[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种QfAP1基因及编码蛋白在调控靶基因PAL表达中的应用，所述靶基因PAL为调控果实中缩合单宁合成的关键酶基因。

[0002] 单宁是一种天然的多酚类活性物质，广泛存在于植物的皮、根、叶、花、果实等组织中。根据其结构和性质，单宁可分为两类：水解单宁和缩合单宁。

[0003] 缩合单宁又称原花青素(PA)，由黄酮类化合物和黄烷‑3‑醇为结构单元聚合而成。缩合单宁有多种生物活性，如缩合单宁可与核酸、蛋白质、酶、多糖或其他物质结合，具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗寄生虫等生物活性，主要应用于化工、材料等领域。但果实中缩合单宁的存在，也会导致果实具有明显涩味，如白栎(Quercus fabri Hance)的果实俗称橡子，富含淀粉、蛋白质、可溶性糖、脂肪、维生素等营养成分，是一种可开发利用的优良木本粮食资源。但白栎果实的缩合单宁含量较高，其质量分数可高达果实的12％。因此，该果实味道具有明显涩味，不能直接食用。

[0004] 因此，对缩合单宁的生物活成途径进行研究很有必要。前人对缩合单宁生物合成的途径进行了大量研究，克隆了PAL、CHS、DFR、LAR、ANS和ANR等多个关键基因。苯丙氨酸解氨酶(PAL)和查耳酮合酶(CHS)被认为是植物缩合单宁生物合成途径早期的关键酶；无色花青素还原酶(LAR)和花青素还原酶(ANR)被认为是缩合单宁合成后期的关键酶。然而，缩合单宁的合成主要在转录水平上受到调节。

[0005] 目前参与缩合单宁合成的调控转录因子主要有MYB、bHLH和WD40蛋白，它们既可以独立发挥作用，也可以形成MBW(MYB‑bHLH‑WD40)复合物来调控缩合单宁生物合成。在拟南芥中，MBW复合物主要调控缩合单宁合成途径后期结构基因的表达水平，而缩合单宁合成途径早期结构基因如CHS、CHI和F3H的表达水平则受MYB11、MYB12和MYB111的调控。

[0006] 目前还未有专门针对果实中缩合单宁合成途径中的关键酶基因PAL的调控研究。而其作为缩合单宁生物合成途径早期的关键酶基因，对缩合单宁生物合成起到关键的作用。

[0007] MADS‑box转录因子AP1(APETALA1)基因属于植物花分生组织特征基因和花器官形态特征基因，既是花分生组织特征基因，又是花器官形态特征基因，在控制植物花分生组织特性与花器官的形成过程中起着重要的作用。关于MADS‑box转录因子AP1基因调控PAL的研究至今未见报道。

[0045] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂、载体、耗材等均为市售购买产品。

[0046] 果实中的缩合单宁含量的调控具有重要意义，以白栎果实为例，其中缩合单宁的含量较高会使果实味道很涩，不能直接食用，因此，有必要降低其果实中的缩合单宁含量。

[0047] 而靶基因PAL作为果实中缩合单宁合成途径中的早期的关键酶基因，对缩合单宁生物合成起到关键的作用。可通过对其进行调控来实现果实中缩合单宁合成的调控。

[0048] 本发明从白栎转录组数据中筛选出一个MADS‑box转录因子,该MADS‑box转录因子AP1(APETALA1)基因属于植物花分生组织特征基因和花器官形态特征基因，既是花分生组织特征基因，又是花器官形态特征基因，在控制植物花分生组织特性与花器官的形成过程中起着重要的作用。而本发明基于其进行研究，意外发现其可以调控缩合单宁合成途径中的关键酶基因PAL，进而可以调控果实缩合单宁合成途径，其在缩合单宁合成中发挥重要作用。

[0049] 下面结合具体实施例对本发明进行详细展开描述。

[0050] 实施例1QfAP1基因克隆和蛋白序列比对

[0051] 本实施例在白栎转录组数据(国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中的登录号：PRJNA913393)中筛选出一个注释为MADS‑box家族蛋白APETALA1(AP1)的转录本。

[0052] 在ORFfinder中预测并比对转录本序列，该序列具有完整的开放阅读框(ORF)。参考ORF序列设计克隆该基因的引物，并通过RT‑PCR克隆该基因。该MADS‑box基因被命名为QfAP1，长度753bp，其编码核苷酸序列如Seq ID No:1所示的核苷酸序列；编码250个氨基酸，如Seq ID No:2所示的氨基酸序列。

[0053] 与其他物种(番茄、拟南芥、加州白栎、葡萄、巴西橡胶树等)的同源蛋白比对结果表明，QfAP1中几乎80％(至少70％以上)的氨基酸是保守的(图1)。如此大量的氨基酸保守序列表明AP1在不同植物中具有非常相似的功能。

[0054] 实施例2QfAP1基因的表达水平能够正向影响果实中缩合单宁的产量[0055] 番茄中存在生物碱、萜类、黄酮类、类胡萝卜素等几类主要植物次生代谢产物，并随其生长发育而变化。因此，番茄一直被用作研究植物次生代谢途径的模式植物。本实施例在转基因小番茄Micro‑Tom(模式植物)中研究QfAP1对缩合单宁的调控。

[0056] 通过将外源QfAP1过表达质粒转入野生型(WT)Micro‑Tom植株中，并对获得的转基因植株进行阳性筛选，获得12个阳性过表达(QfAP1‑OE)株系。选取这12个阳性过表达株系中处于果实发育近中期(Stage 3)的果实进行实时定量PCR检测，发现QfAP1在QfAP1‑OE8中表达量最高，其次是QfAP1‑OE5(图2A、E)。随后，测量了这两个株系果实中缩合单宁的含量，并与野生型进行了比较。结果表明，随着QfAP1表达水平的增加，植物中缩合单宁的含量显著增加(图2B)。

[0057] 通过抑制基因的表达方式，本实施例采用敲除野生型Micro‑Tom植株中AP1同源基因，并对获得的基因编辑植株进行阳性筛选，获得6个阳性基因敲除(AP1‑KO)株系。选取这6个阳性基因敲除株系中处于果实发育近中期(Stage 3)的果实进行实时定量PCR检测，发现AP1在AP1‑KO2中表达量最低，其次是AP1‑KO1(图2C)。随后，还测量了这两个株系果实中缩合单宁的含量，并与野生型进行了比较。结果表明，随着AP1表达水平的降低，植物中缩合单宁的含量显著降低(图2D)。

[0058] 这两个实验的结果表明AP1基因的表达水平可以有效地对果实中缩合单宁的产量产生正向影响。

[0059] 实施例3QfAP1基因的过表达或敲除会改变参与缩合单宁合成途径的关键酶基因的表达水平

[0060] 本实施例选取白栎和Micro‑Tom中保守一致的缩合单宁合成途径的关键酶基因PAL、前期的CHS和后期的ANR作为研究对象。使用定量实时PCR检测分析了它们在过表达和敲除植物果实中的表达水平。研究结果表明，它们的表达趋势与AP1的表达趋势一致，也与缩合单宁的最终得率一致(图3A‑C)。还选择了缩合单宁合成途径中PAL基因紧临下游的4CL酶基因作为研究对象，分析了其表达量变化的趋势。结果也与前面几个基因的表达量变化趋势一致(图3D)。因此，推测这些基因中的一个或多个的表达水平受到AP1转录因子的调节。

[0061] 实施例4QfAP1特异性结合并激活PAL的启动子

[0062] 为了研究QfAP1是否可以调节上述基因的表达水平，本实施例首先分析了PAL、CHS、ANR和4CL基因启动子区域中MADS‑box转录因子结合元件的存在。通过对这四个基因的启动子片段进行克隆和测序，本实施例在PAL基因的2Kbp启动子范围内鉴定了几个CArG‑box元件。其中PAL的启动子序列为如Seq ID No：3所示的核苷酸序列。随后，本实施例进行了酵母单杂交检测，发现QfAP1能够与PAL启动子相结合(图4A)。

[0063] 为了进一步分析QfAP1如何调控PAL的表达，即与PAL启动子元件有效结合后对启动子片段的激活是否具有正向或负向影响，本实施例用Dual‑LUC实验进行检测。实验结果表明，在QfAP1转录因子存在的情况下，PAL启动子的活性被激活，从而完成正向调节PAL表达水平的功能(图4B)。

[0064] 随后，本实施例构建了QfAP1‑His融合载体以在原核细胞中诱导标记的靶蛋白。纯化目的蛋白后，本实施例进行EMSA实验来验证QfAP1是否能够与CArG‑box元件的标记探针结合并导致条带的迁移被阻断。同时，本实施例还检测了增加系统中未标记探针的浓度是否会导致QfAP1与标记探针的结合量的梯度下降。这些实验结果再次表明QfAP1可以直接结合PAL基因启动子中的CArG‑box元件来调节基因转录活性(图4C)。

[0065] 基于以上研究结果，本发明意外发现了QfAP1基因可以调控果实缩合单宁合成途径中的关键酶基因PAL的表达，为缩合单宁合成调控提供了一条新的途径。可以通过调控PAL的表达来调控果实缩合单宁合成途径，即调控果实中的缩合单宁的含量，如可以降低白栎果实中缩合单宁的含量，进而降低其涩味，提高其实用性。当然，基于QfAP1基因的高保守性，其也可以应用于其他植物品种的果实中缩合单宁合成途径中的关键酶基因PAL的表达调控中。可以根据实际需要进行过表达提高PAL的表达，从而实现提高果实中缩合单宁的含量，或是通过抑制表达降低PAL的表达，从而实现降低果实中的缩合单宁含量。

[0066] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围。