[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及CACNA1D基因作为单基因糖尿病致病基因的应用。

[0002] 糖尿病已经成为一个严重的公共卫生问题，给各国带来巨大的经济损失。近年来，糖尿病年龄标化死亡率增加了3%。根据WHO（World Health Organization, WHO）发布的2022年世界卫生统计报告，糖尿病是全球第九大死亡原因。因此，提高糖尿病诊断的准确度，并尽早为所有糖尿病患者提供适当和及时的治疗成为临床医学和生命科学亟需解决的问题。

[0003] 不同类型的糖尿病在发病机制、病情轻重以及治疗方面存在很大差异。单基因糖尿病(Monogenic diabetes)是由影响胰岛β细胞发育或胰岛素合成、分泌及作用的单基因突变所导致的糖尿病的总称，属于特殊类型糖尿病，病患者人数约占总糖尿病病例的1.5%‑2%。我国大约有8百万人患有单基因糖尿病。单基因糖尿病临床表现为胰岛素缺乏所致的高血糖，与1型糖尿病和2型糖尿病表型部分重叠，经常被误诊为1型或2型糖尿病。Pihoker和Chambers等人研究发现，只有5%‑7%的确诊单基因糖尿病病例初诊被正确归类。单基因糖尿病患者的误诊不仅会导致治疗方案和监测策略不佳，还会延误其他家庭成员的诊断。此外，大多数单基因糖尿病患者不需要使用胰岛素进行治疗，因此，对糖尿病患者进行准确分型是该病精准治疗的第一步，可以为患者提供最佳的治疗方案。

[0004] 随着现代生物技术的飞速发展，基因检测在疾病诊断、治疗和预防中发挥着越来越重要的作用。在糖尿病领域，特别是单基因糖尿病（如新生儿糖尿病、成年起病型青少年糖尿病等）的诊断中，基因检测是确诊单基因糖尿病的金标准。由于单基因糖尿病易感基因研究还不甚深入，迄今已发现的单基因糖尿病的致病基因或候选致病基因仅70余个，包括7个转录因子(HNF4A, HNF1A, IPF1, HNF1B, NEUROD1, KLF11, PAX4)，3个酶(GCK, CEL, BLK)，2个钾离子通道蛋白(ABCC8, KCNJ11)，1个激素(INS)和一个接头蛋白(APPL1)等，这些基因大多通过影响胰岛β细胞的发育、数量、胰岛素分泌和功能等进而导致血糖异常。目前，这70个基因中GCK、HNF1A和HNF1A等基因已应用于临床单基因糖尿病的基因检测。因单基因糖尿病发生机制不同，临床上亟需寻找更多潜在的单基因糖尿病的致病基因和突变位点，以提高单基因糖尿病的诊断准确率。

[0024] 本发明旨在提出基于CACNA1D基因在单基因糖尿病检测的创新方法，通过检测CACNA1D基因的突变情况诊断因CACNA1D基因功能缺失所导致的单基因糖尿病，具体检测技术路线如下（图1）：（一）通过外显子组分析检测CACNA1D基因的突变情况，确定患者是否患有单基因糖尿病。

[0025] （1）样本采集：采集待检测者的血液样本，利用标准的血液采集方法进行操作。

[0026] （2）DNA提取：利用商业化的基因组DNA提取试剂盒，从血液样本中提取基因组DNA。

[0027] （3）文库构建：将基因组DNA随机打断成随机片段文库，文库纯化后通过与外显子捕获系统进行杂交富集，使用qPCR检测文库质量。

[0028] （4）外显子组测序：质量合格的外显子文库采用高通量测序技术进行全外显子组测序或目标区域测序。

[0029] （5）测序数据经过生物信息学分析，确定患者的基因突变情况，明确CACNA1D基因的突变及序列异常。

[0030] （二）通过基因测序手段，验证CACNA1D基因的突变情况，确定患者是否患有单基因糖尿病。

[0031] （1）样本采集：采集待检测者的血液样本，利用标准的血液采集方法进行操作。

[0032] （2）基因组提取：利用商业化的DNA提取试剂盒，从血液样本中提取基因组DNA。

[0033] （3）CACNA1D基因扩增：使用PCR技术扩增CACNA1D基因片段。

[0034] （4）基因检测：采用Sanger测序技术，对CACNA1D基因进行测序。测序数据经过生物信息学分析，识别CACNA1D基因的突变及序列异常。

[0035] （三）结果解读

[0036] （1）根据全外显子组测序分析结果，确认患者临床常见单基因糖尿病致病基因，如胰岛素合成基因INS（Gene  ID:  3630，位于人11号染色体，NC_000011.10 (2159779..2161209, complement)，Ensembl ID：ENSG00000254647）等不存在突变，而CACNA1D基因存在突变位点。

[0037] （2）分析CACNA1D基因的Sanger测序结果，确认CACNA1D基因的突变位点；并分析突变对CACNA1D蛋白的影响。

[0038] （3）结合临床信息和家族史等，评估受检者因CACNA1D基因功能缺失所导致的单基因糖尿病的风险。

[0039] （4）对于检测结果异常者，进一步进行基因型‑表型关联确认，以明确患者的单基因糖尿病类型及治疗方案。

[0040] 综上，通过检测CACNA1D基因突变情况，临床诊断病人是否患有单基因糖尿病。CACNA1D基因突变可导致胰岛素分泌受阻，继而诱发单基因糖尿病。目前该基因没有列入单基因糖尿病检测中，CACNA1D基因的加入进一步丰富了单基因糖尿病基因检测库。

[0041] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0042] 实施例1 CACNA1D是单基因糖尿病致病基因

[0043] 外显子组测序数据筛选和InterVar注释，显示CACNA1D基因第45号外显子上存在2个无义突变，第1867位和第1884位酪氨酸突变为终止密码子，InterVar注释均为具有致病性（“Pathogenic”）的（表1），CADD、GERP等软件也预测其突变存在有害性。GO富集分析（图2）和KEGG分析（图3）中显示，CACNA1D会影响胰岛素分泌通路。

[0044] CACNA1D两个无义突变位于CAC1F_C结构域的临近位置上（图4A），该突变会导致C‑端结构域的截短，至少缺失了三个连续的α螺旋（图4，B和C）。

[0045] 用于检测CACNA1D基因突变（第1867位和第1884位酪氨酸突变为终止密码子）的引物如下（SEQ ID NO:1‑2）：引物F：5’‑GTTACCTAGAACCTTACTGCCCT‑3’

[0046] 引物R：5’‑AATCTGGCCTCACATGCTG‑3’

[0047] 扩增片段大小为216bp，包含45号外显子大小为164bp的片段和44‑45号内含子，45‑46号内含子。

[0048] 表1

[0049] 应用CRISPR Cas9技术敲除大鼠INS‑1细胞的CACNA1D基因（NC_086034.1 (5233682..5527549, complement)，Ensemble ID:ENSRNOG00000013147），或通过RNAi技术敲低大鼠INS‑1细胞CACNA1D基因的表达不会导致细胞出现明显的形态变化（图5），不影响细胞凋亡关键基因caspase3（位于16号染色体，Ensemble ID:ENSRNOG00000010475对应的转录本：ENSRNOT00000014095.6）的表达（图6），也不会影响胰岛素的合成（位于1号染色体，Ensemble ID:ENSRNOG00000012052，对应的转录本：ENSRNOT00000016052.6）（图7），但影响了细胞的胰岛素释放能力（图8）。

[0050] CACNA1DKOINS‑1细胞、CACNA1DKDINS‑1细胞的构建方法：大鼠胰岛细胞瘤细胞（INS‑1）购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。lentiCRISPR v2质粒和pLKo.1质粒均购自上海海吉浩格生物科技有限公司。

[0051] 基因敲除/敲低细胞构建流程如下：（1）载体质粒线性化

[0052] LentiCRISPR v2质粒选取BsmBI酶切位点，pLKo.1质粒选取EcoR1和Age1酶切位点进行质粒的线性化。

[0053] （2）目的片段制备

[0054] 根据NCBI数据库大鼠CACNA1D基因（NC_086034.1 (5233682..5527549, complement)，Ensemble ID:ENSRNOG00000013147）的CDS区序列，设计sgRNA和shRNA（表2），引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

[0055] 表2 sgRNA和shRNA引物信息

[0056] （3）目的片段和线性化载体连接，转化到大肠杆菌DH5α并进行测序验证。

[0057] （4）使用Lipofectamine®2000试剂进行细胞转染。

[0058] （5）嘌呤霉素筛选CACNA1D基因敲除/敲低细胞系。其中CACNA1DctINS‑1细胞为INS‑KO1细胞未进行基因操作的对照、CACNA1D INS‑1细胞为CACNA1D基因敲除细胞系、KD
CACNA1D INS‑1细胞为CACNA1D基因敲低细胞系。

[0059] （6）通过蛋白印迹实验、胰岛素释放实验和qPCR确认CACNA1D基因敲除对细胞的影响。

[0060] 技术路线如图9所示。

[0061] 进一步研究发现，CACNA1D基因蛋白质编码区任何位置上的无义突变，或者可导致CACNA1D蛋白质表达降低的任何突变基因，均与单基因糖尿病相关。

[0062] 因此，CACNA1D突变可导致单基因糖尿病发生，其机制是通过影响胰岛素释放诱发糖尿病。CACNA1D基因可作为单基因糖尿病的标志分子之一，用于临床单基因糖尿病的诊断。

[0063] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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