技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及LhBBM基因的应用。
相关背景技术
[0002] 杂交鹅掌楸(Liriodendron hybrid)是鹅掌楸(Liriodendron)和北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)的杂交种，其木材性状优良，是重要的用材树种，并且其适应能力强，具有较强的耐寒性，成为重庆、四川、福建、河南等多个省市的国家公益储备林建设树种。除此之外，其叶形独特，为马褂状，花朵艳丽为黄色，具有非常高的观赏价值，因此在园林中也有广泛应用。但杂交鹅掌楸自身繁殖能力差，其育种手段通常是人工杂交育种，受到季节和气候等因素限制，影响了其推广应用，因此，在过去二十多年的研究中，南京林业大学细胞工程团队建立了高效的杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生繁殖体系，对于该树种大规模的推广应用具有重要的意义。随着杂交鹅掌楸不断推广应用，利用基因工程和基因编辑技术对其进行遗传改良，培育优质、速生、抗逆新品种成为迫切需求。杂交鹅掌楸‘南林‑南森E1号’具有速生、优良材质、抗逆性强、生长快、干型好、材性优等优点，但杂交鹅掌楸良种还未构建高效的体胚发生体系和合适的遗传转化体系。因此，建立杂交鹅掌楸高效遗传转化体系以及缩短其遗传转化的周期具有重要意义。
[0003] Baby Boom转录因子是植物全能性的关键调节因子，该基因可以促进细胞的增殖与再生，在不同植物中，过表达BBM可以促进植物的细胞增殖以及再生能力，对于植物的生长发育是一个重要的标记基因。Baby Boom基因的作用主要体现在调控基因表达，参与分化体细胞诱导和体细胞胚胎形成，提高胚胎细胞能力及促进植物再生等方面。在单子叶植物中，过表达BBM具有促进遗传转化效率的能力，BBM在胚性组织中特异表达；在模式植物拟南芥中，过表达BBM具有促进芽再生和体细胞胚发生的能力。对杂交鹅掌楸良种中进行LhBBM基因的研究，对遗传转化的研究有重要的意义。
具体实施方式
[0025] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无详细说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0026] LhBBM基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0027] 以下实施例使用的材料如下：
[0028] 继代培养18d左右的LhBBM基因过表达胚性愈伤组织、非转基因杂交鹅掌楸(WT)愈伤组织、LhBBM基因过表达杂交鹅掌楸植株、普通(WT)杂交鹅掌楸植株材料，以上材料均保存于南京林业大学林学院分子实验室。
[0029] 农杆菌菌株为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105株系，表达载体为pBI121，筛选标记基因为nptII，报告基因为H2B‑mCherry。
[0030] 以下实施例采用新型植物基因组提取试剂盒(DP320)(TIANGEN)提取愈伤组织及再生植株的DNA。因LhBBM基因是作为“利他型”方式来促进遗传转化效率，因此统计共转35S:LhBBM和35S:H2B‑mCherry时再生植株中仅含35S:H2B‑mCherry的植株比例以及其细胞荧光率即可；过表达LhBBM基因只需检测其最终细胞的阳性转化率即可。引物序列如下所示：
[0031] H2B‑mCherry‑F：5'‑GAGCGCAACGCAATTAATGTG‑3'，
[0032] H2B‑mCherry‑R：5'‑CTCGTAAACTTCGTAACCGCC‑3'。
[0033] 取抗生素G418 80mg/L筛选的阳性愈伤进行PCR检测。对PCR检测为阳性的愈伤组织进行体胚诱导，经过G418筛选，获得G418抗性植株，统计再生植株的阳性率。
[0034] 实施例1
[0035] 过表达LhBBM是体内发生作用，通过过表达LhBBM促进遗传转化。
[0036] 通过预转LhBBM获得LhBBM‑OE良种愈伤，再转化H2B‑mCherry；其对照为预转GUS获得良种愈伤后再转H2B‑mCherry。统计再生植株中含H2B‑mCherry的细胞荧光率。
[0037] 1、过表达LhBBM基因对良种转基因阳性愈伤组织新增阳性愈伤的分析[0038] 在非转基因杂交鹅掌楸(WT)愈伤组织中转入LhBBM基因获得LhBBM‑OE良种愈伤；然后向良性愈伤中转入荧光报告基因H2B‑mCherry，构建LhBBM+H2B‑mCherry基因过表达胚性愈伤组织，作为实验组。在非转基因杂交鹅掌楸(WT)愈伤组织中转入GUS基因获得GUS‑OE良种愈伤；然后向良性愈伤中转入荧光报告基因H2B‑mCherry，再，构建GUS+H2B‑mCherry基因过表达胚性愈伤组织，作为对照组。
[0039] 愈伤经过侵染之后呈现出褐色，将愈伤置于23℃暗培养。
[0040] 结果如图1所示，与对照组(过表达GUS基因)相比，实验组(过表达LhBBM基因)新增愈伤面积比原始材料扩大一倍的占比明显升高，达到59％，而对照组仅为50％。
[0041] 2、过表达LhBBM基因对阳性细胞放光率的分析
[0042] 将愈伤置于23℃暗培养，获得阳性愈伤后，将愈伤进行7天悬浮培养后，过筛获得单细胞，利用共聚焦显微镜观察细胞的荧光发光率。
[0043] 结果如图2所示，过表达LhBBM基因后细胞阳性率(62％)高于对照组(50％)，结果表明，过表达LhBBM基因显著促进遗传转化效率的提升。
[0044] 实施例2
[0045] LhBBM作为一种“利他剂”即是一种体外辅助剂，在体外发生作用。
[0046] LhBBM作为一种“利他剂”，将35S：LhBBM的农杆菌菌液与带有目的基因35S：H2B‑mCherry的农杆菌菌液1:1等量混合(即35S：LhBBM的农杆菌菌液15ml以及35S：H2B‑mCherry的农杆菌菌液15ml等量充分混合)后进行愈伤侵染以此获得阳性愈伤。统计共转35S:LhBBM和35S:H2B‑mCherry时再生植株中仅含35S:H2B‑mCherry的植株比例以及其细胞荧光率。
[0047] 1、LhBBM基因对良种转基因阳性愈伤组织增殖的分析
[0048] 将共转35S:LhBBM+35S:H2B‑mCherry基因以及其对照组的愈伤放置在含有头孢(400mg/L)和G418(80mg/L)的培养基上，置于23℃暗培养，愈伤颜色呈现出褐色，颗粒松散。
[0049] 结果如图3所示，共转35S:LhBBM+35S:H2B‑mCherry基因可以提高遗传转化的效率，促进阳性愈伤的快速增殖；实验组(共转35S:LhBBM+35S:H2B‑mCherry基因)与对照组(共转35S:GUS+35S:H2B‑mCherry基因)的新增愈伤占比分别为62％及52％。
[0050] 2、LhBBM基因对阳性细胞放光率的分析
[0051] 将置于23℃暗培养中新增的阳性愈伤进行7天悬浮培养，获得单细胞后放置在共聚焦显微镜下观察细胞的发光率。
[0052] 结果如图4所示，LhBBM基因缩短了阳性愈伤的恢复时间，在35天时实验组(共转35S:LhBBM+35S:H2B‑mCherry基因)的新增愈伤占比高，之后对新增阳性愈伤进性荧光发光率观察，结果表明，实验组(共转35S:LhBBM+35S:H2B‑mCherry基因)的荧光率高于对照组(共转35S:GUS+35S:H2B‑mCherry基因)，荧光发光率分别是70％和66％，该结论与新增阳性愈伤占比结果相对应。
[0053] 综上所述，LhBBM基因提高了阳性愈伤的遗传转化效率。
[0054] 3、植株再生
[0055] 将获得的阳性愈伤进行铺苗试验，统计植株再生数量。
[0056] 将新增的阳性愈伤进行悬浮培养14d，过筛获得单细胞后进行体胚发生，以此获得阳性植株。
[0057] 结果如图5所示，实验组(共转35S:LhBBM+35S:H2B‑mCherry基因)的植株再生数量与对照组(共转35S:GUS+35S:H2B‑mCherry基因)无明显差异；实验组(共转35S:LhBBM+35S:H2B‑mCherry基因)再生植株中仅含35S:H2B‑mCherry的植株比例占93％，显著高于对照组(共转35S:GUS+35S:H2B‑mCherry基因)仅含35S:H2B‑mCherry的植株比例(87％)。
[0058] 综上所述，LhBBM基因显著提高良种的遗传转化效率，且可通过采用“利他”型转化方法，将LhBBM作为一种外源辅助剂来促进转化，获得不含35S:LhBBM的转基因再生植株。
[0059] 以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围。
