[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及ZmMYB36基因及其应用。

[0002] 玉米是世界三大粮食作物之一，具有产量高、增产潜力大、用途广泛等特点。作为粮食、饲料和经济兼用作物。作为仅次于氮素的第二大营养元素，磷是玉米生长发育所必需的大量营养元素，也是核酸、磷脂、ATP等的重要组成成分。

[0003] 田间土壤中磷的丰度较高，但由于螯合作用(磷酸根离子会和钙、镁、铁、铝等阳离子形成难溶性的物质)，土壤中有效磷含量较低，且磷在土壤中呈异质性分布，特别是在土壤中移动性差，而玉米对磷的需求量高，所以玉米很容易在苗期和雌穗发育关键期发生缺磷的症状。

[0004] 在自然和农田生态系统中磷依然是限制植物生长的重要因子。当植物缺磷时其生长会受到严重制约，玉米在苗期缺磷会促进根系生长，增加根干重，降低地上部干重，增加根冠比，促进花青苷在地上部的积累，而在成熟期缺磷会影响玉米籽粒结实，减少产量。

[0005] 在玉米生长过程中，磷肥能够促进玉米根系生长发育，还能够明显提高玉米叶片面积指数、叶绿素含量，并且磷肥能够明显提高玉米籽粒产量和品质。施肥能够有效解决作物缺磷的问题，但在玉米生产过程中，化肥过量施用，引发农业面源污染，对生态环境造成严重不良影响，并且磷矿石是不可再生资源，磷资源终将会耗竭。

[0006] 植物通过一系列的形态和生理变化来响应低磷胁迫。根系是植物吸收获取养分的重要性状，在植物遭受低磷胁迫时，植物会促进根系的生长，扩大根系与土壤接触面积，最大化截获土壤中的磷素。植物还可通过促进菌根共生途径吸收磷。植物向土壤中释放糖类等信号物质，促进菌根共生，扩大植物根系与土壤的接触面积，在这个共生体中，真菌通过菌丝网络吸收Pi，然后通过丛枝将其释放到根内皮层，共生植物获得大部分的磷酸盐，AM共生还提高了植物的抗逆性和土壤的稳定性。由李春俭主编的《高级植物营养学》中提到，低磷也会促进双子叶植物向土壤中分泌有机酸和质子，土壤中无机磷多以CaPO4、FePO4和AlPO4等难溶性的形式存在，而在低磷条件下释放质子，可以降低土壤中的pH值，溶解难溶性的物质，同时有机酸可以与铁和铝离子螯合释放磷供植物吸收利用。低磷也会增加双子叶植物的酸性磷酸酶活性，且分泌到土壤中的酸性磷酸酶可以在酸性条件下水解土壤中的有机磷并释放磷，在植物体内的酸性磷酸酶可以催化老叶中的磷脂分解成磷素，实现磷在植物体内的再利用。

[0007] 公开号为CN106068858A的中国专利公开了一种施磷量对春玉米产量和土壤有效‑2 ‑2磷含量影响研究方法，施磷量为130.2kg·hm ，春玉米产量为1197.1kg·hm ；土壤Olsen‑‑1 ‑1
P为18.7mg·kg ，磷素淋溶为26.2mg·kg 。然而，依赖外源施用磷肥依然受土壤性质制约。

[0008] 因此，迫切需要提供培育耐低磷胁迫，又能提高籽粒产量的玉米新材料或品种。此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。

[0049] 下面结合附图进行详细说明。

[0050] 本发明中V2时期是指玉米具有两片完全展开叶的时期。本发明中V4时期是指玉米具有四片完全展开叶的时期。本发明中V7时期是指玉米具有七片完全展开叶的时期。

[0051] 实施例1

[0052] 本实施例提供ZmMYB36基因超表达及敲除玉米株系的材料与培养方法。

[0053] 材料包含玉米自交系B73(野生型)、ZmMYB36的超表达株系以及基因敲除株。

[0054] 玉米自交系B73(野生型)、ZmMYB36的超表达株系以及基因敲除株放置于人工气候室中并以营养液培养玉米自交系B73(野生型)、ZmMYB36的超表达株系以及基因敲除株系。

[0055] 种子催芽的步骤如下所示：

[0056] (1)将种子在10％过氧化氢溶液中浸泡30min，该操作用于消毒种子；(2)用去离子水清洗三遍后，用饱和硫酸钙溶液浸泡种子5个小时；

[0057] (3)于湿润滤纸上避光催芽，待种子长至两叶一心时，选取长势良好且[0058] 一致的幼苗，去掉胚乳；

[0059] (4)将五颗苗移入体积2L的瓷罐中培养，培养期间通气，瓷罐内放置

[0060] 正常营养液；

[0061] (5)培养三天后，再进行低氮或低磷或低钾处理并培养一周进行收样，其中，试验设置六个重复，收样时，将根用去离子水洗净后迅速置于液氮中冷却，放于‑80℃冰箱保存。

[0062] 营养液配方为：2mM NH4NO3，2mM CaCl2，0.2mM Fe‑EDTA，0.75mM K2SO4，0.65mM ‑3 ‑3 ‑4MgSO4，0.1mM KCl，0.25mM KH2PO4，1х10 mM H3BO3，1х10 mM MnSO4，1х10 mM CuSO4，1х‑3 ‑6
10 mM ZnSO4，5х10 mM(NH4)6MoO4。

[0063] 低氮条件为正常供氮水平的1/50。低磷为正常供磷水平的1/100。低钾为正常供钾水平的1/100。

[0064] 蒙脱石培养基的培养方法为：

[0065] (1)选取玉米野生型、ZmMYB36的超表达株系以及ZmMYB36基因敲除株系各三个，每个株系设置12个重复；

[0066] (2)将长势良好的幼苗移入直径25cm、高40cm的盆中，每盆移栽4颗幼苗，每天浇一次去离子水；

[0067] (3)待玉米到V2时期，每盆保留1株长势良好且一致的幼苗，并开始每天每株浇100mL的营养液，其中，营养液配方与种子催芽使用的营养液配方相同；

[0068] (4)从V4到V7时期每天每株浇200mL的营养液；

[0069] (5)从V7到吐丝期每天每株浇400mL的营养液，从吐丝期开始每天浇1000mL的营养液，并开始设置对照(6盆)和低磷(6盆，磷浓度为对照的1/50)处理，直至最后收获，玉米雌穗均为自交授粉。

[0070] 实施例2

[0071] 本发明针对玉米野生型、ZmMYB36的超表达株系以及ZmMYB36基因敲除株系进行RNA的提取、纯化、反转录及实时荧光定量PCR。

[0072] (一)Trizol试剂提取总RNA：

[0073] (1)液氮预冷研钵，并迅速研磨样品，将2mL离心管中加入大约0.1g研磨好的样品，迅速加入1mL Trizol试剂，震荡混匀后在冰上放置5min；

[0074] (2)随后加入0.2mL的氯仿，剧烈震荡1min，冰上放置5min，在12000rpm的转速、4℃下离心15min；

[0075] (3)取上清液至新的1.5mL离心管中，加入相同体积的异丙醇，1/10体积的乙酸钠(3M，pH＝5.2)，上下颠倒混匀，于‑20℃过夜；

[0076] (4)随后在12000rpm、4℃下离心15min，倒掉上清液，加入1mL 75％的乙醇，上下颠倒使沉淀悬浮起来，在12000rpm、4℃下离心5min，并重复该步骤一次，倒掉上清液，晾15min，待离心管晾置干净后，加入30‑50mL DEPC水，放置10min，溶解RNA。

[0077] (二)RNA纯化与反转录：按照Takara试剂盒步骤操作。

[0078] (三)荧光定量PCR：用SYBR Premix EX TaqTM(Takara)进行荧光定量PCR，每个株系、每个处理设置四个生物学重复，每个生物学重复设置三个技术重复，并以ZmUbiqutin作为内参基因，并采用比较CT值法计算基因的相对表达量。

[0079] PCR反应体系如下：

[0080]

[0081] 扩增程序如下：

[0082] Step1 95℃预变性30s

[0083] Step2 95℃变性5s

[0084] Step3 60℃退火30s

[0085] Step4 72℃延伸30s

[0086] Step5 重复39个循环

[0087] 将玉米B73分别进行了全营养液、低氮、低磷、低钾的营养液培养，在生长周期为10天时收获玉米B73整个根部鲜样，利用q‑PCR进行ZmMYB36基因相对表达量分析。如图3左侧图所示，CK、LN、LK对应的柱形图比LP对应的柱形图矮，表明CK、LN、LK处理下的ZmMYB36基因表达量低于LP处理下的ZmMYB36基因表达量。该结果表示ZmMYB36基因对低氮、低钾处理均无响应，而受低磷诱导显著上调表达约26倍。如图3右侧图所示，对照组(CK)中的ZmMYB36基因表达量基本无变化，而低磷处理组(LP)中的ZmMYB36基因表达量在低25天迅速增长。结果表明，随着缺磷时间增加，ZmMYB36基因表达量增加，至25天时其表达增量增加为5倍。结果表明，ZmMYB36基因对低氮、低钾处理均无响应，而受低磷诱导显著上调表达约26倍。

[0088] 如图5所示，通过qPCR检测过表达株系基因表达量，相较于野生型(WT)的ZmMYB36基因表达量，OE‑1表达量为3.58，OE‑2表达量为19.55，OE‑3表达量为1144.5。结果表明ZmMYB36过表达株系基因的表达量分别上调3.58、19.55及1144.5倍。

[0089] 实施例3

[0090] 本实施例涉及基于ZmMYB36蛋白的亚细胞定位分析的基因枪操作及共聚焦显微镜观察。

[0091] (一)材料：洋葱内层表皮

[0092] (二)试剂：2.5mol/L CaCl2，0.1mol/L亚精胺，无水乙醇

[0093] (三)前期准备：撕取洋葱内层表皮大约2×2cm，将撕取的洋葱表皮组织置于现配的1/2MS培养基上，黑暗培养12h。

[0094] (四)制备DNA‑金粉复合体：配置2.5mol/L CaCl2和0.1mol/L亚精胺各1mL；将金粉涡旋震荡5min，使其在无菌水中呈悬浮状态；吸取金粉悬浮液8.5μL于1.5mL EP管中，并顺序加入5μg质粒DNA，17μL CaCl2和8μL亚精胺；震荡5min，冰上静置10min，3000rpm离心1min，弃上清；加入100μL无水乙醇，不破坏沉淀洗涤，弃上清，重复2次；加入10μL无水乙醇，备用。

[0095] (五)基因枪步骤：取10μL制备好的DNA‑金粉复合体，均匀涂布在轰击膜中间孔径处，基因枪上方放置压力膜在孔内轰击材料，在舱内压力降为0时开舱门取出材料。

[0096] (六)培养：轰击完毕将洋葱表皮置于1/2MS培养基中，28‑30℃培养箱黑暗培养22‑24h，进行共聚焦显微镜观察。

[0097] 图4示出ZmMYB36蛋白的亚细胞定位分析结果。ZmMYB36作为转录因子，首先要定位在细胞核内才能对下游靶基因进行转录水平的调控。构建ZmMYB36的GFP融合蛋白并利用基因枪转入洋葱表皮细胞发现，ZmMYB36:GFP的Merge图中示出了定位在细胞核中的亮斑，该结果表明ZmMYB36:GFP特异性地定位于细胞核，阴性对照GFP在整个洋葱细胞中都有表达。结果表明，ZmMYB36定位在细胞核。该结果为ZmMYB36基因在细胞核中调控下游基因的转录提供依据。

[0098] 实施例4

[0099] 本实施例涉及玉米磷含量的测定。

[0100] 采用万分之一天平进行称重，用浓H2SO4‑H2O2消煮法和钒钼黄比色法测定各部位磷含量，所用试剂均为优级纯试剂。

[0101] 具体操作如下：

[0102] (1)将样品磨碎后，天平称量后直接置于洗净并烘干的消煮管中，设置空白对照，每管中加入5mL浓硫酸，摇匀后静置过夜；

[0103] (2)加入4mL H2O2，分两次加，充分混匀之后，270℃消煮10min；

[0104] (3)待消煮管冷却之后加入2mL H2O2，在350℃消煮10min；

[0105] (4)待消煮管冷却之后加入2mL H2O2，继续在350℃消煮20min；

[0106] (5)将H2O2彻底清除干净，待消煮管彻底冷却之后用去离子水定容至50mL，上下颠倒混匀；

[0107] (6)每管中吸取5mL待测液体至15mL进口离心管中，加入两滴2，4‑二硝基酚指示剂，用6M NaOH中和至溶液刚变为淡黄色；

[0108] (7)加入2mL钒钼酸铵溶液，定容至10mL，上下颠倒混匀，室温静置15min；

[0109] (8)待反应稳定后用分光光度计在440nm处测定吸光值；

[0110] (9)称取105℃烘至恒重的KH2PO4配置50mg/L的磷标准液，然后吸取磷标准溶液于50mL容量瓶中，按照上述步骤显色，设置0、1mg/L、2.5mg/L、5mg/L、7.5mg/L、10mg/L、15mg/L的磷标准溶液，读取相应吸光值，绘制标准曲线，并计算磷浓度和磷含量。

[0111] 筛选获得纯合的ZmMYB36 CRISPR(基因敲除)株系和OE(过表达)株系。Sanger测序鉴定CRISPR株系基因型，其中，CRISPR株系基因型包含CRISPR‑1(插入T)，CRISPR‑2(缺失28bp)，CRISPR‑3(缺失35bp)。

[0112] 测定玉米野生型、ZmMYB36 CRISPR株系和OE株系的根部、穗位叶和籽粒的磷浓度。测定玉米野生型、ZmMYB36 CRISPR株系和OE株系的根部、穗位叶和籽粒的磷利用效率。

[0113] 如图11所示的玉米野生型、ZmMYB36 CRISPR株系和OE株系砂培种植生殖生长时期‑1不同部位磷浓度和磷利用效率分析。统计根部磷利用效率(kg root g P)，发现在低磷处理组中，CRISPR株系的根部磷利用效率分别为0.62、0.69、0.88，野生型的根部磷利用效率为
0.78，OE株系的根部磷利用效率分别为1.06、0.98、1.17。

[0114] 统计穗位叶磷利用效率(kg ear leaf g‑1P)，对照组中，CRISPR株系的穗位叶磷利用效率分别为0.18、0.16、0.17，野生型的穗位叶磷利用效率为0.19，OE株系的穗位叶磷利用效率分别为0.28、0.34、0.31。在低磷处理组中，CRISPR株系的穗位叶磷利用效率分别为0.19、0.20、0.23，野生型的穗位叶磷利用效率为0.25，OE株系的穗位叶磷利用效率分别为
0.33、0.39、0.37。

[0115] 对照组中，CRISPR株系的籽粒磷利用效率分别为(kg ear g‑1P)0.26、0.32、0.27，野生型的籽粒磷利用效率为0.27，OE株系的籽粒磷利用效率分别为0.30、0.29、0.30。在低磷处理组中，CRISPR株系、野生型和OE株系的磷利用效率没有显著差异。

[0116] 统计根部磷浓度发现，对照组中，CRISPR株系根部磷浓度分别为1.54、1.55、1.34，野生型根部磷浓度为1.69，OE株系根部磷浓度分别1.30、1.27、1.31。低磷处理下，CRISPR株系根部磷浓度分别为1.65、1.46、1.15，野生型根部磷浓度为1.31，OE株系根部磷浓度分别为0.97、1.02、0.86。

[0117] 对照组中，CRISPR株系穗位叶磷浓度分别为5.61、6.06、5.95，野生型穗位叶磷浓度为5.21，OE株系磷浓度分别为3.60、3.15、3.43。低磷处理下，CRISPR株系穗位叶磷浓度分别为5.24、5.09、4.49。野生型穗位叶磷浓度为4.10，OE株系穗位叶磷浓度分别为2.85、2.70、2.73。

[0118] 统计籽粒磷浓度发现，对照组中，CRISPR株系籽粒磷浓度分别为3.80、3.79、3.64，野生型籽粒磷浓度为3.64，OE株系籽粒磷浓度分别为3.31、3.41、3.35。低磷处理下，CRISPR株系籽粒磷浓度分别为3.05、2.83、3.28，野生型籽粒磷浓度为3.12，OE株系籽粒磷浓度分别为3.66、3.59、3.47。

[0119] 低磷处理下，CRISPR株系的根部磷浓度和穗位叶磷浓度显著高于野生型。过表达株系的根部磷浓度和穗位叶磷浓度显著低于野生型；对照处理下，过表达株系的籽粒磷浓度显著低于野生型，而在低磷处理下其籽粒磷浓度显著高于野生型。低磷处理下，CRISPR株系的根部和穗位叶磷利用效率显著低于野生型。过表达株系的根部磷利用效率和穗位叶磷利用效率显著高于野生型。结果显示，对照条件下，OE株系的根部位、穗位叶和籽粒磷利用效率显著高于野生型和CRISPR株系。

[0120] 实施例5

[0121] (一)酵母单杂交

[0122] (1)载体的构建：参考NCBI数据库中ZmMYB36、ZmPHT1；1、ZmPHT1；2、ZmPHT1；6、ZmGA1、ZmYIGE1启动子区域序列，将测序公司合成含有P1BS和MRE元件的200bp启动子序列，分别克隆到pLacZi 2u载体中，将ZmMYB36、ZmPHR1；1、ZmPHR1；2的CDS序列分别克隆到pB42AD载体上，并测序验证。

[0123] (2)酵母菌株感受态细胞制备与转化：先将‑80℃取出的EGY48酵母菌株在YPD平板上划线培养，挑取单克隆在YPD液体培养基中小摇OD值至1.5，取5mL至200mL YPD液体培养基中摇匀至OD值在0.4‑0.6之间；室温4000rpm，离心5min收集菌体，用ddH2O清洗菌体，收集菌体，重复三次后用3mL新配的1×TE/LiAc重悬菌体，即为感受态细胞；沸水煮10mg/mL鲑鱼精DNA 5min，冰上放置2min，重复一次，取1.5mL离心管，加入100ng质粒，10μL鲑鱼精DNA，100mL酵母感受态细胞，加入600mL PEG/TE/LiAc，震荡混匀后放于30℃摇床，200rpm培养
30min；每个反应加入70μL DMSO终止转化，于42℃水浴15min，冰上放置1‑2min；离心，每个反应加入200mL 1×TE溶液重悬菌体，吸取100mL涂布于SD/His‑Ura‑Trp培养基上，于30℃恒温培养箱培养2‑3d；挑取单克隆划线于SD/His‑Ura‑Trp+X‑Gal培养基上，于30℃培养箱培养，至底物反应菌株变蓝后拍照记录。

[0124] 在ZmMYB36基因的启动子区域含有一个P1BS元件，因此推测ZmMYB36可能受ZmPHR1s的调控。通过酵母单杂交实验，如图12所示，ZmPHR1s能够与含有P1BS序列的ZmMYB36启动子区域结合，使酵母菌落呈蓝色。基于上述结果，发现在酵母系统中ZmPHR1.1和ZmPHR1.2都可与ZmMYB36基因的启动子上的P1BS互作。ZmPHT1；1、ZmPHT1；2、ZmPHT1；6、ZmGA1和ZmYIGE1基因的启动子区域均含有MRE元件，因此推测这些基因可能受ZmMYB36的调控。如图14、16和17所示，ZmMYB36能够与含有MRE元件的ZmPHT1；1、ZmPHT1；2、ZmPHT1；6、ZmGA1和ZmYIGE1启动子区域结合，使酵母菌落呈蓝色，可见，ZmMYB36可与上述基因启动子上的MRE互作。

[0125] (二)凝胶阻滞迁移实验(EMSA)

[0126] 分别将ZmPHR1；1、ZmPHR1；2和ZmMYB36的CDS序列克隆到PET‑30a表达载体上。将构建好的表达蛋白质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，使用Ni‑NTA‑Agarose beads，使用不同浓度的咪唑洗脱液收集纯化后的蛋白。由公司合成带有生物素标记和不带生物素标记的ZmMYB36和ZmNPF5.6启动子区域，其分别含有P1BS元件和MRE元件的40bp序列进行EMSA试验。

[0127] (1)首先用ddH2O将引物稀释为100μM，然后用新的200μL离心管分别加入正向和反向引物将biotin probe稀释为0.2μM，competitor probe 10μM(50×)、20μM(100×)，将稀释好的探针在PCR仪上96℃15min；

[0128] (2)清洗胶槽和玻璃板；

[0129] (3)待玻璃板晾干后，将玻璃板安装好置于夹板上灌注6％的非变性胶；

[0130] (4)用高纯水配制1L的0.5×TBE；

[0131] (5)待探针退火好后，安装好电泳装置，加入1L的0.5×TBE预电泳1h(恒压80V)；

[0132] (6)蛋白与探针结合反应，按照以下配方配制结合反应体系：

[0133] 实验组：50ng融合蛋白，2μL标记探针，6μL结合反应缓冲液，用超纯水定容至20μL，[0134] 竞争组：50ng融合蛋白，2μL标记探针，未标记的竞争探针2μL，6μL结合反应缓冲液，用超纯水定容至20μL；

[0135] (7)结合反应完毕后加入5μL上样缓冲液，充分混匀再进行上样，电压90V，待指示剂到达胶的3/4处时即可停止电泳；

[0136] (8)配制1.5L的0.5×TBE，冰上预冷，提前10min在0.5×TBE中浸泡尼龙膜，4层滤纸，待电泳完成后开始转膜，转膜放置顺序为：

[0137] 黑色板，一层海绵，一层滤纸，胶(将上部的胶孔切除，小心拖拽)，尼龙膜，一层滤纸，一层海绵，

[0138] 白色板，向电泳槽内加入1.5L的0.5×TBE冰浴转膜1h，恒流380mA，电压大约80‑90V；

[0139] (9)准备干净方形培养皿，将转好的膜拿去交联，正面朝上交联2min、反向2min；

[0140] (10)封闭：将紫外交联后的尼龙膜置于干净的平皿中，加入10mL封闭缓冲液(EMSA试剂盒)，轻柔摇动15min；

[0141] (11)杂交：轻轻倒掉封闭缓冲液，加入8mL结合/封闭缓冲液(EMSA试剂盒)，轻柔摇动15min；

[0142] (12)漂洗：将尼龙膜转移至新的平皿中，加入10mL 1×漂洗液，轻柔漂洗5min，重复漂洗3次；

[0143] (13)平衡：将尼龙膜转移至新的平皿中，加入15mL底物平衡缓冲液，轻柔摇动15min，取出尼龙膜，吸干多余的底物平衡缓冲液；

[0144] (14)发光检测：置于新的平皿中，加入6mL化学发光底物至完全覆盖尼龙膜，静置孵育5min，取出尼龙膜，从侧面吸干多余的化学发光底物，用保鲜膜包被，在化学发光成像系统中曝光5min进行显影。

[0145] 如图12所示，通过EMSA实验进一步证实了ZmPHR1.1和ZmPHR1.2与ZmMYB36基因启动子区域的P1BS顺式作用元件的结合，结果显示，ZmPHR1.1和ZmPHR1.2可以与生物素标记的含P1BS寡核苷酸序列结合，影响ZmPHR1s蛋白的迁移率，且随着非生物素标记的探针浓度的增加，生物素标记探针信号逐渐减弱，说明ZmPHR1s能够在体外与ZmMYB36启动子区域的P1BS元件结合。

[0146] ZmYIGE1和ZmNPF5.6基因启动子区域含有MRE元件，推测其可能受ZmMYB36的调控。如图16和17所示，通过EMSA实验发现ZmMYB36可以与生物素标记的含MRE寡核苷酸序列结合，影响ZmMYB36蛋白的迁移率，且随着非生物素标记的探针浓度的增加，生物素标记探针信号逐渐减弱，证实了ZmMYB36与ZmYIGE1和ZmNPF5.6基因启动子区域MRE顺式作用元件结合。

[0147] (三)烟草双荧光素酶试验

[0148] 将ZmPHR1；1、ZmPHR1；2和ZmMYB36的编码序列克隆到载体pGreen 62‑SK中，将ZmMYB36、ZmGA1和ZmNPF5.6约2000bp启动子序列克隆到载体pGreen II 0800‑LUC中，测序验证后挑取单克隆摇菌，并提取质粒转化到根癌农杆菌GV3101中；将62‑SK‑PHR1s/MYB36和ProMYB36/GA1/NPE5.6‑LUC农杆菌按9:1比例混合浸润本氏烟草叶片，并以pGreen 62‑SK空载和ProMYB36/GA1/NPE5.6‑LUC共转浸润烟草作为阴性对照培养3天；测定方法按照双荧光素酶试剂盒(Promega)，并利用GLO‑MAX 20/20光度计(Promega)测定萤火虫荧光素酶(LUC)和海肾荧光素酶(REN)的活性，计算LUC/REN比值，其中，实验设置6个生物学重复，并将阴性对照的LUC/REN比值标准化为1。

[0149] 为了验证在植物中ZmPHR1s是否调控ZmMYB36，通过烟草瞬时转染实验进行双荧光素酶活(LUC/REN)实验。如图13所示，相较于对照组，6K‑PHR1；1和6K‑PHR1；2所测得的LUC/REN比值更高。结果显示ZmPHR1.1和ZmPHR1.2能够促进ZmMYB36表达。

[0150] ZmGA1和ZmNPF5.6基因的启动子区域含有MRE元件，因此推测此基因可能受ZmMYB36的调控。如图15和17所示，通过烟草瞬时转染实验进行荧光素酶活(LUC/REN)实验，结果显示，相较于对照组，6K‑MYB36所测得的LUC/REN比值更高，表明ZmMYB36可以结合ZmGA1和ZmNPF5.6基因启动子区域上的MRE元件并上调ZmGA1和ZmNPF5.6基因的表达。

[0151] (四)染色质免疫沉淀‑PCR

[0152] (1)载体连接：用In‑Fusion酶(Takara)将克隆的ZmMYB36基因编码区序列去掉终止密码子分别连接到pUC19‑35S‑HA‑RBS(Amp)载体上。

[0153] (2)原生质体制备和转化：

[0154] 1.玉米黄化苗培养：在花卉营养土内，室温避光培养10‑14d，待玉米长出三片叶，期间保持浇水。

[0155] 2.收集并剪切叶片抽真空：提前配制酶解液，选取长势良好叶，在弱光条件下用单刃刀片快速横切叶片，切下的细丝宽度约1mm，并快速至于盛有酶解液的小烧杯中，用真空泵抽真空30min，使酶解液充分进入到叶片细胞间隙以促进细胞壁溶解。

[0156] 3.将抽完真空的酶解液放置于28℃、40rpm的摇床，孵育3‑4h。

[0157] 4.配制W5、Mmg、WI和40％ PEG溶液。

[0158] 5.过滤原生质体：先用W5溶液湿润滤布以防产生气泡，随后过滤原生质体到干净灭菌50mL圆底离心管中，再用W5冲洗残渣，再次过滤残渣，重复几次，使更多的原生质体滤出。

[0159] 6.收集原生质体：在100g转速条件下，离心2min，用吸管吸除上清液。

[0160] 7.加入适量预冷的W5溶液缓慢重新悬浮原生质体，置于冰上30min，期间观察原生质体状态。

[0161] 8.在100g转速条件下，设置加速度为1、减速度设置为0，离心2min，收集原生质体，根据转化所需用量加入适量提前预冷的Mmg溶液，并悬浮原生质体，置于冰上。

[0162] 9.原生质体转化：每种质粒转化3个重复，在50mL康宁管中先加入300μL质粒(质粒浓度为1μg/μL)，然后加入4mL的原生质体溶液，轻轻混匀后，再加入4.3mL的40％PEG，轻轻上下颠倒混匀，室温静置18min后，加入两倍体积17.2mL的W5溶液终止转化。

[0163] 10.原生质体培养：在100g转速条件下，设置加速度为1、减速度设置为0，离心2min，收集原生质体，加10mL W5重悬原生质体，再次以同样转速、加减速度离心2min，尽量吸净，加5mL的WI溶液，轻轻悬浮原生质体，平放于28℃培养箱、黑暗条件培养14‑18h。

[0164] (3)染色质免疫沉淀：离心收集原生质体。随后进行样品交联、细胞核裂解、超声片段化DNA进行免疫沉淀。每个样品准备40μL的beads加入到超声上清液中，在4℃、低速摇床上，旋转过夜使标签和beads充分结合。第二天清洗beads，洗脱蛋白复合物，去交联，用QIAquick PCR purification试剂盒纯化DNA片段进行ChIP‑qPCR实验步骤。根据ZmYIGE1基因启动子序列设计引物，包含MRE元件片段(F2)，不包含MRE元件片段(F1)作为负对照。以转入空载体的原生质体所免疫沉淀下来的DNA为对照组，计算ZmMYB36标签蛋白所免疫沉淀下来的DNA相对富集量。

[0165] 如图16所示，通过ZmMYB36 ChIP‑qPCR发现ZmYIGE1启动子上有MRE的片段(F2)显著性富集，而不包含MRE片段(F1)则没有显著性差异，表明ZmMYB36可在体内与ZmYIGE1互作。

[0166] 上述结果表明，ZmMYB36受到磷素信号核心因子ZmPHR1s的调控，并通过ZmPHT1；1、ZmPHT1；2、ZmPHT1；6的表达增强玉米耐受低磷的能力。而且，ZmMYB36能够调控ZmGA1、ZmYIGE1、ZmNPF5.6这三个基因，并通过影响玉米激素水平来促进玉米籽粒数和穗长的增加。

[0167] 实施例6

[0168] 本实施例涉及对筛选获得纯合的ZmMYB36 CRISPR株系和OE株系在不同生长环境下的表型进行观察。

[0169] 试验地正常施肥处理下种植野生型B73、ZmMYB36 CRISPR株系和OE株系。如图6A所示，相较于野生型，敲除株系的玉米穗明显小于过表达株系的玉米穗。如图6B所示，野生型株系雌穗干重为64g/株，敲除株系雌穗干重分别为41g/株、48g/株和57g/株，过表达株系雌穗干重分别为105g/株、96g/株、100g/株。如图6C所示，野生型籽粒干重为53g/株，敲除株系籽粒重分别为31g/株、39g/株和44g/株，过表达株系籽粒重分别为90g/株、78g/株、78g/株。如图6C所示，野生型穗轴干重为14g/株，敲除株系穗轴干重分别为11g/株、10g/株和15g/株，过表达株系穗轴干重分别为25g/株、20g/株、19g/株。野生型株系穗长为10.43cm/株，敲除株系穗长分别为9.22cm/株、10cm/株和9.72cm/株，过表达株系穗长分别为14.25cm/株、
13.18cm/株、14.03cm/株。野生型株系籽粒数为233粒/株，敲除株系籽粒数分别为151粒/株、177粒/株和168粒/株，过表达株系籽粒数分别为329粒/株、324粒/株、312粒/株。在成熟期收获雌穗并对产量相关指标进行统计发现，CRISPR株系的雌穗重、籽粒重、穗粒数均显著低于野生型和过表达株系。

[0170] 图7示出了ZmMYB36转基因株系生殖生长时期株高表型分析结果。选取野生型、两个CRISPR株系(缺失28bp、缺失35bp)和两个过表达株系(上调3.58倍、上调19.55倍)，将上述植株在温室环境中进行蒙脱石介质培养。根据图7示出的统计数据，对照组中敲除株系的高度分别为193.58cm和186.75cm，野生型株系的高度是207.57cm，过表达株系的高度分别为202.13cm和184.55cm。低磷处理中敲除株系的高度分别为183.58cm和180.08cm，过表达株系的高度分别为191.8cm和172.75cm。在低磷处理43天即吐丝期后两周测定株高发现，无论是在对照还是低磷处理下CRISPR株系的株高均显著低于野生型。

[0171] 图8示出了ZmMYB36转基因株系成熟时期地上部和根部表型观察结果。地上部的结果表明，成熟期时，ZmMYB36 CRISPR株系衰老快于野生型和过表达株系。根部的结果表明，CRISPR株系的根显著小于野生型和过表达株系，而过表达株系的根显著大于野生型和CRISPR株系。

[0172] 图9示出了ZmMYB36转基因株系成熟时期生物量统计数据结果。对照组中敲除株系的地上部干重分别为80.82g/株、65.22g/株和83.71g/株，野生型株系的地上部干重为106.4g/株，过表达株系的地上部干重分别为99.70g/株、109.21g/株和119.51g/株。低磷处理组中敲除株系的地上部干重分别为66.70g/株、74.67g/株和83.98g/株，野生型株系的地上部干重为90.01g/株，过表达株系的地上部干重分别为108.06g/株、102.11g/株和
116.37g/株。

[0173] 对照组中敲除株系的根部干重分别为7.06g/株、6.74g/株和8.03g/株，野生型株系的根部干重为15.32g/株，过表达株系的根部干重分别为10.42g/株、14.79g/株和21.84g/株。低磷处理组中敲除株系的根部干重分别为6.98g/株、7.39g/株和9.46g/株，野生型株系的根部干重为9.07g/株，过表达株系的根部干重分别为12.82g/株、15.01g/株和
19.93g/株。

[0174] 对照组中敲除株系的根冠比分别为0.082、0.082和0.087，野生型株系的根冠比为0.129，过表达株系的根冠比分别为0.113、0.163和0.189。低磷处理组中敲除株系的根冠比分别为0.072、0.087和0.087，野生型株系的根冠比为0.140，过表达株系的根冠比分别为
0.116、0.139和0.174。

[0175] 对照组中敲除株系的穗下第三叶干重分别为2.31g/株、2.44g/株和2.57[0176] g/株，野生型株系的穗下第三叶干重为3.25g/株，过表达株系的穗下第三叶干重分别为2.84g/株、3.02g/株和3.96g/株。低磷处理组中敲除株系的穗下第三叶干重分别为2.25g/株、2.66g/株和2.60g/株，野生型株系的穗下第三叶干重为2.31g/株，过表达株系的穗下第三叶干重分别为3.16g/株、3.48g/株和3.40g/株。

[0177] 对照组中敲除株系的穗位叶干重分别为2.93g/株、2.90g/株和3.06g/[0178] 株，野生型株系的穗位叶干重为4.04g/株，过表达株系的穗位叶干重分别为3.74g/株、3.84g/株和4.01g/株。低磷处理组中敲除株系的穗位叶干重分别为3.20g/株、
3.42g/株和3.36g/株，野生型株系的穗位叶干重为3.31g/株，过表达株系的穗位叶干重分别为4.06g/株、3.78g/株和4.15g/株。

[0179] 对照组中敲除株系的穗上第三叶干重分别为2.62g/株、2.51g/株和2.84[0180] g/株，野生型株系的穗上第三叶干重为3.41g/株，过表达株系的穗上第三叶干重分别为3.03g/株、3.56g/株和3.37g/株。低磷处理组中敲除株系的穗上第三叶干重分别为2.43g/株、2.40g/株和2.69g/株，野生型株系的穗上第三叶干重为2.92g/株，过表达株系的穗上第三叶干重分别为3.27g/株、3.14g/株和3.38g/株。

[0181] 对照组中敲除株系的茎秆干重分别为22.62g/株、22.52g/株和22.17g/[0182] 株，野生型株系的茎秆干重为33.98g/株，过表达株系的茎秆干重分别为28.08g/株、30.95g/株和37.52g/株。低磷处理组中敲除株系的茎秆干重分别为20.77g/株、18.63g/株和21.51g/株，野生型株系的茎秆干重为26.12g/株，过表达株系的茎秆干重分别为31.03g/株、29.37g/株和35.05g/株。

[0183] 对照组中敲除株系的其他部位(除去穗位叶、穗下第三叶、穗上第三叶、茎秆、雌穗、根这六个部位的剩余部位)干重分别为23.37g/株、23.77g/株和26.28g/株，野生型株系的其他部位干重为32.77g/株，过表达株系的其他部位干重分别为30.77g/株、30.75g/株和35.90g/株。低磷处理组中敲除株系的其他部位干重分别为24.18g/株、23.97g/株和
26.48g/株，野生型株系的其他部位干重为28.89g/株，过表达株系的其他部位干重分别为
31.79g/株、29.87g/株和34.51g/株。

[0184] 成熟期收获根部、地上部不同部位(穗位叶、穗上第三片叶、穗下第三片叶、茎秆、雌穗、剩余部位)，测定其生物量发现，无论在对照还是低磷处理下，CRISPR株系的地上部和根部生物量均显著低于野生型，OE株系的地上部和根部生物量均显著高于野生型；统计根冠比发现，在对照和低磷条件下，CRISPR株系的根冠比显著低于野生型，OE株系的根冠比显著高于野生型。另外，统计地上部不同部位生物量发现，CRISPR株系的不同部位生物量显著低于野生型，OE株系的不同部位生物量显著高于野生型。图10示出了ZmMYB36转基因株系砂培成熟时期雌穗表型分析结果。如图10所示的玉米雌穗表型图，相较于野生型，对照组敲除株系的玉米穗明显小于野生型和过表达株系的玉米穗。对照组中，野生型籽粒重为32.99g/株，敲除株系籽粒重分别为23.59g/株、20.88g/株和26.69g/株，过表达株系籽粒重分别为33.05g/株、30.56g/株、33.9g/株。低磷处理组中，野生型籽粒重为21.75g/株，敲除株系籽粒重分别为24.01g/株、22.14g/株和23.19g/株，过表达株系籽粒重分别为32.63g/株、
29.97g/株、32.71g/株。

[0185] 对照组中，野生型穗轴干重为7.16g/株，敲除株系穗轴干重分别为4.72g/株、4.41g/株和5.53g/株，过表达株系穗轴干重分别为7.30g/株、7.12g/株、9.02g/株。低磷处理组中，野生型穗轴干重为5.26g/株，敲除株系穗轴干重分别为4.83g/株、5.38g/株和
4.65g/株，过表达株系穗轴干重分别为8.64g/株、6.97g/株、8.52g/株。

[0186] 对照组中，野生型穗轴长为9.1cm/株，敲除株系穗轴长分别为7.84cm/株、7.76cm/株和9.25cm/株，过表达株系穗轴长分别为10.22cm/株、10.5cm/株、10.08cm/株。低磷处理组中，野生型穗轴长为8.14cm/株，敲除株系穗轴长分别为7.80cm/株、8.93cm/株和9.12cm/株，过表达株系穗轴长分别为10.16cm/株、10.00cm/株、11.47cm/株。

[0187] 对照组中，野生型百粒重为23.00g/株，敲除株系百粒重分别为20.54g/株、20.38g/株和17.75g/株，过表达株系百粒重分别为21.21g/株、20.00g/株、21.89g/株。低磷处理组中，野生型百粒重为22.61g/株，敲除株系百粒重分别为19.02g/株、21.16g/株和
18.07g/株，过表达株系百粒重分别为21.88g/株、20.61g/株、22.29g/株。

[0188] 对照组中，野生型收获指数(籽粒重占地上部干重的比例)为0.27，沉默株系收获指数分别为0.22、0.18和0.30，过表达株系收获指数分别为0.33、0.30、0.29。低磷处理组中，野生型收获指数为0.31，沉默株系收获指数分别为0.27、0.28和0.22，过表达株系收获指数分别为0.31、0.29、0.29。

[0189] 对照组中，野生型籽粒数为156，敲除株系籽粒数分别为114、111和153，过表达株系籽粒数分别为168、167、162。低磷处理组中，野生型籽粒数为108，敲除株系籽粒数分别为125、104和135，过表达株系籽粒数分别为149、150、167。

[0190] 对照组中，野生型行粒数为11，敲除株系行粒数分别为7、6和13，过表达株系行粒数分别为13、14、14。低磷处理组中，野生型行粒数为8，敲除株系行粒数分别为7、8和9，过表达株系行粒数分别为13、13、13。

[0191] 对照组中，野生型穗行数为13，敲除株系穗行数分别为11、11和12，过表达株系穗行数分别为13、12、12。低磷处理组中，野生型穗行数为11，敲除株系穗行数分别为10、11和12，过表达株系穗行数分别为12、12、12。

[0192] 根据图10可知，在成熟期时收获雌穗发现，对照条件下CRISPR的籽粒重和穗轴显著小于野生型；低磷处理下过表达株系的籽粒重和穗轴显著大于野生型；无论对照还是低磷处理下，CRISPR株系的百粒重和收获指数均显著低于野生型。在对照条件下CRISPR株系的籽粒数、穗长、行粒数和穗行数均显著低于野生型，而低磷处理下OE株系的籽粒数、穗长、行粒数均显著高于野生型。

[0193] 上述表型观察结果表明，在温室砂培条件下，ZmMYB36 CRISPR株系的根和地上部生物量显著小于野生型和过表达株系，在成熟期时收获雌穗发现，对照条件下CRISPR的籽粒重和穗轴显著小于野生型；低磷处理下过表达株系的籽粒重和穗轴表型显著大于野生型。

[0194] 表1

[0195]

[0196]

[0197] 需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”、“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。在全文中，“优选地”所引导的特征仅为一种可选方式，不应理解为必须设置，故此申请人保留随时放弃或删除相关优选特征之权利。