体的制造方法、及包含外泌体的组合物。

[0002] 外泌体是由细胞分泌的具有直径50～200nm左右的脂质双层膜结构的粒子状物质。外泌体的表面包含源自细胞膜的脂质、膜蛋白，在内部包含核酸(microRNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、DNA等)、蛋白质(酶等)等细胞内的物质。可以经由外泌体的交接而使核酸、蛋白质等各种各样的物质在细胞间移动。已知外泌体作为细胞间相互作用的介质而承担着重要作用，参与了癌的发生·进展、免疫调节、组织再生等广泛的生命现象。

[0003] 近年来，已知间充质干细胞所分泌的外泌体针对各种各样的疾病显示出治疗效果。另外，报道了源自于间充质干细胞之中源自脂肪的干细胞的外泌体有防止皮肤老化、改善皮炎、治愈创伤等美容效果(Xiong M等人，“Exosomes From Adipose‑Derived Stem Cells:The Emerging Roles and Applications in Tissue Regeneration of Plastic and Cosmetic Surgery”,Front.Cell Dev.Biol.,2020；8:574223.,Wei Zhang等人，“Cell‑free therapy based on adipose tissue stem cell‑derived exosomes promotes wound healing via the PI3K/Akt signaling pathway”,Exp Cell Res.,201815；370(2):333‑342.及Li Hu等人，“Exosomes derived from human adipose mensenchymal stem cells accelerates cutaneous wound healing via optimizing the characteristics of fibroblasts”,Sci Rep 2016 12；6:32993；doi:10.1038/srep32993.)。

[0004] 如例如日本特表2020‑522996号公报中所记载的那样，可以通过用药剂对间充质干细胞进行处理从而高效地制备源自间充质干细胞的外泌体。

[0056] 以下，对用于实施本发明的方式详细地进行说明，但本发明并不限于以下的实施方式。

[0057] 〔外泌体分泌促进剂及包含其的组合物〕

[0058] 本实施方式的用于促进间充质干细胞的外泌体分泌的外泌体分泌促进剂包含蜂王浆。

[0059] 间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell：MSC)是来源于骨髓、脂肪等中胚层组织(间充质)的成体干细胞的一种，在自我复制能力之外，还具有分化为骨、软骨、脂肪等间充质组织的分化能力、及免疫调节能力。作为本实施方式中的间充质干细胞，可以是源自脂肪的间充质干细胞、源自骨髓的间充质干细胞、源自牙髓的间充质干细胞等源自间充质组织的间充质干细胞，也可以是源自人人工多能性干细胞(iPS细胞)的间充质干细胞(iMSC)，优选为源自脂肪的间充质干细胞。间充质干细胞可以是源自任意动物的间充质干细胞，优选为人间充质干细胞。

[0060] 可以从脂肪组织中采集的源自脂肪的干细胞(Adipose Derived Stem Cell：ADSC)与源自骨髓的MSC相比，具有可以从全身的脂肪组织中大量采集这样的优点。另外，源自脂肪的MSC与源自骨髓的MSC相比，产生更多有助于器官修复的再生促进因子。因此，使用了源自脂肪的MSC的情况下，可以高效地制造品质良好的外泌体。

[0061] 外泌体(也称为exosome、外排体或小膜泡)是包含细胞内的成分、被细胞分泌至细胞外的粒子状的细胞外囊泡。其粒径通常为50～200nm或50～150nm。外泌体的性质根据进行分泌细胞种类的不同而有所不同。间充质干细胞所分泌的外泌体包含microRNA、信使RNA、DNA等核酸；HGF(肝细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、TGF(肿瘤生长因子)等生长因子；GAPDH(甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶)、烯醇化酶等酶，促进细胞增殖(尤其是成纤维细胞的增殖)，由此参与创伤治愈、组织再生等，而且还具有皮肤的抗老化(抗衰老)等美容效果。

[0062] 蜂王浆是将蜜蜂之中日龄3～12天的工蜂从咽下腺及大颚腺分泌的分泌物混合而制作的乳白色的浆状物质。作为蜂王浆中的主要生理活性成分，例如以蜂王浆中特有的10‑羟基‑2‑癸烯酸、10‑羟基癸酸等有机酸类为代表，可举出蛋白质、氨基酸、肽、脂质、糖类、维生素B类、叶酸、烟酸、泛酸等维生素类、各种矿物质类等。

[0063] 本说明书中，蜂王浆例如可以为生蜂王浆，也可以为对生蜂王浆实施了处理而得的蜂王浆处理物。

[0064] 生蜂王浆例如可以按照常规方法以养蜂产品的形式而得到。蜂王浆的产地没有限制，可以为日本、中国、巴西、欧洲各国、大洋洲各国、美国等中的任意。生蜂王浆包括将所采集的蜂王浆冷冻保存而得的冷冻蜂王浆。

[0065] 作为蜂王浆处理物，可举出对生蜂王浆进行浓缩或稀释而得的蜂王浆浓缩物或稀释物、使生蜂王浆干燥并进行粉末化而得的蜂王浆粉末、用乙醇等有机溶剂对蜂王浆进行提取而得的蜂王浆乙醇提取物等蜂王浆有机溶剂提取物、用蛋白酶对蜂王浆进行处理而得的酶解蜂王浆等。蜂王浆处理物可以是实施了多种处理的处理物。蜂王浆也可以是经酶解及粉末化的酶解蜂王浆粉末。作为蜂王浆处理物，优选为酶处理蜂王浆，更优选为酶处理蜂王浆的粉末。

[0066] 蜂王浆浓缩物例如可以通过从生蜂王浆中除去水分而得到。蜂王浆稀释物例如可以通过向生蜂王浆中添加水分而得到。

[0067] 蜂王浆粉末例如可以通过利用冷冻干燥及喷雾干燥等本技术领域中已知的方法对生蜂王浆进行粉末化而得到。作为干燥方法，可以使用通风干燥、日光干燥等自然干燥、用电等进行加热使其干燥的强制干燥、冷冻干燥等通常在食品加工中采用的已知的任意方法。优选为冷冻干燥。需要说明的是，干燥时间没有特别限制，通风、日光干燥等自然干燥的情况下，可举出约3天左右，用电等进行加热使其强制干燥的情况下，可举出于50℃左右进行1～3天左右。通常，优选的是，以水分含量成为10质量％以下、优选5质量％以下的方式使其干燥。需要说明的是，通风、日光干燥等自然干燥的情况这样的难以使水分含量为10质量％以下的情况下，也可以在后续置于冷冻干燥机中进一步实施减少水分的处理。另外，可以在冷冻干燥或喷雾干燥后利用粉碎机(例如针磨机、锤磨机、球磨机、气流粉碎机)进行粉碎而得到蜂王浆粉末。

[0068] 蜂王浆有机溶剂提取物例如可以通过将乙醇、甲醇、丙醇、丙酮等有机溶剂作为溶剂对生蜂王浆或蜂王浆粉末进行提取而得到。提取时间可以根据被用作原料的生蜂王浆的形态、溶剂的种类及量、提取时的温度及搅拌条件等而适当设定。提取后，可以通过过滤、离心分离等除去固态成分。另外，可以直接使用所提取的溶液，也可以从该溶液中除去溶剂，以浓缩液或粉末的形式使用。作为蜂王浆有机溶剂提取物，优选为蜂王浆乙醇提取物。

[0069] 酶解蜂王浆例如可以通过用蛋白酶对生蜂王浆或蜂王浆粉末进行处理而得到。作为蛋白酶，例如优选选自由具有内肽酶作用的酶、具有外肽酶作用的酶、具有内肽酶作用和外肽酶作用这两者的酶组成的组。尤其优选为同时具有内肽酶作用和外肽酶作用这两者的肽酶。根据使用了该肽酶的酶处理，可以通过一步酶处理将蛋白质低分子化，因此有以下优点：操作简便、且可以防止蜂王浆中所含的有用成分的生理活性的消失及大幅减少。

[0070] 就蛋白酶而言，其来源没有特别限制，可以广泛使用来源于动物、植物、及微生物(细菌、病毒、真菌类(霉、酵母、蘑菇等)、藻类等)的肽酶。

[0071] “外肽酶”可分类为“氨肽酶”和“羧肽酶”。另外，肽酶有时根据最适pH对各酶分别附以酸性、中性、碱性这样的术语，例如有时记载为“酸性外肽酶”、“中性氨肽酶”、“碱性内肽酶”。

[0072] 作为至少具有内肽酶活性的蛋白酶，可举出源自动物的蛋白酶(例如胰蛋白酶、糜蛋白酶等)、源自植物的蛋白酶(例如木瓜蛋白酶等)、源自微生物(例如乳酸菌、酵母、霉、枯草芽孢杆菌、放线菌等)的内肽酶等。

[0073] 作为至少具有外肽酶活性的蛋白酶，可举出羧肽酶、氨肽酶、源自微生物(例如乳酸菌、曲霉属菌、根霉属菌等)的外肽酶、同时还具有内肽酶活性的胰液素、胃蛋白酶等。

[0074] 作为具有外肽酶活性和内肽酶活性这两者的酶的优选例，可举出灰色链霉(Streptomyces griseus)产生肽酶(商品名：Actinase AS)、米曲霉(Aspergillus oryzae)产生肽酶(商品名：PROTEASE A、Flavourzyme、ProteAX、SUMIZYME LP‑G)、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)产生肽酶(商品名：PROTEASE P)。

[0075] 另外，作为具有外肽酶活性的酶的优选例，可举出米曲霉(Aspergillus oryzae)产生肽酶(商品名：UMAMIZYME G、Promod192P、Promod 194P、SUMIZYME FLAP)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)产生肽酶(商品名：Sternzyme B15024)、曲霉属产生肽酶(商品名：KOKULASE P)、米根霉(Rhizopus oryzae)产生肽酶(商品名：肽酶R)。

[0076] 此外，作为具有内肽酶活性的酶的优选例，可举出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生肽酶(商品名：ORIENTASE 22BF、NUCLEICIN)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)产生肽酶(商品名：ALCALASE)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产生肽酶(商品名：PROTEASE S)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生肽酶(商品名：NEWTRASE)、杆菌属产生肽酶(商品名：PROTAMEX)。

[0077] 用蛋白酶处理生蜂王浆时的反应条件(蛋白酶的使用量、反应时的温度、pH、反应时间等)根据所使用的蛋白酶的种类等适当设定即可。

[0078] 蜂王浆可以使用市售的蜂王浆。作为市售的蜂王浆的具体例，例如可举出酶解蜂王浆王(Royal Jelly King Enzyme Treated)(株式会社山田养蜂场制)等。

[0079] 在蜂王浆的存在下培养间充质干细胞时，可促进由间充质干细胞分泌的外泌体的分泌量。被促进的分泌量例如与不存在蜂王浆的情况相比，以每单位容积的培养上清液中的外泌体的粒子数或蛋白质为基准，只要增加10％以上即可，优选的是，增加优选20％以上、30％以上、50％以上、70％以上、100％以上、150％以上或200％以上。

[0080] 在蜂王浆的存在下培养间充质干细胞时，与不存在蜂王浆的情况相比，间充质干细胞中的成分得以发生变化。尤其是microRNA(miRNA)的谱发生变化，其中，尤其是总microRNA中的miRNA‑205‑5p的含量(含有比例)提高。同样地，在蜂王浆的存在下培养间充质干细胞时，与不存在蜂王浆的情况相比，间充质干细胞所分泌的外泌体中的成分也得以发生变化。尤其是源自间充质干细胞的外泌体中的microRNA(miRNA)的谱发生变化，其中，尤其是总microRNA中的miRNA‑205‑5p的含量(含有比例)提高。因此，本实施方式的外泌体分泌促进剂具有提高间充质干细胞及/或由间充质干细胞分泌的外泌体中的、miRNA‑205‑5p的含量的作用。

[0081] 就miRNA‑205‑5p的含量(含有比例)的提高而言，与不存在蜂王浆的情况相比，相对于间充质干细胞中的总miRNA而言的miRNA‑205‑5p的含量只要增加10％以上即可，优选的是，增加优选20％以上、30％以上、50％以上、70％以上、100％以上、150％以上、或200％以上。另外，与不存在蜂王浆的情况相比，相对于源自间充质干细胞的外泌体中的总miRNA而言的miRNA‑205‑5p的含量只要增加10％以上即可，优选的是，增加优选20％以上、30％以上、50％以上、70％以上、100％以上、150％以上、或200％以上。

[0082] 本实施方式的外泌体分泌促进剂可以在体外用于源自间充质干细胞的外泌体的制造(例如，用于后述的源自间充质干细胞的外泌体的制造方法)，另外，也可以向人施予以用于促进分泌体内的源自间充质干细胞的外泌体。本实施方式的外泌体分泌促进剂可以经口施予，也可以非经口施予。经口施予包括肠内施予，非经口施予包括局部施予，尤其是包括经皮施予。

[0083] 经口施予本实施方式的外泌体分泌促进剂的情况下的施予量能够根据组合物的形态及适用方法·适用量的不同而有所不同，对体重60kg的成人而言，每一天按干燥固态成分换算计只要为10～30000mg的蜂王浆即可，优选为100～20000mg、150mg～15000mg、600mg～12000mg、1200mg～10000mg、或2400～8000mg的蜂王浆。该含量可以根据进行摄取的人的健康状态、施予方法及与其他制剂的联用等因素而适当增减。只要每一天的有效施予量在上述范围内，则本实施方式涉及的外泌体分泌促进剂可以一天施予一次，也可以一天二次、一天三次等分多次施予。本实施方式的外泌体分泌促进剂在施予后能立刻获得效果，而1～4周或1个月以上、6个月以上、1年以上的持续施予能使效果更持久，故而优选。

[0084] 非经口施予本实施方式的外泌体分泌促进剂的情况下的施予量能够根据适用的部位及适用范围的不同而有所不同，例如针对皮肤的适用量按干燥固态成分换算计只要为0.01～50mg的蜂王浆即可，优选的是，可以为0.02～40mg，为0.02～35mg、或、0.025～30mg的蜂王浆。

[0085] 本发明的一个实施方式提供包含上述实施方式的外泌体分泌促进剂作为有效成分的组合物，该组合物可以是经口组合物，也可以是局部用组合物，尤其是提供包含上述实施方式的外泌体分泌促进剂作为有效成分的、化妆品原料、化妆品、食品组合物或医药组合物。将本实施方式的外泌体分泌促进剂、或化妆品原料、化妆品、食品组合物或者医药组合物适用于人，并使其作用于处于人体内的间充质干细胞，从而促进外泌体的分泌量，由此增加体内的源自间充质干细胞的外泌体的量，可得到各种各样的美容效果、免疫调节效果。另外，还可得到后述的皮肤护理、成纤维细胞激活效果。

[0086] 包含本实施方式的外泌体分泌促进剂的化妆品原料、化妆品、食品组合物或医药组合物中的蜂王浆的含量没有特别限定，只要是可以实现上述外泌体分泌促进剂的经口施予或非经口施予的施予量的有效量即可。

[0087] 本实施方式涉及的间充质干细胞中的外泌体分泌促进剂、或包含外泌体分泌促进剂的化妆品原料、化妆品、食品组合物或者医药组合物在有效成分的蜂王浆之外可以还包含其他成分。作为其他成分，例如可举出药学上可接受的成分(例如，赋形剂、粘结材料、润滑剂、崩解剂、乳化剂、表面活性剂、基剂、助溶剂、助悬剂)、作为食品可接受的成分(例如矿物质类、维生素类、黄酮类、醌类、多酚类、氨基酸、核酸、必需脂肪酸、清凉剂、粘结剂、甜味剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、香料、稳定剂、防腐剂、缓释调节剂、表面活性剂、溶解剂、润湿剂)、作为化妆品可接受的成分(例如美白剂、保湿剂、抗氧化剂、油性成分、紫外线吸收剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、着色材料、水性成分、水、各种皮肤营养剂)。

[0088] 本实施方式涉及的间充质干细胞中的外泌体分泌促进剂、或者包含外泌体分泌促进剂的食品组合物或医药组合物可以是固态、液态、糊状等任意形状，也可以是片剂(包括素片、糖衣片、泡腾片、薄膜衣片、咀嚼片、含片等)、胶囊剂、丸剂、粉剂(散剂)、细颗粒剂、颗粒剂、液体制剂、悬浮液、乳浊液、糖浆剂、糊剂、注射剂(包括使用时配合于蒸馏水或氨基酸输注液或者电解质输注液等输注液中而制备成液体制剂的情况)、涂敷剂或贴剂等局部用剂型等剂型。上述各种制剂例如可以通过将有效成分和根据需要的其他成分混合并成型为上述剂型而制备。

[0089] 作为食品组合物，优选强调食品的第三功能(身体调节功能)的食品。作为强调食品的第三功能的食品，例如可举出健康食品、功能性标识食品、营养功能食品、营养辅助食品、补剂及特定保健用食品。

[0090] 食品组合物的形态没有特别限定，例如可以为饮料类(咖啡、果汁、茶饮料等清凉饮料、乳饮料、乳酸菌饮料、酸奶饮料、碳酸饮料等)；涂抹酱类(卡仕达酱等)；糊类(果泥等)；西式点心类(巧克力、甜甜圈、馅饼、泡芙、口香糖、果冻、糖果、曲奇、蛋糕、布丁等)；日式点心类(大福、年糕、有馅面点(日文：饅頭)、长崎式蜂蜜蛋糕(日文：カステラ)、Anmitsu式甜点、羊羹等)；冰点心类(冰淇淋、冰棒、冰霜(sherbet)等)；食品类(咖喱、牛肉盖浇饭、杂烩粥、味噌汤、汤、肉糜沙司(meat sauce)、意大利面、腌菜、果酱等)；调味料类(色拉调料、拌饭调味料(日文：ふりかけ)、鲜味调味料、汤料等)。

[0091] 作为化妆品原料，可以为固态、液态、糊状等任意形状。化妆品可以是药用化妆品(即，准医药品)。化妆品中包括能够适用于动物(尤其是人)的皮肤、粘膜、体毛、头发、头皮、指甲、牙齿、面部皮肤、嘴唇等部位的所有化妆品。

[0092] 化妆品的剂型例如可以是可溶类、乳化类、粉末类、油液类、啫喱类、软膏类、气雾剂类、水‑油双层类、水‑油‑粉末三层类等。作为化妆品，例如可以为洁面用品、化妆水、乳液、乳霜、啫喱、精华液、美容液、涂抹式面膜、片状面膜、喷雾、防紫外线化妆品等基础化妆品；粉底、口红、腮红、眼影、眼线液(笔)、睫毛膏等彩妆化妆品；洁面用品、按摩剂、清洁剂、须后水、须前水、剃须霜、沐浴液、香皂、洗发水、护发素、发膜、整发用品、毛发生长剂、护发喷雾、染发泡沫、整发液、发胶、定型喷雾、生发剂、止汗剂、浴盐、漱口水、口腔化妆品、牙膏、护手霜、洗手液等。

[0093] 〔源自间充质干细胞的外泌体的制造方法〕

[0094] 本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的制造方法包括在包含蜂王浆的培养基中培养间充质干细胞的步骤。

[0095] 培养间充质干细胞的培养基只要是适于间充质干细胞的培养的培养基就没有特别限定，例如可举出HDF培养基(Lonza公司)等。另外，也可以根据需要添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等成分。就间充质干细胞的培养而言，只要为通常的培养条件即可，例如为30～37℃(尤其是37℃)、3～5％CO2(尤其是5％CO2)即可。

[0096] 培养基中所含的蜂王浆的量只要是能在间充质干细胞中促进外泌体分泌的有效量就没有特别限定，相对于培养基总量，按干燥固态成分换算计例如为50～5000μg/mL，可以为50～1000μg/mL，可以为50～500μg/mL，也可以为100～300μg/mL。培养时间只要分泌所期望量的外泌体即可，例如可以为1～10天或1～5天。可以根据需要更换培养基。

[0097] 本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的制造方法可以还包括采集所分泌的外泌体的步骤。由于上述培养步骤后，外泌体被分泌至培养基中(培养上清液)中，因此可以通过离心分离或过滤来回收培养上清液，由此回收源自间充质干细胞的外泌体。也可以进一步将上清中的不需要的成分除去，将外泌体纯化。就纯化而言，可以通过高速离心将培养上清液中的细胞片除去，进一步将所得到的上清液置于超速离心机(例如，100,000rpm、60分钟)，以沉淀的形式回收外泌体。对于所回收的外泌体，也可以通过尺寸排阻柱等以调节粒子尺寸。

[0098] 通过本实施方式涉及的制造方法得到的外泌体具有30～500nm的粒径，外泌体中包含核酸(mRNA、microRNA)、蛋白质等成分。其中，尤其是总microRNA中的miRNA‑205‑5p的含量与不存在蜂王浆的情况相比，增加10％以上即可，优选的是，增加优选20％以上、30％以上、50％以上、70％以上、100％以上、150％以上、或200％以上。通过本制造方法得到的源自间充质干细胞的外泌体具有后述的皮肤护理作用、成纤维细胞的激活作用。

[0099] 〔源自间充质干细胞的外泌体及包含其的组合物〕

[0100] 本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体是通过上述源自间充质干细胞的外泌体的制造方法得到的外泌体，可以是包含源自间充质干细胞的外泌体的培养上清液，也可以是经纯化的源自间充质干细胞的外泌体。本发明的一个实施方式还提供包含本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的组合物。该组合物可以是经口组合物，也可以是局部用组合物。

[0101] 包含本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的培养上清液例如包含5.00×1067
个粒子/mL以上的源自间充质干细胞的外泌体，也可以包含2.00×10个粒子/mL以上、5.00
7 8
×10个粒子/mL以上、2.00×10个粒子/mL以上的源自间充质干细胞的外泌体。

[0102] 本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体具有激活成纤维细胞的作用。具体而言，具有促进成纤维细胞增殖的作用、促进创伤治愈的作用、促进向创伤部位迁移的作用、及/或促进胶原蛋白产生的作用。因此，包含源自间充质干细胞的外泌体的组合物可以用作皮肤护理用组合物。皮肤护理可以包括抑制皱纹、预防皮肤变薄、延缓皮肤老化、促进皮肤再生等。

[0103] 包含本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的组合物可以为化妆品原料、化妆品、食品组合物或医药组合物，除了其有效成分为源自间充质干细胞的外泌体这一点以外，可以为与包含上述外泌体分泌促进剂的组合物同样的形态·剂型及施予途径，另外可以包含同样的有效成分之外的成分。进一步地，包含本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的组合物可以为局部用组合物，局部用组合物可以为化妆品组合物或医药组合物。局部组合物可以为经皮医药组合物(皮肤外用制剂)，可以为例如涂敷剂(例如软膏、乳霜制剂、外用液体制剂)、贴剂等。局部组合物为化妆品的情况下，可以为上述的化妆水、乳液、乳霜、啫喱、精华液、美容液等。

[0104] 包含本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的组合物只要包含源自间充质干细胞的外泌体作为有效成分即可。上述组合物的有效量能够根据组合物的形态及适用方法·适用量的不同而有所不同，对体重60kg的成人而言，每一天只要为10～30000mg即可，优选为100～20000mg、150mg～15000mg、600mg～12000mg、1200mg～10000mg、或2400～8000mg。该容量可以根据进行摄取的人的健康状态、施予方法及与其他制剂的联用等因素在上述范围内适当设定。只要每一天的有效施予量在上述范围内，则包含本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的组合物可以一天施予一次，也可以一天二次、一天三次等分多次施予。包含本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的组合物在施予后能立刻获得效果，而1～4周或1个月以上、6个月以上、1年以上的持续施予能使效果更持久，故而优选。

[0105] 非经口施予包含本实施方式的源自间充质干细胞的外泌体的组合物的情况下的施予量能够根据适用的部位及适用范围的不同而有所不同，例如针对皮肤的适用量按干燥固态成分换算计只要为0.01～50mg即可，可以为0.02～40mg、0.02～35mg、或0.025～30mg。

[0106] 〔蜂王浆的用途〕

[0107] 一个实施方式的蜂王浆的用途为蜂王浆在用于促进间充质干细胞的外泌体分泌的外泌体分泌促进剂的制造中的用途。此处，上述间充质干细胞可以为源自脂肪的干细胞，另外，优选上述外泌体分泌促进剂提高间充质干细胞及/或由间充质干细胞分泌的外泌体中的miRNA‑205‑5p的含量。

[0108] 另一方式的实施方式的蜂王浆的用途为蜂王浆在用于促进间充质干细胞的外泌体分泌的化妆品原料、化妆品、食品组合物或医药组合物的制造中的用途。

[0109] 另一实施方式的蜂王浆的用途为蜂王浆在体外的基于间充质干细胞的外泌体分泌的分泌促进中的用途。

[0110] 以下，基于实施例更具体地对本发明进行说明。但是，本发明并不限于以下的实施例。

[0111] 实施例

[0112] (实验例1对基于各种蜂王浆处理的外泌体分泌的影响的评价)

[0113] [外泌体的粒径及粒子浓度的评价]

[0114] 作为源自脂肪的干细胞(Adipose Derived Stem Cell，以下有时简称为“ADSC”)，5
使用从Lonza公司购买的细胞。将调节为1×10个细胞/mL的ADSC接种于T75培养瓶，在ADSC培养基(Lonza、MSCBM(注册商标)基础培养基)中、以37℃、5％CO2预培养48小时。48小时后，向培养基中以成为100μg/mL的方式添加冷冻干燥蜂王浆(FDRJ，山田养蜂场株式会社，将蜂王浆冷冻干燥并粉末化而成)或酶处理蜂王浆(EzRJ、山田养蜂场株式会社，将酶解蜂王浆粉末化而成)，培养5天。培养5天后，回收培养基，更换为新配制的相同培养基进一步培养5天。培养后，回收培养基，与最初的培养5天后的回收培养基合并。

[0115] 为了将上述回收培养基中的死细胞片等除去，将其供于15,000rpm、30分钟、4℃的离心分离。离心分离后，回收上清液，进一步供于100,000rpm、60分钟、4℃的超离心分离，使来源于源自脂肪的干细胞的外泌体(ADSC外泌体)沉淀。使沉淀物悬浮于冷磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)后，用尺寸排阻柱qEV70nm(MEIWAFOSIS)进行处理，得到ADSC外泌体。经FDRJ或EzRJ处理过的来源于ADSC的外泌体称为FDRJ‑ADSC外泌体或EzRJ‑ADSC外泌体，未经蜂王浆处理的(对照)的来源于ADSC的外泌体称为无处理的ADSC外泌体或简称为ADSC外泌体。各个外泌体的粒径及粒子浓度通过用Nanosight LM14C观察布朗运动并进行录像而得的视频、使用纳米颗粒跟踪分析技术软件(Nanoparticle tracking analysis(NTA、Version 2.3))而算出。将其结果示于图1。

[0116] 根据图1，无处理的ADSC外泌体的粒径的最大值(peak)为59nm，平均粒径为93±41nm。FDRJ‑ADSC外泌体的粒径的最大值为58nm，平均粒径为71±41nm。另外，EzRJ‑ADSC外泌体的粒径的最大值为62nm，平均粒径为105±71nm。任意外泌体均具有相同程度的粒径。
另外，就每单位回收培养基的粒子浓度(外泌体浓度)而言，无处理的ADSC外泌体为4.05×
6 8 7
10个粒子/mL，FDRJ‑ADSC外泌体为2.01×10个粒子/mL，EzRJ‑ADSC外泌体为2.22×10 个粒子/mL(图1)。与无处理的ADSC外泌体的浓度相比，FDRJ‑ADSC外泌体的浓度增加至约50倍，EzRJ‑ADSC外泌体的浓度增加约5.5倍。

[0117] [ADSC的增殖率的评价]

[0118] 将调节为1×104个细胞/mL的ADSC以100μL/孔接种于96孔板，与上述同样地，预培养24小时。24小时后，将培养基切换成以100、200或300μg/mL包含冷冻蜂王浆(FRJ，山田养蜂场株式会社，生蜂王浆)、FDRJ或EzRJ的ADSC培养基(Lonza)，培养72小时。培养72小时后，将培养基切换成含10％WST‑1(Takara Bio)的ADSC培养基，培养2小时。进一步在该培养后，针对通过在线粒体的呼吸链中发挥功能的琥珀酸四唑盐还原酶由WST‑1转换而来的甲臜染料(Formazan dye)，使用酶标仪测定450nm及690nm处的吸光度，基于吸光度，算出将无处理的ADSC的增殖率设为1的情况下的ADSC的相对增殖率。将其结果示于图2。需要说明的是，图中的a、ab、b、c表示在不同标记间具有显著性差异。另外，a与ab、b与ab具有相同标记，因此表示没有显著性差异。

[0119] 由图2可知，经各种蜂王浆处理过的ADSC的增殖与无处理的ADSC相比显著升高。例如，通过100μg/mL的各种蜂王浆处理过的ADSC的相对增殖率分别为1.16(FRJ)、1.28(FDRJ)、及1.38(EzRJ)。

[0120] 根据上述两个评价的结果，可以认为就ADSC外泌体浓度而言，与无处理的情况相比，进行了FDRJ处理的情况增加至约50倍，进行了EzRJ处理的情况增加至约5.5倍，此外，若一并考察ADSC增殖率的结果，则FDRJ处理、EzRJ处理均不能仅以细胞数的增加来进行说明，可认为通过各种蜂王浆处理发生了来自ADSC的ADSC外泌体的分泌促进。

[0121] (实验例2各种ADSC外泌体对成纤维细胞的增殖的影响的评价)

[0122] 作为人正常皮肤成纤维细胞(normal human dermal fibroblasts；以下有时称为4
“NHDF”)，使用从Lonza公司购买的细胞。将配制成1×10个细胞/mL的NHDF以100μL/孔接种于96孔板，在NHDF培养基(Lonza、MSCBM(注册商标)基础培养基)中、以37℃、5％CO2培养24小时。24小时后，将培养基切换成以成为50、200、或400ng蛋白质/mL的方式添加有ADSC外泌体、FDRJ‑ADSC外泌体或EzRJ‑ADSC外泌体的NHDF培养基，将NHDF培养72小时。培养72小时后，将培养基转换成含10％WST‑1(Takara Bio)的NHDF培养基，培养2小时。进一步，该培养后，以与上述[ADSC的增殖率的评价]同样的方式测定吸光度，基于吸光度，算出将无处理的NHDF的细胞增殖率设为100％的情况下的NDHF的相对增殖率(％)。将结果示于图3。需要说明的是，图中的a、ab、b表示在不同标记间具有显著性差异。另外，a与ab、b与ab具有相同标记，因此表示没有显著性差异。

[0123] 由图3可知，在FDRJ‑ADSC外泌体处理或EzRJ‑ADSC外泌体处理中，在400ng蛋白质/mL的处理浓度下，NHDF的增殖率均显著增加。另外，50或200ng蛋白质/mL的处理浓度对NDHF的增殖率没有造成影响。在ADSC外泌体处理与各种蜂王浆处理ADSC外泌体处理之间未观察到NHDF的增殖率的显著差异。

[0124] (实验例3各种ADSC外泌体对成纤维细胞向创伤部位的迁移活性的影响的评价)[0125] 将调节为1×105个细胞/mL的NHDF以1mL/孔接种于12孔板，在NHDF培养基(Lonza)中、以37℃、5％CO2预培养24小时。24小时后，将培养基切换成以成为400或800ng蛋白质/mL的方式添加有与实验例2同样的各种ADSC外泌体的NHDF培养基，进一步将NHDF培养24小时。培养24小时后，切换成NHDF培养基，用1000μL枪头的前端在细胞层上划过从而制作直线的创伤部位。用NHDF培养基培养24小时后，利用相差显微镜拍摄向创伤部位迁移的NHDF细胞的数目，示于图4。另外，利用ImageJ对迁移的细胞数进行计数，算出将无处理的NHDF的迁移活性设为1的情况下的相对迁移活性。将结果示于图5。需要说明的是，图中的a、ab、c、bc、d、e表示在不同标记间具有显著性差异。另外，a与ab、c与bc具有相同标记，因此表示没有显著性差异。

[0126] 由图4及图5可知，与无处理相比，ADSC外泌体、FDRJ‑ADSC外泌体及EzRJ‑ADSC外泌体处理中，NHDF的迁移活性呈浓度依赖性地增加。FDRJ‑ADSC外泌体或EzRJ‑ADSC外泌体处理中，NHDF的相对迁移活性提高至ADSC外泌体处理的2倍左右。

[0127] (实验例4各种ADSC外泌体对成纤维细胞的产生胶原蛋白的能力的影响的评价)[0128] 将调节为1×105个细胞/mL的NHDF以1mL/孔接种于12孔板，在NHDF培养基(Lonza)中、以37℃、5％CO2预培养24小时。24小时后，向培养基中以成为200ng蛋白质/mL的方式添加与实验例2同样的各种ADSC外泌体，进一步培养72小时。培养72小时后，切换成NHDF培养基，培养72小时。培养72小时后，利用冷PBS洗涤细胞，使用胶原蛋白定量检测试剂盒(Collagen Quantitation Kit)对所生成的胶原蛋白含量进行定量。将其结果示于图6。需要说明的是，图中的a、b表示在不同标记间具有显著性差异。另外，相同标记间表示没有显著性差异。

[0129] 根据图6，ADSC外泌体处理中，与无处理相比，细胞内的胶原蛋白量没有变化。另一方面，FDRJ‑ADSC外泌体及EzRJ‑ADSC外泌体处理中，与无处理的细胞相比，细胞内的胶原蛋白含量上升至1.7倍左右。FDRJ‑ADSC外泌体处理与EzRJ‑ADSC外泌体处理之间，细胞内的胶原蛋白含量没有显著差异。

[0130] (实验例5各种ADSC外泌体对microRNA(miRNA)谱的影响的评价)

[0131] 使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从利用实验例1中记载的方法制备的各种蜂王浆处理ADSC及ADSC外泌体中提取总RNA。使用Bioanalyzer(Agilent Technologies)确认RNA试样没有发生降解。分别使用QIA‑seq miRNA Library Kit(Qiagen)、QIA‑seq miRNA NGS96Index IL(Qiagen)制备用于miRNA‑seq分析的文库。然后，直接供于下一代测序仪NovaSeq 6000(注册商标、Illumina)，对ADSC及ADSC外泌体的miRNA谱进行分析。需要说明的是，将检测到的miRNA中读段数的计数(count)值小于16的数据作为噪声数据删除，总共将94种miRNA作为分析对象。将ADSC及ADSC外泌体中的同时差异表达miRNA的含量示于表1。表1中的miRNA的含量由TPM(Transcripts per million，每百万转录本)表示。另外，将筛选出的同时差异表达miRNA的维恩图(Venn diagram)示于图7及图8。

[0132] 对无处理的ADSC与各种蜂王浆处理ADSC、及无处理的ADSC外泌体与各种蜂王浆处理ADSC外泌体进行比较，提取通过各种蜂王浆处理而发生变化的miRNA。其结果，与无处理的ADSC相比，经各种蜂王浆处理过的ADSC中hsa‑miR‑125b‑1‑3p、hsa‑miR‑222‑3p、hsa‑miR‑141‑3p、hsa‑miR‑21‑5p、has‑miR‑205‑5p共通地表达上调。另外，hsa‑miR‑423‑5p、hsa‑miR‑99b‑5p、hsa‑miR‑191‑5p、hsa‑miR‑342‑3p、hsa‑miR‑125a‑5p共通地表达降低(表1、图7(A))。另一方面，与无处理的ADSC外泌体相比，进行了各种蜂王浆处理的ADSC外泌体中hsa‑miR‑130a‑3p、hsa‑miR‑205‑5p共通地内涵量升高，hsa‑miR‑95‑3p、hsa‑miR‑25‑3p、hsa‑miR‑192‑5p、hsa‑miR‑126‑3p、hsa‑miR‑146‑5p、hsa‑miR‑122‑5p共通地内涵量降低(表1、图7(B))。另外，针对每一种蜂王浆处理提取ADSC及ADSC外泌体的发生变化的miRNA，结果ADSC与ADSC外泌体中共通地发生变化、且在各种蜂王浆处理间共通地变化的仅有表达上调的hsa‑miR‑205‑5p(表1、图8)。

[0133] [表1]

[0134]