技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别涉及基因的应用。
相关背景技术
[0002] 我国是世界第一养蜂大国，蜂产品产量居世界前列。同时，蜜蜂也是维持生态环境持续发展不可或缺的物种，是植物、特别是新兴的设施作物的主要授粉昆虫。
[0003] 蜜蜂蜂群包括蜂王、工蜂和雄蜂。蜜蜂的生殖和繁衍后代是由蜂王来完成的，蜂王是发育完全的雌性蜂，其主要职能是产卵，蜂群中其他成员都是蜂王的子代；工蜂是发育不完全的雌性蜂，他们承担着蜂群中的一切工作，在正常情况下，工蜂不具有产卵功能；雄蜂是蜂群中的雄性成员，其主要功能就是等待着与处女王交尾。由此可见，蜂群中，能够直接将基因遗传给后代的是蜂王和雄蜂。但是，雄蜂在和蜂王交尾后就会死去，不能再次利用。因此，蜂王成为唯一可以培育并多次利用的种畜。蜂王的主要职能是产卵，以维持整个蜂群的持续发展。优秀的蜂王在繁蜂季节能够快速提高产卵能力，壮大蜂群，为流蜜期大量生产蜂产品做好准备。提高蜂王繁殖力，可以提高蜂群繁殖速度，进而加快蜂蜜、王浆等蜂产品的生产，可以有效的提高经济效益。因此，蜂王的高繁殖力越来越受到重视，提高蜂王的繁殖力成为关注焦点。
[0004] 卵巢是蜂王生殖系统的重要功能器官，是影响蜂王产卵的关键。卵巢大小和发育程度不仅是蜜蜂型级分化的重要形态指标，也是生殖潜力的重要标志。蜂王具有发育完整的卵巢，在性成熟后进行婚飞交配，蜂王一生只进行一次婚飞交配，之后卵巢激活、开始产卵，终生不再进行交配。产卵蜂王的卵巢在形态上，比处女蜂王的卵巢更大、更重。因此，卵巢激活是雌性蜜蜂体现生殖能力的前提条件，研究和筛选鉴定蜜蜂卵巢激活的相关分子标记对培育高繁殖力力的蜜蜂蜂王有重要意义。
[0005] 目前，蜜蜂育种者主要采用传统的配套系制种的方法，培育高繁殖性状的蜂王。采用分子标记开展标记辅助选择育种，在猪、牛、羊等畜种早在上世纪末就已经开始，近几年来，猪、牛等畜种的全基因组选择都已开展的如火如荼。而蜜蜂育种在分子育种方面还未开发出成熟的分子标记，组学水平的育种更是落后于其他畜种。目前，研究人员通常采用测序、芯片等方法筛选蜜蜂蜂王卵巢激活的DNA、mRNA分子标记，且均为大量假阳性结果，基因不能显著影响卵巢激活过程。但是未见QTL定位的相关报道。
具体实施方式
[0048] 本发明公开了基因的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0049] 本发明提供的基因的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0050] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0051] 实施例1
[0052] 样品采集：
[0053] 实验蜜蜂蜂王由中国农业科学院蜜蜂研究所海南实验蜂场提供。选择2组(每组3个重复)健康、体况基本一致的意大利处女蜂王。其中，第1组在处女王性成熟时期采集卵巢组织(处女王组)；另外1组进行人工授精处理，在蜂王正常产卵后采集卵巢组织。所有组织样品采集后迅速放入液氮中冻存，用于RNA的提取。
[0054] 组织样品总RNA提取：
[0055] (1)将预先准备好的1.5ml离心管中加入1mlTrizol(Invitrogen)，写上样品编号。
[0056] (2)将需要提取RNA的样品从液氮中取出，在研钵中加入液氮进行研磨。始终保持样品存在于液氮中，研磨得越细越好。
[0057] (3)将研磨成粉状的样品倒入预先准备的Trizol中，剧烈摇晃至样品完全溶解于Trizol中，至透明。
[0058] (4)4℃，12000rpm,离心10-15min。
[0059] (5)取上清，加入0.2ml氯仿，剧烈混匀15s，放置冰上10min。
[0060] (6)4℃，12000rpm,离心10-15min。
[0061] (7)取上清，加入0.5ml异丙醇，轻晃至析出沉淀。
[0062] (8)放置冰上10min。
[0063] (9)4℃，12000rpm,离心10-15min。
[0064] (10)去上清，用枪头洗掉剩余的液体。
[0065] (11)加入1ml的75％乙醇，洗涤沉淀。
[0066] (12)4℃，12000rpm,离心10-15min。
[0067] (13)重复一次洗涤过程。
[0068] (14)4℃，12000rpm,离心10-15min。
[0069] (15)倒出液体，洗掉剩余液体，室温晾干，约3min。
[0070] (16)加入约60-100μl DEPC水溶解RNA，放置冰上溶解15min。
[0071] (17)保存于-80℃冰箱。
[0072] mRNA测序文库构建：
[0073] (1)使用Epicentre Ribo-zeroTM rRNA Removel Kit(Epicentre,USA)去除核糖体RNA(rRNA)；
[0074] (2)使用 UltraTM Directional RNA Library Prep Kit for(NEB,USA)构建测序文库。
[0075] (3)测序平台Illumina Hiseq 4000，产生序列150bp paired-end reads。
[0076] (4)参考基因组Amel_4.5。
[0077] mRNA的鉴定：
[0078] Raw reads经过质控以后得到clean reads。使用TopHat v2.0.9软件，将clean reads与蜜蜂基因组进行mapping，根据已知mRNA和lncRNA在基因组中的位置，鉴定获得已知的mRNA和lncRNA。
[0079] 差异mRNA的筛选：
[0080] 使用DESeq package(1.8.3)程序包对测序数据进行分析，筛选任意两组之间差异表达的mRNA。使用Benjamini&Hochber计算差异检验P值。差异表达筛选标准是校正P<0.05，FC>1。
[0081] 实施例2
[0082] 实时定量PCR验证：
[0083] cDNA第一链合成
[0084] 使用与测序所用相同的RNA样品进行cDNA的合成，使用下列步骤进行cDNA的合成。
[0085] (1)将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中。
[0086]
[0087] (2)混合物在65℃加热5min后，迅速置于冰上冷却。短暂离心后，加入以下组分：
[0088]5×第一链合成缓冲液 4μl
0.1M DTT 2μl
RNaseOUTTM核酸抑制剂(40单位/μl) 1μl
[0089] (3)在离心管中轻轻将各种成分混合，并在37℃下孵育2min。
[0090] (4)在室温下加入1μl(200单位)M-MLV逆转录酶，轻轻吹打混匀。如果使用随机引物，需要将离心管在25℃孵育10mim。
[0091] (5)在37孵育50min。
[0092] (6)在70℃加热15min终止反应。
[0093] 合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存。
[0094] 荧光定量PCR引物设计：
[0095] 基因序列来源于测序结果，应用Oligo 6.0软件设计引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列见表1。选用actin作为内参基因。
[0096] 表1实时定量PCR引物序列
[0097]
[0098]
[0099] 荧光定量PCR反应体系和程序：
[0100] 以上述合成的cDNA为模板，采用总体积为20μl的反应体系，加入以下成分：
[0101]SYBR Green I Master Mix 10μl
Water,PCR-grade 3μl
引物 上下游各0.2μM
cDNA 5μl(50ng,1:100dilution)
总体积 20μl
[0102] 荧光定量PCR反应程序为：预变性95℃10min；扩增设定45个循环并收集荧光信号：95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s；65℃-97℃，0.2℃/s生成溶解曲线；40℃冷却终止反应。
[0103] RNA相对表达量的获得：
[0104] 采用比较Ct法(2-△△Ct)进行基因mRNA的相对表达量的统计分析。比较CT法使用的前提是要求目的基因和持家基因的扩增效率必须一致。本试验以actin和U6作为持家基因来校正不同样品初始模板的差异。每次反应重复三次试验，获得该个体的平均Ct值，并采用2-△△Ct法得到样本目的基因的RNA相对表达量。2-△△Ct法所用的公式如下：△△Ct＝[Ct(目的基因，未知样品)-Ct(持家基因，未知样品)]-[Ct(目的基因，未知样品)-Ct(持家基因，未知样品)]。每个样品的2-△△Ct值即为该样品目的基因mRNA的相对表达量。
[0105] 实时定量PCR验证：
[0106] 选择了5个mRNA进行了实时定量PCR验证。试验样品的分组与测序部分一致，持家基因actin作为mRNA的内参基因。表达量的计算采用2-ΔΔCt法，测序结果与定量结果比较见表2。
[0107] 结果发现，定量检测结果与测序检测结果的表达趋势基本一致，说明测序结果真实可靠。
[0108] 表2 mRNA的定量PCR验证
[0109]
[0110] 实施例3差异表达mRNA的富集分析
[0111] 卵巢激活和产卵调控过程中差异表达mRNA的功能富集分析：
[0112] GO富集分析：
[0113] 通过对表达谱芯片数据的分析，本发明得到了多组差异RNAs，为了了解这些差异基因的生物学功能和它们参与的生物学过程，对获得的差异基因进行了功能富集分析。功能富集分析帮助我们从生物学角度进一步了解差异RNAs的信息和它们参与的生物学过程。Gene Ontology(GO)分析可将基因按照分子功能(GO_MF)、细胞组成(GO_CC)和生物过程(GO_BP)三个本体进行分类，每个本体又可以继续向下分出不同的亚类，层层向下构成一个本体树状分支结构。现列出了显著富集的GO_BP结果(P<0.05)。
[0114] 在卵巢激活过程中，差异mRNA显著富集的GO_BP过程包括组织发育、能量产生和激素的合成代谢等(见图1)。
[0115] KEGG pathway富集分析：
[0116] 对获得的差异表达的mRNA同源为果蝇的基因后，进行富集分析，以期能更全面的了解lncRNA的生物功能。果蝇的基因组从Ensembl数据库下载(Release 74)。同源比对参数为“-p blastx-m8-e 1e-5-F F”、alignment peptides>50。GO富集分析使用Goseq based Wallenius non-central hyper-genomertic distribution(Young et al.2012)。KEGG pathways分析使用KOBAS software(Mao et al.2005)。
[0117] 分析了差异RNAs显著富集的GO terms，除此之外，很多RNAs在生物体内都是通过参与生物通路发挥其功能作用的。为了进一步了解我们所获得这些差异mRNAs富集调控了哪些生物学通路，我们对差异mRNAs进行了Pathway富集分析。Pathway分析是将参与同一个生物过程的基因集中在一个通路中进行研究。
[0118] 对卵巢激活和产卵调控过程的差异表达的mRNA进行了pathway富集分析，结果见图2。通过对富集到的pathway进行分析，发现，在卵巢激活显著富集的生物学通路包括肌醇六磷脂代谢，甘油磷脂代谢，hippo信号通路，磷酸肌醇代谢，MAPK信号通路，神经活性配体-受体互作，notch信号通路，磷脂肌醇信号系统和Wnt信号通路。
[0119] 实施例4差异表达的mRNA与卵巢大小相关QTL的比对
[0120] mRNA与卵巢大小相关QTL的比对：
[0121] 本发明获得的差异表达的mRNA的物理位置定位到蜜蜂基因组上，并将mRNA的物理位置与目前已知的与蜜蜂卵巢大小相关的QTL区间进行比对。该QTL区间定位在11号染色体8.9Mb到12.2Mb之间。落在该QTL区间内的基因和lncRNA，即为影响蜜蜂卵巢大小和产卵的候选基因。
[0122] 蜜蜂卵巢mRNA表达情况:
[0123] mRNA测序结果显示，在卵巢激活过程中，3218个mRNA表达上调，2263个mRNA表达下调。部分结果见表3。
[0124] 表3卵巢激活过程差异表达mRNA top30列表
[0125]
[0126]
[0127] NA”为不适用，因为计算时分母为0，无法计算。这种情况，被认为是显著差异表达的。
[0128] 当差异表达的mRNA的物理位置落在卵巢大小相关的QTL置信区间内时，获得这些mRNA是卵巢大小和产卵的候选分子标记基因。通过这种方法，我们鉴定了73个候选基因(表4)。
[0129] 表4落在卵巢大小QTL区间内的基因和lncRNA
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[0131]
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[0133] 表5蜂王卵巢激活过程中的关键基因及表达情况
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[0141] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
