[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及荭草苷在调控植物化感作用中的应用。

[0002] 黄酮类化合物是一类是广泛分布于植物中的天然代谢产物，含有C6-C3-C6基本骨架。根据中央三碳链的氧化程度、是否构成环状以及B-环连接位置(2-或3-位)等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、异黄酮类等。大部分黄酮类化合物在植物体内与糖结合成苷类，也有一部分以游离态(苷元形式)存在。黄酮类化合物有很强的抗炎和抗癌作用，在心血管疾病、冠心病、肿瘤等疾病治疗中有很大的应用前景。此外，黄酮类化合物在植物生长发育、抗氧化、生物胁迫等方面起着重要作用。如调节激素的运输，作为一种紫外线吸收化合物保护植物免受UV-B辐射，抑制杂草生长等。

[0003] 目前在水稻中发现的有抑制杂草生长(化感作用)的黄酮类物质主要是麦黄酮(tricin)，而关于其他黄酮类物质是否具有化感作用却不是很清楚。

[0052] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0053] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0054] 实施例1、化合物纯化

[0055] (1)收集播种后约60天的水稻(籼稻)新鲜叶片，用冷冻干燥机干燥后研磨为粉末状。加入8倍体积75％的乙醇，超声提取3次，每次20min。

[0056] (2)过滤提取液，并用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，依次加入等体积的石油醚、二氯甲烷、正丁醇分别萃取3次。

[0057] (3)将获得的正丁醇相用旋转蒸发仪浓缩后利用中低压快速制备液相色谱仪(Biotage IsoleraTMPrime)采用湿法上样进行粗分。硅胶柱填料为YMC*GEL C18球形填料，填料粒径为50μm，孔径为12nm。本实施例中所用填料重量为100g。流动相为水(含0.1％的甲酸，％表示体积百分含量)、甲醇。流动相比例为甲醇10％-90％10柱体积，甲醇90％-100％2柱体积。流速：50mL/min，检测波长为210nm和254nm。通过初分，共获得10个组分，编号1-10。

[0058] (4)用UPLC-MS(Agilent 1290UPLC-6540Q-TOF)检测各个组分中荭草苷(orientin)的含量。将(3)中获得的组分各取1mL于1.5mL的Eppendorf离心管中，用离心浓缩仪器进行浓缩后加入200μL甲醇并涡旋溶解。4℃，12,000rpm离心10min。再吸取上清100μL于含有容量为200μL衬管的Agilent进样瓶中。然后用UPLC-MS进行检测。流动相A相：0.1％甲酸水溶液(％表示体积百分含量)；B相：乙腈。洗脱梯度：0-2min：5％B-10％B，2-12min：10％B-25％B，12-18min：25％B-70％B，18-23min：70％B-90％B，23-25min：90％B-100％B，
25-30min：100％B，后运行5min，％均表示体积百分含量。流速0.3mL/min，柱温：40℃，进样量：5μL。采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式检测，载气为高纯氮气，压力40psi，温度325℃。通过检测发现，组分2-7中含有荭草苷。

[0059] (5)合并含有目的化合物(orientin)的组分2-7并用旋转蒸发仪浓缩。然后利用HPLC半制备液相色谱(Agilent 1260)制备orientin。具体制备过程为：吸取(4)中获得的浓缩组分0.2mL于Agilent进样瓶中，并加入0.8mL的70％甲醇溶液(％均表示体积百分含量)稀释。充分混匀后利用HPLC半制备色谱进行样品制备。色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，规格9.4(内径)×250mm(长度)，填料孔径5μm；柱温：40℃；流速：1.5mL/min；检测波长：210nm，254nm，330nm；进样量：20μL；流动相：A相(H2O+0.1％甲酸，％表示体积百分含量)、B相(甲醇)；流动相等梯度洗脱程序：A：35％，B：65％，运行60min。将保留时间RT＝20.2min的组分接出并保存于-20℃。待所有样品制备完后，将所有的接出组分用离心浓缩仪进行逐步合并，然后使样品完全干燥，获得orientin单品。

[0060] (6)将得到的orientin化合物单品用1mL的D2O:CD3OD＝5:3(体积比)溶液溶解后，利用核磁共振技术(NMR)(BRUKER 800MHz NMR)进行结构鉴定。orientin的核磁结果见表1和图1。

[0061] 表1化合物orientin的核磁结果

[0062]

[0063] 实施例2、Os02g0589400基因克隆

[0064] (1)提取粳稻中花11(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Zhonghua11，ZH11)幼苗期叶片的基因组DNA。

[0065] (2)根据水稻注释网站(Rice Genome Annotation Project)已有的Os02g0589400序列信息，用含有BamHI和HindШ酶切位点的引物F1/R1以ZH11基因组DNA为模板扩增含有酶切位点的Os02g0589400基因CDS序列。

[0066] 引物F1：5’-ggatccATGGATGCCTCCCCGCTG-3’；

[0067] 引物R1：5’-aagcttCTAATAACCAGTCCTTGTCGTTG-3’。

[0068] (2)将获得的基因片段连接到pEASY-T3载体(TransGen Biotech， -T3Cloning Kit)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用蓝白斑筛选阳性克隆。

[0069] (3)将阳性克隆利用引物F2/R2进行PCR鉴定，扩增片段大小为414bp为阳性克隆。引物如下：

[0070] 引物F2：5′-GGCGACACAGCTCTCATGTCCTCGT-3′；

[0071] 引物R2：5′-CCCTCTCGCCCCTTCCAAGTAGCTC-3′。

[0072] (4)将阳性克隆委托公司进行测序，并将获得的序列与水稻注释网站序列信息一致的阳性克隆提取质粒，重组质粒命名为pEASY-T3-Os02g0589400。

[0073] 重组载体pEASY-T3-Os02g0589400的结构描述为：将pEASY-T3载体的酶切位点BamHI和HindШ之间的小片段替换为SEQ ID No.2所示DNA片段后的重组质粒。SEQ ID No.2为Os02g0589400基因的CDS序列，编码SEQ ID No.1所示蛋白质。

[0074] 实施例3、Os02g0589400基因的应用

[0075] 一、原核表达载体构建

[0076] (1)用限制性内切酶BamHI和HindШ将实施例2得到的重组载体pEASY-T3-Os02g0589400完全酶切，同时酶切表达载体pMAL-c2X(华越洋，VECT-570)。酶切体系为：5μg质粒、2.5μL 10×酶切缓冲液、2μL BamHI、2μL HindШ，加ddH2O补充反应体系至50μL。酶切反应条件为：37℃酶切4小时。

[0077] (2)用琼脂糖电泳对酶切产物进行分离，回收大小约为1.3Kb包含Os02g0589400的片段，以及6.6Kb左右的pMAL-c2X载体片段，分别溶解于30μL ddH2O中。

[0078] (3)将步骤(2)获得的基因片段与载体骨架片段进行连接反应。连接反应体系为：1μL 10×连接酶缓冲液、0.5μL T4 DNA连接酶、1μL pMAL-c2X载体片段、3μL基因片段，加ddH2O补充反应体系至10μL。连接反应条件为：4℃连接12小时。

[0079] (4)将连接反应的产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有Ampicillin的LB平板(Ampicillin浓度为100μg/mL)进行筛选。

[0080] (5)将阳性克隆进行PCR鉴定(引物F2/R2)。Os02g0589400阳性克隆的扩增片段为414bp。

[0081] 引物F2：5’-GGCGACACAGCTCTCATGTCCTCGT-3’；

[0082] 引物R2：5’-CCCTCTCGCCCCTTCCAAGTAGCTC-3’。

[0083] (6)将获得的阳性克隆委托公司测序，并提取质粒。该质粒为将pMAL-c2X载体BamHI和HindШ两个酶切位点之间的序列替换为Os02g0589400基因(SEQ ID No.2)得到的载体，命名为pMAL-Os02g0589400，为重组原核表达载体。

[0084] 二、Os02g0589400原核表达

[0085] (1)将获得的重组原核表达载体pMAL-Os02g0589400转入大肠杆菌NovaBlue(华越洋，WR4478)感受态细胞中。同时转入pMAL-c2X空载体作为对照。用含有Ampicillin的LB平板筛选阳性克隆，然后用PCR进行阳性克隆鉴定，引物为前文的F2/R2，扩增片段大小414bp。

[0086] (2)将阳性克隆接种于20mL LB液体培养基(含100μg/mL Ampicillin)中，37℃，220rpm振荡培养12-14h。

[0087] (3)按1:1000的比例(体积比)将(2)中的菌夜转接至400mL LB液体培养基(含100μg/mL Ampicillin)中，37℃，220rpm，培养至OD 600＝0.6-0.8。

[0088] (4)将菌夜取出置于冰上制冷后加入160μL浓度为500mM的IPTG，使IPTG的终浓度为0.2mM。

[0089] (5)16℃，100rpm振荡培养24h，以诱导蛋白表达。

[0090] (6)4℃，10,000rpm离心10min收集菌体。然后用柱缓冲液重悬菌体，置于-20℃冷冻过夜。柱缓冲液(1L)配方如下：NaCl 11.7g；DTT 154mg；0.5M EDTA 2mL；1M Tris-HCl(pH＝7.4)40mL；余量为水。

[0091] (7)次日待样品融化后，用超声破碎仪破碎细胞，然后10,000rpm离心10min。

[0092] (8)利用直链淀粉柱纯化目的蛋白。具体纯化过程如下：

[0093] a、利用柱缓冲液(配方见上)活化亲和柱填料(流速为1mL/min)。

[0094] b、将(7)中获得的粗蛋白上清液缓慢加入已活化的直链淀粉柱中，将流速调至约0.5mL/min，以使目的蛋白与亲和柱填料充分结合。

[0095] c、待样品都流过填料后，加入柱缓冲液冲洗多次，以去除未结合的杂蛋白。

[0096] d、加入15mL含有麦芽糖的柱缓冲液(1L柱缓冲液中含有3.6g麦芽糖)洗脱目的蛋白，重复该步骤一次。

[0097] e、将洗脱液分次加入超滤管中，每次4℃，5000rpm离心15min。

[0098] f、加入1mL 100mM Tris-HCl 4℃，5000rpm离心15min，倒掉废液。将目的蛋白溶液转入1.5mL Eppendorf离心管中。

[0099] g、吸取获得的目的蛋白溶液2μL，加入1mL Bradford(Quick StartTM Bradford 1×Dye Reagent，BioRAD，CAS 67-56-1)，利用分光光度计测量待测蛋白在595nm(OD595)处的吸收峰。并将目的蛋白的吸收值换算为蛋白浓度，得出纯化获得的Os02g0589400重组蛋白的浓度为2.03μg/μL。

[0100] h经SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色确认重组蛋白Os02g0589400大小约为90KD(图2)。

[0101] 三、Os02g0589400的体外酶活

[0102] (1)酶活反应体系为：Tris-HCl(pH 7.0，50mM，含有10mM DTT)38μL，10mM糖基受体(Os02g0589400的糖基受体为Orientin)1μL，100mM糖基供体(UDPG)1μL，步骤二获得的Os02g0589400重组蛋白10μL(Os02g0589400蛋白浓度为2.03μg/μL)。30℃水浴反应1h，然后用等体积甲醇中止反应。以加入从转入pMAL-c2X空载体的大肠杆菌中按照上述步骤二操作所得蛋白的样品为对照。

[0103] (2)酶活产物检测：将(1)中样品4℃，12,000rpm离心10min离心，取30μL用UPLC-MS(Agilent 1290UPLC-6540Q-TOF)进行检测。流动相A相：0.1％甲酸水溶液，％表示体积百分含量；B相：乙腈。洗脱梯度：0-2min：5％B-10％B，2-12min：10％B-25％B，12-18min：25％B-70％B，18-23min：70％B-90％B，23-25min：90％B-100％B，25-30min：100％B，后运行
5min，％均表示体积百分含量。流速0.3mL/min，柱温：40℃，进样量：5μL。采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式检测，载气为高纯氮气，压力40psi，温度325℃。

[0104] 检测结果表明，与空载体对照组相比，加入Os02g0589400重组蛋白的反应体系中出现一个新的色谱峰，该物质的分子量比Orientin多162，说明在体外Os02g0589400能催化Orientin发生糖基化(如图3、图4所示)。

[0105] 实施例4、Os02g0589400在水稻中的作用

[0106] 一、利用CRISPR/Cas技术创制Os02g0589400水稻突变体

[0107] 利用CRISPR/Cas载体构建试剂盒(BIOGLE，Cat#BGK03)将guide RNA(gRNA)靶点序列，通过一步反应连入CRISPR/Cas质粒中，并将其用于植物转化。具体流程如下：

[0108] (1)利用CRISPR-P网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计gRNA靶点序列(Oligo)，该靶点序列后序列特征序列为NGG序列(即PAM序列)，靶点序列长度为20bp。

[0109] Os02g0589400的靶序列1：

[0110] 5'-GGAGGCGAGCGATGTTGCGC-3'。

[0111] 对应Os02g0589400靶序列1的Oligo1序列如下：

[0112] Oligo1-F：

[0113] Oligo1-R：5'-AAACCCCGCGCAACATCGCTCGCCTCCCA-3'。

[0114] Os02g0589400的靶序列2：

[0115] 5'-ATCACATGTCATCCGCTCTC-3'。

[0116] 对应Os02g0589400靶序列2的Oligo2序列如下：

[0117] Oligo2-F：

[0118] Oligo2-R：5'-AAACCCAGAGAGCGGATGACATGTGATCA-3'。

[0119] 其中，下划线部分为载体酶切后载体特异性识别序列，方框中碱基为PAM序列。

[0120] (2)制备Oligo二聚体。将引物溶解为10μM，按照以下体系制备Oligo二聚体：Buffer Aneal 18μL，Oligo-F 1μL，Oligo-R 1μL。混匀后在PCR仪中95℃加热3min，然后降温至20℃。

[0121] (3)将Oligo二聚体与CRISPR/Cas载体连接。连接体系为：CRISPR/Cas载体2μL，Oligo二聚体1μL，Enzyme mix 1μL，加ddH2O补充反应体系至10μL。混匀后室温反应1h。

[0122] (4)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有Kanamycin的LB平板(Kanamycin浓度为50μg/mL)进行筛选。

[0123] (5)将阳性克隆进行PCR鉴定并测序。测序引物为：5'-CCCAGTCACGACGTT GTAAA-3'。

[0124] (6)将阳性克隆质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞，用含有Rifampin和Kanamycin抗性的YEB平板(100mg/L Rif，100mg/L Kan)进行筛选。挑取单菌落，进行菌液PCR鉴定，引物F3/R3，扩增片段大小481bp。

[0125] 引物F3：5'-CGAGAGCCTGACCTATTGCAT-3'；

[0126] 引物R3：5'-CTGCTCCATACAAGCCAACCAC-3'。

[0127] (7)将阳性克隆菌液按1:100比例(体积比)接种于50mL YEB液体培养基(含100mg/L Rif，100mg/L Kan)中，28℃，220rpm振荡培养至OD600＝0.5。

[0128] (8)4,000rpm离心10min集菌，并用等体积的AAM-AS培养基重悬菌体。然后侵染水稻ZH11愈伤组织，待长出转基因苗后，用潮霉素(Hyg)抗性基因引物筛选阳性植株。引物F3/R3(序列见上)，扩增片段大小481bp。

[0129] 随机选取四个阳性的突变体材料分别记作2-1、2-2、2-3和2-4。其中，2-1、2-2为导入Os02g0589400的Oligo1的阳性突变体，与野生型序列相比，这两个突变体在129bp插入碱基C/T，导致蛋白翻译提前终止；2-3和2-4为导入Os02g0589400的Oligo2的阳性突变体，与野生型相比，突变体2-3在基因组序列255bp处有碱基T缺失，而突变体2-4在基因组序列250bp后缺失5个碱基。由于碱基缺失，在突变体2-3和2-4中蛋白翻译也提前终止(图5)。

[0130] 二、Os02g0589400突变体化合物检测

[0131] (1)取材：分别取Os02g0589400突变体2-1、2-2、2-3和2-4及野生型水稻四叶期叶片，每个突变体材料各含四个生物学重复。取样后立即置于液氮中冷冻，然后用低温真空冷冻机干燥。待样品完全干燥后准确称取20mg于2.0mL Eppendorf管中。加入一粒不锈钢钢珠，用MM400球磨仪(Roach，Germany)振动频率为20Hz，打磨10min。

[0132] (2)代谢物提取。将样品用球磨仪打碎后，加入1mL预存于-20℃的提取液(甲醇)及5μL伞形酮内酯(2mg/mL)(内标)，37℃220rpm振荡提取2h。然后将提取液12,000rpm高速离心10min。吸取上清500μL于Agilent进样瓶中，然后用UPLC-MS(Agilent 1290UPLC-6540Q-TOF)进行检测。流动相A相：0.1％甲酸水溶液，％表示体积百分含量；B相：乙腈。洗脱梯度：
0-2min：5％B-10％B，2-12min：10％B-25％B，12-18min：25％B-70％B，18-23min：70％B-
90％B，23-25min：90％B-100％B，25-30min：100％B，后运行5min，％均表示体积百分含量。
流速0.3mL/min，柱温：40℃，进样量：5μL。采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式检测，载气为高纯氮气，压力40psi，温度325℃。

[0133] (3)Os02g0589400突变体化合物含量分析

[0134] 与野生型相比，Os02g0589400突变体中orientin含量显著升高，说明orientin是Os02g0589400的底物，这与体外生化的结果一致。突变体中orientin含量升高的原因是利用基因编辑使突变体中Os02g0589400基因有碱基插入或缺失，导致蛋白翻译提前终止(图5)。因此在突变体中Os02g0589400蛋白功能丧失，不能催化orientin糖基化，最终导致突变体中orientin含量积累(图6)。

[0135] 实施例5、化合物orientin外施生菜和稗草

[0136] 一、化合物orientin外施生菜和稗草实验流程

[0137] 外施实验选用生菜和稗草的原因是：生菜是文献中报道的做化感实验外施的常用指示作物，而稗草是水稻田中主要的杂草。

[0138] (1)将化合物orientin用离心浓缩仪干燥至粉末状并称重，加入适量无菌水，使其终浓度为10mg/mL。

[0139] (2)配制0.8％琼脂500mL，并将其置于高压灭菌锅中灭菌。

[0140] (3)将灭好菌的琼脂置于超净台冷却至室温(注意：不要使培养基凝固)，然后准确吸取4.75mL培养基于已灭菌的10mL离心管中。加入250μL 10mg/mL化合物溶液，使化合物的终浓度为500mg/L。将含有化合物的培养基快速倒于10cm×10cm的方形皿中，迅速摇晃方形皿，使培养基均匀的平铺于方形皿中。以在4.75mL培养基中加入250μL无菌水的培养基作为对照。

[0141] (4)将稗草和生菜种子分别用蒸馏水洗数次，然后置于无菌滤纸上干燥。

[0142] (5)待培养基凝固后，用无菌镊子放入生菜和稗草种子，每个培养皿中放入26粒种子(分为两行，每行13粒种子)。每个处理包含3个生物学重复。

[0143] (6)将放有稗草和生菜的方形皿置于28℃培养箱中黑暗培养3天。

[0144] (7)表型统计：3天后统计每个处理材料的根长。

[0145] 二、化合物外施稗草和生菜表型

[0146] 如图7所示，按照Orientin 500mg/L的浓度外施稗草和生菜，与对照相比，处理组中稗草和生菜的根长均变短。说明Orientin能显著抑制稗草和生菜的根的生长，如果适当增加Orientin的浓度，抑制效果会更加明显。

[0147] 实施例6、Os02g0589400基因敲除水稻突变体叶片水洗物外施稗草

[0148] 一、突变体及野生型材料叶片收集

[0149] 将Os02g0589400基因敲除水稻突变体及野生型ZH11材料种植于水稻生长池，待种植约60天后，收取突变体及野生型材料的叶片。

[0150] 二、突变体及野生型材料叶片水洗物提取

[0151] (1)分别取突变体2-1、2-2、2-3(见实施例4)及野生型ZH11叶片12g。

[0152] (2)将称好的叶片置于250mL锥形瓶中，加入200mL蒸馏水，用封口膜封好瓶口。将材料置于37℃摇床220rpm震摇提取4h后，将材料取出并置于室温静置约20h(注：叶片水洗物提取总时间约为24h)。

[0153] (3)将每个材料的叶片水洗物分装于4个50.0mL无菌离心管带盖中，然后置于-20℃冷冻保存。

[0154] (4)取出于-20℃冷冻保存的水洗物，并置于冷冻干燥机干燥，得到固态水洗物。

[0155] (5)待水洗物将冻干后，将每个材料对应的4个离心管中的水洗物用适量蒸馏水润洗，然后合并各个管中的水洗物，并将每个材料的水洗物定容至12.0mL，使每12mL的所述叶片水洗物溶液中含有从12g叶片中提取得到的固态水洗物。然后12,000rpm离心10min，转移上清至新的离心管中。然后置于-20℃冰箱备用。

[0156] 三、叶片水洗物外施稗草流程

[0157] 将上述获得的水洗物外施稗草，具体如下：

[0158] (1)配制0.8％琼脂500mL，并将其置于灭菌锅中高压灭菌。

[0159] (2)将灭好菌的琼脂置于超净台冷却至室温后准确吸取5.00mL培养基于已灭菌的10mL离心管中。加入1mL已制备的叶片水洗物溶液，充分颠倒混匀并快速倒于10cm×10cm的方形皿中，迅速摇晃方形皿，使培养基均匀的平铺于方形皿中。以在5mL培养基中加入1mL无菌水的培养基作为对照。

[0160] (3)待培养基凝固后，用无菌镊子放入稗草种子，每个培养皿中放入26粒种子(分为两行，每行13粒种子)。每个处理包含3个生物学重复。

[0161] (4)将放有稗草的方形皿置于28℃培养箱中黑暗培养3天。

[0162] (5)表型统计：3天后统计每个处理材料的根长。

[0163] 四、叶片水洗物外施稗草表型

[0164] 如图8所示，与野生型相比，突变体的叶片水洗物能极显著抑制稗草根的生长，这是由于突变体中Orientin的含量上升(图6)，所以突变体叶片水洗物外施稗草时会使稗草的根变短，说明Orientin在抑制稗草生长，尤其是稗草根的生长方面发挥着重要作用。