[0001] 本发明涉及生物制品，具体涉及通过物理处理方式获得的动物/植物来源的粘性外泌体。

[0002] 外泌体是从活细胞中分泌、具有良好生物活性的脂质双层膜细胞外囊泡。提取外泌体所使用的细胞种类多样，如骨髓基质干细胞、胚胎干细胞、淋巴细胞、雪旺细胞、神经细胞、小胶质细胞、成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、纤毛细胞等来源于动物的细胞，以及用于加工中草药的药用植物或其他植物的细胞，从不同类型细胞的培养物中提取的外泌体可以应用于修复不同的受损器官和组织。

[0003] 提取的外泌体表面光滑、呈球状、体积微小，在生物支架、敷料以及药物载体，如微球等上的粘附率通常为2％～5％，并且其分布及粘附浓度难以控制。正是由于外泌体本身并不具备良好的粘附特性，故而影响了其在生物组织工程等领域中的应用。目前国内外尚没有改善外泌体粘附特性的研究报道。替代方案是在应用中引入其他成分，如胶原或者粘合剂、气溶胶、聚乙烯醇等增稠剂，并通过引入这些成分增加外泌体在功能材料上的粘附率，但不足在于改变了外泌体的释放环境，对外泌体充分发挥自身生物学功能产生不利影响。中国专利CN113018501A公开了将内皮祖细胞外泌体冻干粉，经与水/透明质酸钠混合而制得的喷剂型外泌体敷料，但外泌体在喷涂对象表面的粘附效果并未评估。

[0029] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

[0030] (一)外泌体的制备

[0031] 1.1普通外泌体分离和鉴定

[0032] 可选择使用差速离心法、密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法、过滤法、聚合物沉淀技术、免疫分离技术、筛分分离技术等手段提取动物或植物中的外泌体。也可以通过商业途径购买动物或植物来源的外泌体。

[0033] 以骨髓间充质干细胞(MSCs)为例，可以采用以下流程提取外泌体：

[0034] 1)收集细胞在对数生长期的培养基或组织液，放入无菌烧杯中；

[0035] 2)将无菌烧杯中的液体放入冷冻离心管，先于4℃、1000×g离心30min，取上清液于4℃、2000×g再离心10min，取上清液于4℃、10000×g再离心30min，取上清液(通过此步骤，清除液体中的死细胞、聚集体和较大囊泡等杂质)；

[0036] 3)将上一步最终获得的液体，采用0.22μm的滤器进行过滤，收集滤液(通过此步骤，获得外泌体的富集液)；

[0037] 4)将富集液继续于4℃、100000×g离心12h后，弃去上清液，取沉淀用去离子水进行重悬，重悬液一部分用于鉴定，剩余部分保存于‑80℃冰箱。

[0038] 对于以上步骤1，若生物材料的来源为植物(例如生产西洋参等中药草的植物)，则首先对新鲜植物(具体为植物的根、茎等部分)进行充分清洗后去皮，然后置于破壁机中进行处理，获得粗提溶液。之后将粗提溶液放入预冷4℃离心机中1000×g离心30min，取上清液，过2000目筛，将过滤后的液体放入无菌烧杯中。

[0039] 采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)或FCM检测重悬液中外泌体CD63、CD81、CD9、CD13等抗原表达；外泌体数量和大小采用纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测(Nanosight LM10；Malvern)，检测中采用聚苯乙烯乳胶微球(NTA4088,100nm)标准化；同时使用电镜观察其中的外泌体的形态及大小。实验结果表明：重悬液中观察到是与外泌体相符的呈分散分布的囊泡状颗粒(参见图11
1a)，其CD63和CD81表达率≥95％，CD9和CD13表达率≤2％；并且数量≥10×10 /mL(一般为
11
10～15×10 /mL)，直径为50～150nm，符合外泌体要求，冷冻干燥(‑20℃)后作为后续对比实验中的普通外泌体样品，备用。

[0040] 1.2普通外泌体的浓缩提纯

[0041] 将经过分离并鉴定后的外泌体移入冷冻离心管中，在低温条件(0～4℃)下进一步高速离心(120000×g～200000×g、1～8小时)，使用移液器去除离心管中上方液体，收集留在下方的沉淀部分，备用。

[0042] 1.3普通外泌体的梯度降温‑回温后处理程序

[0043] 根据实验发现，该后处理程序利用外泌体双层磷脂膜经热胀冷缩而发生胀大、破裂的原理，具体通过在真空抽吸条件下先台阶式降温(可低至‑80℃或‑196℃)后台阶式升温，导致外泌体双层磷脂膜胀破后外泌体自身成分溶出(提取自MSCs的外泌体，其双层磷脂膜内所包裹的成分包括蛋白质、microRNA、mRNA等)，最终这些溶出成分与未发生胀大和/或未胀破的外泌体(可能有两种原因导致外泌体没有胀破：其一，不同外泌体颗粒大小不一样，大的较容易胀破，小的较不容易胀破；其二，随着浓缩提纯的完成，不同外泌体聚集形成半固体，位于其表面的外泌体受压力变化影响大，容易胀破，而里面的外泌体在溶剂的缓冲下，不容易胀破)就会形成具有粘附特性的外泌体，称为粘性外泌体。

[0044] 所述后处理程序开始前，将浓缩提纯的外泌体放入培养皿(或其他容器)中，然后置于‑80℃～‑20℃的(例如‑20℃)冰箱中预冷冻1～12h(例如12h)。将培养皿(内置预冷冻后的普通外泌体)放入冷冻干燥机中，按照以下程序设定自动对预冷冻后的外泌体进行梯度降温后回温：

[0045] 第一梯度：以5.0～20.0℃/h(例如20.0℃/h)的速率从4℃或室温(25℃)降到‑20℃，真空泵抽吸速率为10.0～20.0L/min(例如10L/min)，真空度为8.0～10.0Pa(例如8Pa)，在‑20℃维持2.0～6.0h(例如3.0h)；

[0046] 第二梯度：以5.0～20.0℃/h(例如15.0℃/h)的速率从‑20℃降到‑35℃，真空泵抽吸速率为20.0～40.0L/min(例如20L/min)，真空度为10.0～12.0Pa(例如10pa)，在‑35℃维持6.0～8.0h(例如6.0h)；

[0047] 第三梯度：以5.0～20.0℃/h(例如15.0℃/h)的速率从‑35℃降到‑65℃，真空泵抽吸速率为50.0～60.0L/min(例如50L/min)，真空度为12.0～15.0Pa(例如15pa)，在‑65℃维持12.0～24.0h(例如12.0h)；

[0048] 第四梯度：以5.0～20.0℃/h(例如15.0℃/h)的速率从‑65℃升到‑30℃，真空泵抽吸速率为50.0～60.0L/min(例如50L/min)，真空度为10.0～15.0Pa(例如15pa)，在‑30℃维持6.0～8.0h(例如6.0h)；

[0049] 第五梯度：以5.0～10.0℃/h(例如10.0℃/h)的速率从‑30℃升到‑20℃，真空泵抽吸速率为50.0～60.0L/min(例如50L/min)，真空度为10.0～15.0Pa(例如15pa)，在‑20℃维持2.0～4.0h(例如2.0h)；

[0050] 第六梯度：以5.0～20.0℃/h(例如10.0℃/h)的速率从‑20℃升到4℃或室温，真空泵抽吸速率为10.0～20.0L/min(例如10L/min)，真空度为5.0～10.0Pa(例如10pa)，在4℃或室温维持1.0～2.0h(例如2.0h)。

[0051] 以上程序在完成第六梯度后结束(即冷冻干燥机关闭)，若第六梯度程序设定为4℃，则停留至恢复室温后取出粉状物，若第六梯度程序设定为室温，则可以直接取出粉状物；该粉状物即粘性外泌体，使用密封袋封装留样，放置于干燥器并于‑80℃冰箱中保存。

[0052] 参见图2，该图显示粘性外泌体含有一部分直径在100nm左右的球状结构，符合外泌体的特征，并且不同大小的球状结构互相粘合附着、融合为一体，与普通外泌体的形貌存在较大差异(参见图1b，该图显示普通外泌体经过冻干后，球状结构间轮廓边界明显且大小均匀)。

[0053] (二)粘性外泌体的特性表征

[0054] 2.1粘性外泌体的复溶

[0055] 以间充质干细胞外泌体(MSC‑Exos)为例，使用去离子水作为溶剂(无外界杂质引入)，配制成0.2μg/L溶液。实验中具体设置普通外泌体复溶组(取1.1节所得普通外泌体样品作为溶质)和粘性外泌体复溶组(取1.3节保存的粘性外泌体样品作为溶质)，分别考察所配制溶液的粘性。

[0056] 检测结果显示，粘性外泌体复溶组的动力粘度为5.04±0.23mPa·s，普通外泌体复溶组的动力粘度为1.79±0.16mPa·s，两组外泌体复溶后动力粘度具有统计学差异(P<0.001)，粘性外泌体复溶组的粘度明显大于普通外泌体复溶组(图3)，结合到所使用的后处理程序为单纯的物理过程，从而可以推知，利用普通外泌体制备粘性外泌体的过程中，并没有改变外泌体本身的成分构成属性，粘性外泌体复溶后粘性的增加与这一过程中部分外泌体胀破并释放自身成分有关，即这些成分附着在后处理程序中保留下来的那些结构完整的外泌体上。

[0057] 2.2粘性外泌体与普通外泌体粘附率的比较

[0058] 使用2.1中配制的普通外泌体溶液和粘性外泌体溶液。采用喷涂的方法(喷涂溶液后自然晾干或冻干)，对粘性外泌体和普通外泌体在材料(例如3D打印人工支架，打印材料为贝塔磷酸三钙/羟基磷灰石，比例为7:3)表面的粘附率进行比较，并通过电镜观察两组外泌体的结构。其中，粘附率是在图像软件中将电镜照片上显示的附着有外泌体的区域手工圈选，并按照粘附及未粘附外泌体分别着色后，由软件自动计算得出的面积之比，即用粘附面积除以整体圈选面积，实验中进行了多组平行。

[0059] 在不同支架样品表面喷涂完粘性外泌体、普通外泌体后，分别使用电镜观察支架表面，并比较两组之间在外观及特性方面的差异。参见图4及图5，图4显示普通外泌体在支架表面没有互相粘连和聚集，分布稀疏松散；图5显示粘性外泌体所具有的直径在100nm左右的球状结构粘附在支架表面，这些符合外泌体特征的球状结构没有破裂，也没有发生形变，具有较高的粘性，并呈聚集状。

[0060] 通过观察发现，在粘附于支架表面状态下，普通外泌体同样呈分散分布，即分散在支架表面区域，而粘性外泌体则聚集成团且分布密实，分布密度远大于普通外泌体，两者之间存在较大的差异，可见粘性外泌体在材料表面具有良好粘附作用，明显优于普通外泌体。

[0061] 参见图6，两组外泌体粘附率的比较如下：粘性外泌体的粘附率为92.21±4.49％，普通外泌体的粘附率为4.73±1.31％。两组粘附率具有统计学差异(P<0.001)，粘性外泌体的粘附率约为普通外泌体的19倍。实验结果表明，粘性外泌体具有非常高的粘附效率。体现出自身就具有良好的粘附特性，解决了目前外泌体无法在材料上良好粘附的问题。

[0062] 以上结果提示，根据外泌体不同的使用目的和不同的器官、组织的作用方式及用药途径，可以将粘性外泌体配制成一定浓度的工作液，从而将外泌体通过粘附修饰在目标器官、组织表面，发挥外泌体相应功能活性的作用。

[0063] (三)粘性外泌体的应用优势

[0064] 1.粘性外泌体具有普通外泌体无法比拟的粘附特性。普通外泌体的粘附率为2％～5％，而粘性外泌体的粘附率为85％～95％，是普通外泌体粘附率的15～20倍。

[0065] 2.粘性外泌体在增加了粘附性的同时，其并不含外源成分，对外泌体的成分具有极高的保真度，对外泌体的自身作用的发挥不会产生不利影响。

[0066] 3.粘性外泌体的制备基于梯度降温‑回温法，不仅极大提高了外泌体的粘附特性，而且在制备粘性外泌体过程中，可采用程序控制，自动控制其降温、升温的时间、温度及真空泵的抽吸速率，有利于自动化生产和大规模量产粘性外泌体。

[0067] 4.粘性外泌体与其他材料的融合方式简单、高效，促进了外泌体的广泛应用。复溶过程对外泌体的种类(提取来源不同)具有普适性，还可以控制外泌体的工作浓度、作用时间、作用方式。对功能修饰而言，可以使用喷涂、涂抹、液滴等不同方式，将外泌体修饰在原本无法良好粘附的器官、组织、生物支架、敷料、组织工程材料等材料的表面，从而发挥外泌体的作用。对于不同吸收途径的药物、化妆品的制剂而言，通过拌合等温和的方式，即可完成外泌体与其他制剂材料的掺混，从而发挥外泌体的作用。