本发明涉及帕克醇合成相关蛋白及其编码基因与应用。 背景技术
甾醇和皂苷类化合物具有重要的生理活性和生物学功能。甾醇是以环戊烷全氢 菲为骨架（又称甾核）的一种物质，可分为动物性甾醇、植物性甾醇和菌性甾醇。
动物性甾醇以胆固醇为主。植物性甾醇主要包括谷甾醇（Sitosterol)、豆甾醇 (Stigmasterol)和菜油甾醇（Campestanol)等。菌类甾醇主要包括麦角甾醇。 植物甾醇能够抑制人体对胆固醇的吸收、促进胆固醇的降解代谢、抑制胆固醇的生 化合成，具有抑制心血管疾病、抗癌、抗肿瘤、消炎、提高免疫、调节生长、抗病 毒等作用，此外，植物甾醇还具有良好的抗氧化性，可用作食品抗氧化剂。--谷 甾醇（"-Sitosterol)是细胞膜的重要组成部分，对于维持细胞膜的结构和功能 具有重要的作用。油菜素内酯(brassinolide)被称为第六大类植物激素，在植物生 长发育的调控中发挥重要的作用。皂苷是螺甾垸及其生源相似的甾族化合物的 低聚糖苷或三萜类化合物的低聚糖苷，广泛存在于单子叶和双子叶植物中。三 萜皂苷类代谢物在农业科学和医学等领域具有广阔的应用前景。齐墩果酸具有降低 转氨酶的功能，临床用于治疗急性黄疸肝炎；燕麦在根尖合成的燕麦苷（avenacins) 具有广谱的抗菌功能，能防止多种病原菌侵染根部，发挥抗病作用(Haralampidis et al., 98:13431-13436);人参根部合成的人参皂苷类化合物是重要中药的有效成分 (Shukla et al., Phytochemistry， 29: 239-241)。桦木酸具有抗肿瘤、抗艾滋病 病毒、抗炎和体外抗疟病等多种生物活性。
目前，对植物甾醇和三萜类皂苷的生物合成途径己有初步认识。异戊二烯途径 是获得这些代谢产物的必由途径，其生物合成路线为：甲羟戊酸(Mevalonic acid) 生成的异戊烯二磷酸（IPP)及其异构体二甲基丙烯二磷酸（DAPP)在香草二磷酸合 成酶(GPS)作用下首先形成香叶二磷酸(GPP)，接着利用法呢二磷酸合成酶(FPS)转 化成法呢二磷酸(FPP)，又在鲨烯合成酶(Squalene synthase, SQS)的作用下合成 鲨烯，然后经鲨烯环氧酶(Squalene印oxidase， SQE)催化转变为2， 3-氧化鲨烯(2， 3-oxidosqualene)，最后2， 3-氧化鲨烯经过2， 3-氧化鲨烯环化酶(0SCs)的环化作用得到植物甾醇和三萜类骨架。三萜类骨架依赖细胞色素P450单加氧酶、糖基转移 酶和酰基转移酶进行氧化、糖基化及酰基化等化学修饰，最终获得不同种类的三砲 类皂苷产物。
2， 3-氧化鲨烯在氧化鲨烯环化酶(0SCs)的作用下环化形成甾醇和三蔽类产物 各自的前体物质，如环阿屯醇(Cycloartenol)、 P -香树素（0 -Amyrin)等。目前 已经从不同植物中分离得到了约10种编码0SCs酶的基因，包括羽扇醇合成酶 (Lupeol synthas， LUP) 、 0 -香树素合成酶（P -Amyrin synthase, P -AS)、葫卢 二烯醇合成酶（cucurbitadienol， CPQ) 、 thalianol synthase (THA) 、 marneral synthase(MRN)、 camelliol synthase(CAMS)、 baruol synthase (BARS)、 isomultiflorenol synthase (IMS)、羊毛甾醇合成酶(lanosterol synthase, LAS) 和环阿屯醇合成酶（Cycloartenol synt|rase， CAS) (Philips et al. ， Current opinion in plant biology, 9:1-10)，其中前8种酶可能是合成各类三砲类产物的
前体，第io种酶是甾醇的前体。e-香树素合成酶参与起始多数皂苷类物质的合成
(^-amyrin synthases)，然后通过加氧、糖基化、酰基化等一系列反应产生三 萜皂苷（Qi et al. ,PNAS， 101:8233-8238)。羽扇豆醇合酶（lupeol synthases)参 与了稗木酸（Betulinic acid)的合成（Hayashi et al. ， Bio. Pharm. Bull, 27:1086-1092)。
羊毛甾醇，帕克醇和环阿屯醇是真核生物甾醇合成的三种中间产物。多数原核 生物不合成甾醇类物质，但个别真细菌能通过羊毛甾醇和帕克醇途径合成甾醇，如 浮霉菌（planctomycete)。除了环阿屯醇和羊毛甾醇以外，棕鞭藻（Ochromonas Malhamensis)还利用帕克醇（parkeol)生成多空甾醇（poriferasterol)和穿贝 海绵甾醇（clio謹terol) (Palmer M. A. et al. ， phytochemistry， 17:1577-1580)， 表明氧化鲨烯环化酶（0SC)基因具有催化生成多种甾醇前体（包括帕克醇）的功 能。动物和真菌通过羊毛甾醇途径合成胆固醇（cholesterol)和麦角固醇
(ergosterol)。高等植物是通过环阿屯醇合成甾醇，同时保留了合成羊毛甾醇和 帕克醇的能力。在高等植物中，环阿屯醇合成酶（cycloartenol sythases)参与 植物甾醇（phytosterol)的合成（Corey et al. ， PNAS, 90:11628-11632)。在高 等植物中也存在羊毛甾醇和帕克醇，最近在双子叶植物中克隆到了编码羊毛甾醇合 酶（lanosterol synthases)的基因（Kolesnikova et al. ， ABB， 447:87-95; Suzuki et al.， Plant cell physiol. 47:565-571)，但到目前为止还没有从任何植物中克隆得到的编码帕克醇合成酶的基因。 发明内容
本发明的目的是提供帕克醇合成相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供的帕克醇合成相关蛋白，名称为0s0SC9，来源于粳稻品种中花ll号 (&yza厶 5/?p. japonica)， 是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b) 将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且与帕克醇合成相关的由序列2衍生的蛋白质。
上述取代和/或缺失和/或添加具体可为1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加。
序列表中的序列2由759个氨基酸残基组成。
为了使（a)中的0s0SC9便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸 序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。
表l标签的序列
table see original document page 5

上述（b)中的0s0SC9可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。上述（b)中的0s0SC9的编码基因可通过将序列表中序列1自5'端第1至 2280位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一 个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编 码序列得到。
所述蛋白的编码基因^仍)W也属于本发明的保护范围。 所述蛋白的编码基因可为如下l)或2)或3)的DNA分子：
1) 其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3) 与l)或2)限定的DNA序列具有9(^以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
所述严格条件为在O. 1XSSPE (或0. 1XSSC)、 0.1% SDS的溶液中，65。C条件下杂交并洗膜。
序列表中的序列1由2280个碱基组成，序列2中自5，端第1至2280位核苷酸编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。
本发明还保护用于扩增所述基因（fefl5Z^)或所述基因（&0沉》）中的任一DNA片段的引物对。
含有所述基因（&0沉》）的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有^096^基因的重组表达载体。
使用所述基因（&必C50构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子；此外，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可在细胞中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化细胞。
所述表达载体具体可为酵母表达载体，如毕赤酵母（pic力&)表达载体或酿酒酵母（Saccharomyces) YES载体库中的载体。所述酵母表达载体还可以包括：1)用于蛋白分泌表达的a因子、pho; 2)用于产生融合蛋白的C末端和/或N末端的6个HIS标签；3)用于制备抗体的c-myc表位；4)用于转化子筛选的Zeocin、層P、杀稻瘟菌素抗性标记；5) URA3报告基因；6)用于诱导表达的A0X1、 GAP、 AUG1、GAL1、 TEF1等诱导型启动子。
所述重组表达载体具体可为图2所示的pPICZ-0SC9。
所述转基因细胞系可通过将所述基因（&flSTP)导入细胞得到，具体可将所述重组表达载体导入细胞得到，如将图2所示的pPICZ-0SC9导入酵母细胞得到。所述酵母具体可为毕赤酵母或酿酒酵母。
携带&05〗"基因的酵母表达载体可以通过任何常规分子生物学方法（如电击法、热击法）导入酵母细胞，获得转化的单克隆酵母细胞系。
本发明还保护一种生产帕克醇的方法，是培养所述转基因细胞，得到帕克醇。
本发明提供的帕克醇合成相关蛋白及其编码基因可应用于培育高产和抗病水稻品种，并同时减少农药用量和保护生态环境。本发明通过将所述帕克醇合成相关蛋白的编码基因导入酵母细胞，得到了所述基因的酵母转化细胞，培养该细胞即可得到帕克醇。本发明具有重要的应用价值和深远的意义。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。附图说明
图1为^G5Z"基因扩增产物的电泳图。图2为pPICZ-0SC9的物理图谱。图3为^flSt^酵母转化细胞发酵产物的鉴定。图4为发酵^flS6^酵母转化细胞生产的帕克醇的色谱图。图5为发酵^flST9酵母转化细胞生产的帕克醇的MS分析图。图6为发酵0^^<"酵母转化细胞生产的帕克醇的结构图。具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例l、 flsfl5)"基因的获得
根据来源于燕麦的氧化鲨烯环化酶（0SC)基因序列AsC57 (GenBank AccessionNumber: AJ311790)和A?MS (GenBank Accession Number: AJ311789)在NCBI数据库中进行blastn检索，在水稻基因组中发现12个同源性较高的全长cDNA序列，根据其中一个基因（ttsflS^P)的核苷酸序列设计以下引物：
5，端引物：5' -ATGTGGAGGCTGAAGGTGTCG-3';
3，端引物：5' -CTATATGTTGCCTGCAAGCAGT-3'。
以粳稻品种中花ll号（0ryza sativa L. s卯.japonica)幼苗总RNA为模板，用上述引物对进行RT-PCR扩增，具体步骤如下：1、总RNA的提取
用Trizol法(所用试剂购自Invitrogen公司）提取2周幼苗的总RNA，具体方法为：收集100mg水稻材料，立即置于液氮中研磨，加入lmL Trizol试剂，充分混匀后，室温放置5分钟；加入0.2mL氯仿，剧烈振摇15秒，室温温育3分钟；4°C， 12000g离心15分钟；将上清液转移到一个新的1. 5mL离心管中，加入0. 5raL异丙醇沉淀RNA;最后将RNA沉淀用lmL 75%乙醇洗涤后溶于适量经DEPC处理过的双蒸水中，-70'C保存备用。
2、 cDNA的合成
应用Superscript II RT试剂盒（Invitrogen)并按试剂盒说明书进行操作：取1-5 u g步骤1获得的水稻总RNA放入灭活了 RNase的PCR管中，加入1 u LOligo(dT) 12-18(500mg/mL)和1 u L dNTP混合物（各lOmM)，用DEPC处理后的双蒸水补充至12uL，混匀后在65。C下加热5分钟，然后迅速置于冰上，l分钟。短暂离心后再加入4 u L 5 X第一链合成缓冲液、2 n L 0. 1M DTT禾B1 u LRNaseOut (40U/ ix L)，轻轻混匀后，42。C温育2分钟，然后加入1 U L Superscript II反转录酶（200U/uL)，混匀，42"C温育50分钟，7(TC加热15分钟使酶失活，得到第一链cDNA。
3、 基因克隆
取l!iL步骤2获得的反转录产物为模板，在5'端引物和3'端引物的引导下，进行PCR。
PCR反应体系为：0. 5 n L proof start (Qiagen公司）、5 u L 10 X缓冲液（Qiagen公司）、luLdNTP、 lyL5，端引物（10ixM/L)、 luL3，端引物（10uM/L)、 luL模板、加双蒸水补充反应体系至50 u L。
PCR反应条件为：先95°。 5分钟；再94。C 45秒，60°C 45秒，72°C 5分钟，共35个循环；最后72'C 10分钟。
反应结束后，对PCR产物进行0.8X琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图l所示。图1中，M: DNA标准分子量X DNAA5boA7V历/3o7i7; 1: RT-PCR产物。结果表明，得到了分子量约为2.2kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天为时代公司）回收该片段，然后将该回收片段与pGEM-TEasy (Promega)进行连接。连接体系为：luLT4DNA连接酶（3u/uL)、 5uL2X连接酶缓冲液、0. 5 " LpGEM-TEasy(50ng/uL)和3. 5uLPCR回收产物。连接反应条件为：4。C反应12-24小时。参照Cohen等的方法（Proc Natl Acad Sci， 69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，根据pGEM-TEasy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定。测序结果表明扩增到的序列由2280个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列1的自5'末端第1-2280位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。将序列1所示的DNA序列命名为Os必t^将序列2所示的氨基酸序列命名为0s0SC9，将在pGEM-TEasy中插入序列1所示的核苷酸序列得到的重组载体命名为pTE-^仍Z^。
将^G5r^和0s0SC9与As力AS" (GenBank Accession Number: AJ311789)进行同源性比较，核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为60. 28%和51. 77%。
实施例2、 ^flSr^酵母转化细胞系的获得及其鉴定
一、 酵母表达载体pPICZ-0SC9的构建
1) 用限制性内切酶M^ I分别将pTE-fe必t^和pPICZA载体（Invitrogen)完全酶切。酶切体系为：5ugpPICZA、 2.5uL 10X酶切缓冲液、1uLtV"I，加ddH20补充反应体系至50yL。酶切反应条件为：37r酶切l小时。
2) 用琼脂糖电泳对酶切产物进行分离，分别回收2. 2kb左右的包含fts仍tP的片段和3kb左右的pPICZA载体片段，分别溶解于20uL ddH20中。
3) 将步骤2)获得的两种片段进行连接反应。连接反应体系为：luL T4DNA连接酶、2uL10X连接酶缓冲液、3uL回收的包含6^05〗W基因的DNA片段、luLpPICZA载体片段。连接反应条件为：4"C连接12小时。
4) 将连接反应的产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有Zeocin的LB平板（Zeocin浓度为50ug/ml)进行筛选。
5) 将阳性克隆进行PCR鉴定，引物如下：
5' AOX引物:5' — GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3';tt^5t^基因特异反向引物：5' - TGGACCCTCCCCAAGCAAT-3'。结果表明，6^^5t^基因插入了 pPICZA，且方向正确，将该重组质粒命名为pPICZ-0SC9，其物理图谱如图2所示。
二、 te仍〗3酵母转化细胞系的获得及其鉴定
i、 Osasr^酵母转化细胞系的获得
应用电激仪(德国Eppendorf公司）并参照说明书进行操作。将质粒pPICZ-0SC9用电激法转化野生型酵母X-33 (Invitrogen)，用含有Zeocin的LB平板（Zeocin的浓度为400ug/ml)进行筛选。
用0s0SC9基因特异引物对(5' A0X引物和3' AOX引物)鉴定阳性转化细胞，具体步骤如下：选取一个阳性转化细胞，重悬于10U1水；加入5U15U/Ul溶壁
酶（Sigma)溶液，30。C温浴10min， -80。C冰冻10min。 PCR体系:5 u 1 10X buffer,5u 1 25mMMgCl2， 1 ix 125mM d證s， 1 u 1 10pmo1/u 1 5' AOX引物，lullOpmol/ul3' A0X引物，27ul蒸馏水，5ul上述细胞裂解液，混匀，加20ul石蜡油，置于PCR仪，95。C 5min;加入5 u 1 0. 16U/u 1 Taq (0. 8unit) 。 PCR程序:30次(95。C lmin; 54°C lmin; 72°C lmin) ; 72°C 7min。
0s0SC9基因特异引物对如下：
5' AOX引物：5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC—3';
3' AOX引物：5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'。
电泳结果表明，得到了 ^仍〗"酵母转化细胞。
将质粒pPICZA电激导入野生型酵母X-33，得到作为对照的转空载体细胞。实施例3、培养0^5〗W酵母转化细胞生产帕克醇
1、 0?仍V"酵母转化细胞的培养
在250ml培养瓶加入25ml的MGY培养基（1. 34%酵母氮源，1%甘油，0. 00004%生物素），接种单个tt^5f:9酵母转化细胞，28-30°C、 25(H300rpm振荡培养，直到达到对数生长期（OD600=2-6)，大约16-18小时。离心(1500-3000g、 5min)收集细胞，弃上清，用醒培养基（1.34%酵母氮源，0.00004%生物素，0. 5%甲醇）重悬到0D6。。=1. 0，大约100-200ml。把培养物转到1L的长颈培养瓶，用2层无菌纱布盖住培养72小时，每24小时添加一次100%的甲醇，使其甲醇的终浓度保持0.5%。试验设IOO个重复。
培养转空载体细胞，操作同上。
2、 帕克醇的鉴定1)初步鉴定
① 裂解和提取酵母转化细胞和转空载体细胞的培养物
培养72小时后，分别收集25ml &05〗3酵母转化细胞和转空载体细胞的培养物，室温下3000g离心2-3min。加入2ml含20%的KOH和50%乙醇的裂解液，95°C处理15min。加入2ml正己烷进行萃取，重复萃取一次，合并2次萃取产物，挥干后溶解于100lil的氯仿。
② 鉴定
取25-50ul步骤①得到的溶液，点到硅胶板上，在正己垸：乙醚的混合物（正己烷：乙醚=1: 1)中展开，在空气中干燥，用5ml染色液喷雾（4. 8ml冰乙酸，100 w 1浓硫酸，100ulp-anisaldehyde) ， 130。C烘烤显色。结果见图3，图3中，1:酵母转化细胞的培养物；2:转空载体细胞的培养物。
结果表明，在甲醇诱导表达以后，与转空载体细胞的酵母细胞相比，Os仍Z^酵母转化细胞多了一条带，说明OsOSC9能在酵母中产生其催化产物。
2) 进一步鉴定
① 裂解和提取酵母转化细胞和转空载体细胞的培养物同上述步骤l)中的①。
② 鉴定
将50 u 1步骤①得到的溶液，用氮气吹干后用50 u 1 BSTFA禾B 25 u 1 pyridine溶解，在80。C衍生化1小时，取4叱用于GC-MS (Agilent 6890 Gas Chromatograph)分析，毛细管柱为DB-5 (Hewlett-Packard HP5, 35 m length 3 0. 25 mm diameter3 0.25 mm thickness)。结果见图4。
结果表明，携带水稻^asr^的酵母细胞表达物比转化空载体的酵母细胞在
27. 6min多了一个色谱峰。
MS的检测器在70eV能量下，以30次/秒的速度扫描，扫描区间为30-700u。将MS峰的数据和已知的三萜化合物数据库比对，见图5。图5中，a为本实验获得OsOSC9产物的MS峰图，b为发表文献中parkeol的MS峰图
3) 分别将5-10升a?fl5t^酵母转化细胞培养产物，以上述步骤1)中相同的方法裂解、提取、硅胶板层析后，刮取OsOSC9对应的层析带，用5ml氯仿洗脱3次，收集上清，挥干后获得5mg产物，经^- 、 13C-NMR (600MHz)和MS分析，确定产物为帕克醇，结构见图6。
0s0SC9产物结构鉴定数据如下:EI-MSm/z: 498[M+Si (CH3)3]+， 466， 385， 311，295， 241， 213， 173， 129。力-NMR (CDC1" 600MHz) 5: 0.65， 0.75， 0.82， 0.88，0. 99， 1. 04， 1. 60， 1. 68 (各3H， 8XCH》，3. 20 (1H， dd， 7=4. 2， 12. 0Hz， 3 。-H)，5.09 (1H， m， H-24) ， 5.22 (1H， m， H-11) 。 13C-丽R (CDC13， 125MHz) S: 14.64(C-18) ， 15.65 (C-30) , 17.67 (C-26) ， 18.57 (C-21) ， 18.91 (C-28) ， 21.38(C-6) ， 22.26 (C-19) ， 25.04 (C-23) ， 25.73 (C-27) ， 27.83 (C-2) ， 28.09(C-7) ， 28.24 (C-16) ， 28.28 (C-29) ， 38.87 (C-15) ， 35.14 (C-12) ， 35.67(C—20) ， 36.12 (C—1) ， 37.28 (C—22) ， 39.11 (C—4) ， 39.39 (C—10) ， 41.82(C-8) ， 44.31 (C—13) ， 47.16 (C-14) ， 50.78 (C—17) ， 52.51 (C-5) ， 78.92 (C-3) ， 114.98 (C-11) ， 125.12 (C-24) ， 130.92 (C-25) ， 148.53 (C-9)。序列表
〈110〉中国科学院植物研究所
<120>帕克醇合成相关蛋白及其编码基因与应用
<130〉 CGG臓Y81566
<160〉 2
〈210〉 1
〈211〉 2280
〈212〉 DNA
<213〉稻属水稻(ftrz3 ss"ra L spp. japonica)
〈400〉 1
3tgtggaggc tg犯ggtgtc ggagggcggc a^gcccalggc tgcggtcggt aaacaatctc 60
ctcggccggc aagtgtgggs gttcgaccct gacctcggca cgccagagga gcgcgccgat 120
gtgg卿agg cgcgccgcga gttcgccgag caccgcttcg agcgcaagca ttctagcgac 180
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Ctgg3gCElt8 ttaatcctac agaggcattt gggcgtgtaa tgattgaata tccgtatgtc 1680
g肪tgt3C3t catcatcaat tcagtgtcta gcattattca aaaaacttca CCC2lgggC2lC 1740
cgcaaggaag aggtgg肌aa ttgtatcagc aaaggtgcta atttc3ttg3 gagttctcag 1800
卿agcg3tg gttcatggta tggttcUgg gggatttgtt tcacctatgc cacatggttt 1860
gcagtga_cag gattagtttc tgcaggcagg acacttggga atagcgctac 3gtt3g3gi3g 1920
gcatgtgact ttctcttgtc aaaacagctt ccttcgggtg gctggggcga gagctatttg 1980
tcatgtcatg 3Cg3ggttt3 cacaaatctt aaaggcaacc gacctcacgg tacgcacact 2040
gcgtgggcca tgattgcact aattgatgca gggc鄉ctg 3犯g3gatcc agtgcctctg 2100
catcgagcag ccaaggcttt gctcaacttg c朋tt3g3gg tcc3cagca3 2160
gaaattgttg gagtctttct ccaaactgcc atgatcagtt 3ttcccagta caggaacatc 2220
ttccctataa tggctctcac 3gggt3tCgC cgccgagtac tgcttgcagg 2280
〈210〉 2
<211〉 759
<212> PRT
<213〉稻属7jC稻(OiTzs satira L spp. japonica)
<400> 2Met Trp Arg Leu Lys Val Ser Glu Gly Gly Ser Pro 1 5 Val Asn Asn Leu Leu
Gly Thr Pro 35 His
Leu 20 Glu
Ala Glu 50
Met Gin Phe Ala Lys 65
Lys Arg
Gly Arg Gin Arg
Arg Phe Glu
Glu Arg Ala
Leu Lys His Trp
Gly Arg
Glu
His 85 lie
Glu
70
Glu
Ser
Ala 100
Gly Asp Tyr Ala
Pro 115
Thr iLeu His Val
lie lie 130
Glu His Gin Lys Glu 145
Asp Gly
Gly
Lys Trp
Met 150 Leu
Ser 135 Arg
His
Ser Ser Leu Asn 180
Gly Cys lie Glu
Gly Gly Asp 195
Ala Thr Phe Thr
Gly Gly 210
Leu Gly Val Phe Asp 225
Trp 230
Val 25 Val
Gly Ser Pro Trp 10
Trp Glu Phe Asp
Leu
Arg 15 Asp
Ser
Leu
Asp 40
Lys His Ser'Ser
Pro 30
Arg Glu Phe
Arg 55
Asn Cys Gin Lys
Glu Lys Ala Arg 45
Leu Leu Met Arg
Asp 60
Asp Leu Leu Ala
Asp Val Met Arg
Leu 75
Glu Ala Val Trp
Val
Gly 90
Asn Leu Gin Ala
Cys 105
Leu Met Phe Phe
Ser 95 Asp
Val
80
Ser
Gly
Gly 120
Gly Val Leu Asn
His 110
Pro Gly Leu
Leu 125
Val Leu Ser Ser
Arg lie
Gly 165
Tyr Val Ala Leu
Asn 200 Ser
Tyr
Glu
Arg 185 Gly
lie
Gly 170 Leu
Arg
Gly
Thr 140
Asn His Gin Asn
Tyr 155
His Ser Thr Met
Leu
Asn
Leu 175 Pro
Glu 160 Gly
Asn
Thr 215
Ser Gly Asn Asn
Trp Gly Lys
Pro 235
Gly Glu Gly 190
Trp lie Leu Asp His 205
Trp Leu Ser Val
Phe 220
Val Pro Pro Glu
Leu 240Leu Leu Leu Pro Tyr Gin Leu Pro Phe His Pro Gly Arg Met Ser Ser 245
Val Phe lie Pro
Tyr lie Arg Met 260
Pro Val Thr Pro
His 250
Ser Tyr lie
Phe Val Gly 275 Asp
Met 265
Val Leu Glu Leu
Arg Tyr
Ser 255 Lys
Arg
Tyr
Cys 305 Phe
Asn 290
Ala Lys Glu Trp Ser Phe Gly
Pro Tyr Asp
Tyr Asp
Val 280
lie Asp Trp Asn
Gly 270
Ser Glu Leu
Glu 295
Tyr Tyr Pro
Met 310
His Lys Phe lie
Trp Arg
Arg 285
Ala Arg Thr Gin
Lys 300
Ser Lys Leu Asp
Pro Gly Arg
Leu 325
Leu Arg Glu Lys
Ser 315
Pro Val Leu Leu
Val His Tyr 355
Ala Leu Asn lie
Lys Leu Arg Glu Lys Ala 340 345 Glu Asp Glu Cys Thr Arg
Glu 330
Leu Ala Thr Ser
Arg 335 Arg
Met 320 Trp
Asn
Pro
Glu 385 Ala
Lys 370
Ala Phe Lys Cys
Thr 360 Ala
Glu
Asp
Asp Ala Gly
Glu Leu Gly 435 Leu
Lys Gly
Leu Ala Cys 375
lie Ala Arg Val
Tyr lie Cys Trp
Met 350
Gly Gly Val
lie
Phe 365
Asp Pro Ser Ser
His 390
Lys Met Gin lie
Glu 380
Asp Tyr Leu Trp
Met 405
Thr Val Glu Ala
Tyr 395
Asp Gly Ser Gin
Leu 420
Pro Thr Leu Lys
Tyr 410
Val Ala Thr Asp
Leu 425
Ala His Ser Phe
Val 415 Val
lie 400 Trp
Lys
Gin
lie 465
Leu 450 Ser
Asp Asn Cys Gly
Arg 440
Arg Asp Phe Asn
Lys Gly Gly
Trp 470
Pro 455
Thr Phe Thr Thr
Ala 475
Arg 460 Asp
Leu 445 Trp
Asp
Leu 430
Lys Asn Ser
Tyr Gly
Arg Trp
His
Gin 480Val Ser Asp Cys Thr Ala Thr Ala Leu Lys Ala Cys Leu Leu Leu Ser 485
Glu lie Val Gly
Arg lie Ser Tyr
Asp
Pro 500
Val Asn Cys Leu
Lys 490
Pro Leu Glu lie
Phe
Ala 515
Ala Phe Glu Leu
Glu 505
Ser Leu Met Asn
Leu 495 Ala
Gin
Ser 530
Pro Thr Glu Ala
Met 520
Arg Ser Asn Thr
Asp 510
Asn Gly Gly
Asn 545
Glu Cys Thr Ser
Phe 550 Ser
Val 535
Gly Arg Val Met
Asp 525
Leu Glu His lie
Trp 540
Glu Tyr Pro Tyr
Ser 565
Arg Lys Glu Glu
His Pro Gly His 580
lie Glu Ser Ser
lie Gin Cys Leu 570 Glu
lie 555
Ala Leu Phe Lys
Ala Asn Phe 595 Gly
Val 585 Arg
Ser
Ser
Leu 625 Ala
lie
Trp 610
Val Ser Ala
Cys
Asp Glu Ser Tyr
Phe
Cys
Gly
Leu 645 Ser
Phe
Arg 630 Leu
Gin 600
Tyr Ala Thr
Thr 615
Thr Leu Gly Asn
Asn Asp Trp
Cys Gly
lie
Ser 605 Ala
Ser 590 Trp
Lys 575 Lys
Val 560 Leu
Gly Tyr Gly Val Thr Gly
Phe 620
Ala Thr Val Arg
Ser
Lys
Cys His Asp
Leu 660
His Gly Thr His
Asn Arg Pro 675
Gly Gin Ala Glu
Asp
Lys 705
Ala 690
Ala Leu Leu Asn
Leu 710
Arg 695 Gin
Thr 680 Asp
Gin
Glu 665 Ala
Leu 650 Val
Ser 635
Pro Ser Gly Gly
Trp Val
Leu Glu Asp
Tyr Thr Asn Ala Met
Trp 655 Lys
L>ys 640 Gly
Gly
Leu 670
Ala Leu lie
Pro Vsl Pro
Gly 715
lie 685
His Arg Ala Ala
Leu 700
Glu Phe Pro Gin
Gin 720Glu lie Val Gly Val Phe Leu Gin Thr Ala Met lie Ser Tyr Ser Gin
725 730 735
Tyr Arg Asn lie Phe Pro lie Met Ala Leu Thr Gly Tyr Arg Arg Arg
740 745 750
Val Leu Leu Ala Gly Asn lie 755