[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组耐高温脂肪酶PFHL、表达该酶的重组菌株及其应用。

[0002] 脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)是一种三酰基甘油酯水解酶，其主要作用是在油水界面催化长链甘油三酯水解为甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸。除了能够催化甘油酯类化合物的水解之外，脂肪酶还可以用于催化酯合成、酯交换、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚合物的合成以及药物的合成等方面，具有催化多样性和底物专一性等特征，在粮油生产、食品工业、造纸工业、日用化学工业、农业化学工业、洗涤剂工业以及药物合成等许多领域得到广泛应用。

[0003] 脂肪酶在酶制剂中销量第三，仅次于蛋白酶和淀粉酶。目前工业应用的脂肪酶主要来源于酵母和细菌，最适温度和pH范围多为35～45℃和6.5～8.0，适应中低温和偏中性的应用环境。但中低温脂肪酶在工业应用中存在一些普遍问题，如高温或碱性等条件下易失活等，这在一定程度上限制了脂肪酶的工业应用。对于脂肪酸链长的水解特异性，目前已报道的绝大多数脂肪酶都是优先识别短链脂肪酸，仅有少数能催化长链脂肪酸发生反应，并且在实际生产过程中仍存在活性不高，热稳定性欠佳，特异性不高等问题。且随着微生物脂肪酶工业化应用的不断发展，市场对脂肪酶制剂的各项性质和指标却又提出了更高的要求，如对不同的最适温度和pH值、较高的温度稳定性和酸碱耐受性、理想的催化活性和反应专一性、非常规溶剂(有机溶剂、离子液体等)的耐受性等，因此仍然迫切需要挖掘及表征新型性能优良的脂肪酶制剂资源，使其能更好地满足工业需求。

[0027] 下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场采购获得的常规产品。

[0028] 下述实施例所用的引物合成及测序工作均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。所用的蛋白表达载体为pET‑28a(+)(购自武汉淼灵生物科技有限公司)，所用的大肠杆菌BL21和DH5α购自上海生工生物工程。

[0029] 实施例1：脂肪酶基因的克隆与重组质粒的构建

[0030] 将来源于荧光假单胞菌的脂肪酶基因按照大肠杆菌偏好性进行密码子优化，得到核苷酸如SEQ ID NO:1所示的脂肪酶基因Pfhl片段，所述脂肪酶基因Pfhl的GC含量为50.23％，密码子适应性指数为0.70。

[0031] 将脂肪酶基因Pfhl提交至苏州金唯智生物科技有限公司进行目的基因片段的合成，然后以合成的基因片段为模板，通过PCR利用一对正反向引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)对目的基因进行扩增，该程序进行28‑35个循环，待PCR反应结束后，取45μL反应产物进行1％琼脂凝胶电泳，对照DNAMaker，观察PCR结果。将pET‑28a(+)空载质粒用引物进行反向PCR，将得到的线性化载体与经纯化后的目的片段进行无缝克隆，得到携带有基因Pfhl的核苷酸片段的重组质粒，所述重组质粒如图1所示。其中，PCR反应体系如表1所示，PCR扩增程序设置如表2所示。

[0032] 表1.PCR反应体系

[0033] 试剂 体积2×Phanta Flash Master Mix 25μL
上游引物 2.5μL
下游引物 2.5μL
DNA模板 1μL
ddH2O 19μL

[0034] 表2.PCR扩增程序

[0035]循环步骤 温度 时间
预变性 98℃ 30sec
变性 98℃ 10sec
退火 Tm 5sec
延伸 72℃ 4‑5sec/kb
彻底延伸 72℃ 1min

[0036] SEQ ID NO.1:

[0037] atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatATGAACATGGATGCCAGCACCCAGTATCCGATTGTGCTGGTGCATGGCCTGTTTGGCTTTGATACCATTGCCGGTTATCCGTATTTTTTTGATATTAAAGAGGCGCTGGAATATGCAGGTGCACGTGTGTTTGCAGTTAATATTCCGGCAGTGAATGGTAATGAAGAACGTGGTGAAAAACTGCTGGAACAGGTGAATCGCATTCTGCAGGAAACCGGTGCCGCCCGCGTTAATCTGATTGGCCATAGCCAGGGCCCGCTGGCCGCCCGTTATGTGGCTGCACTGTATCCGGAAAAAGTTGCCAGCGTTACCAGTGTGAGTTGTCCGAATCATGGTAGCGAAATTGCAGATCAGCTGCATAAAGCCCTGACCCCGGGTGAACTGCCGGAAGCCTTTGCCCTGGCACTGCTGAGCGCCGTGGGTACCTTTATTAGCCTGATTAGTGGTCATCCGAAAAATCCGCAGGATCCGCAGGCAGCCTTTGAAAGTCTGACCAGTGCCGGTCTGGCCGAATTTAATCGCAAATATCCGCAGGGCGTTCCGAAAGTGTGGGGCGGTGAAGGTAATGAAATTGAAAATGGTGTTTACTACTACAGCTGGAGCGGCATTCTGCAGAATTTTCAGACCCCGCAGATTCTGGATCCGACCCATATTAATTGCATTGTGCTGAGCAAACTGTTTTATAAAGAAAAAGACGCAAACGATGGCCTGGTTGGCCGCTATAGTAGTCATCTGGGCAAAGTTATTCGCAGTGATTATCCGATGGATCATTTTGATGCCGTGAATCAGATGGCCGGCATTACCAGCTGGAATGTGAGCCCGGTGAGTCTGTATGTGGAACATGCCGTTCGCCTGAAAAGCAAAGGCCTGtaa；

[0038] SEQ ID NO.2：

[0039] MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMNMDASTQYPIVLVHGLFGFDTIAGYPYFFDIKEALEYAGARVFAVNIPAVNGNEERGEKLLEQVNRILQETGAARVNLIGHSQGPLAARYVAALYPEKVASVTSVSCPNHGSEIADQLHKALTPGELPEAFALALLSAVGTFISLISGHPKNPQDPQAAFESLTSAGLAEFNRKYPQGVPKVWGGEGNEIENGVYYYSWSGILQNFQTPQILDPTHINCIVLSKLFYKEkDaNDGLVGRYSSHLGKVIRSDYPMDHFDAVNQMAGITSWNVSPVSLYVEHAVRLKSKGL；

[0040] SEQ ID NO:3：

[0041] ccgcgcggcagccatATGAACATGGATGCCAGCAC；

[0042] SEQ ID NO:4：

[0043] ggtgctcgagttaCAGGCCTTTGCTTTTCAGGC；

[0044] 实施例2：重组耐高温脂肪酶PFHL的诱导表达

[0045] 将实施例1中获得的重组质粒转化入大肠杆菌中进行异源表达，具体步骤如下：

[0046] 取10μL重组质粒加入100μL感受态细胞E.coli DH5α离心管中，冰浴30min，迅速至42℃热激1min，立即置于冰上2min。然后加入新鲜LB培养基，复苏培养1h，5000rpm离心
5min，弃掉900μL上清，剩余菌体涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体平板，并置于37℃培养箱培养，得到阳性克隆子。

[0047] 将阳性克隆子接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB试管培养基，37℃摇床培养，提取质粒，凝胶电泳与标准Marker条带比对鉴定条带大小，并测序。比对正确的pET‑28a(+)‑Pfhl的菌株加等体积20％甘油于‑80℃保藏菌株，正确质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建表达菌株，得到E.coli BL21(DE3)(pET‑28a(+)‑Pfhl)，诱导表达。

[0048] 将E.coli BL21(DE3)(pET‑28a(+)‑Pfhl)测序结果比对正确的新鲜菌液按1％(v/v)比例转接于含有50mg/mL浓度Kan的50mL LB培养基三角瓶液体中，37℃培养至OD600nm为0.6‑0.8，补加终浓度为0.5mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，于16℃、100rpm低温诱导培养24h。然后离心收集菌体，菌体沉淀用pH8.0的20mM PBS缓冲液重悬洗涤2次，置于冰水浴中超声破碎细胞(总时长约30min，工作3s，间隔5s)，当菌液由粘稠状态变为透亮即可，
10000rpm离心10min，取上清液和沉淀物用电泳缓冲液煮沸后经SDS‑PAGE凝胶电泳验证蛋白表达情况，表达后得到重组耐高温脂肪酶PFHL。

[0049] 从图2可以看出，与泳道1的E.coli BL21(DE3)(pET‑28a(+))空载体的蛋白情况相比较，泳道2和泳道3中在33.8kDa处有一条明显的蛋白条带，说明E.coli BL21(DE3)[0050] (pET‑28a(+)‑Pfhl)在IPTG的诱导下成功表达重组脂肪酶蛋白PFHL。蛋白PFHL分子质量为31.7kDa，但由于携带6×His标签及标签切割位点，因此重组后的分子质量预测为33.8kDa，与SDS‑PAGE结果图相符。

[0051] 实施例3：重组脂肪酶PFHL的纯化

[0052] 实施例2中诱导表达的产物重组耐高温脂肪酶PFHL两端带有His标签，可采用Ni2+‑NTA亲和层析柱对此进行纯化，具体步骤如下所述：

[0053] 首先，使用5mL去离子水冲洗层析柱，随后再使用3mL的Binding Buffer冲洗层析柱，以此平衡柱床填充物。将离心得到的上清液，即粗酶液重复多次载入柱中，尽可能地使蛋白与树脂结合，随后使用3mL的20mM咪唑浓度Washing Buffer冲洗层析柱，以洗去大部分无法与树脂结合的杂蛋白。目的蛋白PFHL使用5mL的500mM咪唑浓度Elution Buffer进行洗脱，并用1.5mLEP管收集洗脱液，即为纯酶液。

[0054] 利用BCA蛋白浓度测定法测定纯化后的重组耐高温脂肪酶PFHL的浓度，将纯化后的重组耐高温脂肪酶PFHL稀释至相应倍数并进行显色反应，待显色稳定后即可测定OD595nm，根据标准曲线即可得到重组耐高温脂肪酶PFHL的蛋白浓度。

[0055] 由图2可看出该重组蛋白在表达菌株中已经成功诱导表达，并且经过Ni2+‑NTA亲和层析柱纯化，可得到一条纯净单一的条带(如图2中的泳道4所示)，表明目的蛋白纯化成功，并对稀释后纯酶测定其蛋白浓度为1.06mg/mL。

[0056] 实施例4：重组耐高温脂肪酶PFH的酶学性质

[0057] 本实施例以对硝基苯酚棕榈酸酯为反应底物，通过p‑NP法测定不同温度、不同pH下纯化后重组耐高温脂肪酶PFHL的活性，以此来考察纯化后重组耐高温脂肪酶PFHL的酶学性质。

[0058] (1)不同温度对重组耐高温脂肪酶PFHL的活性的影响：

[0059] 以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物，分别向pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液加入纯化稀释后酶液，设置3个平行，然后分别放入温度为20～70℃的水浴锅中进行反应，将其中最高酶活力设为100％，计算其他条件下的相对酶活，结果如图3所示。并测定其热稳定性即半衰期，将等体积的酶液分别置于不同温度的水浴中保温，每隔2h取样测定酶活，将其中最高酶活力设为100％，计算其他条件下的相对酶活，结果如图4所示。

[0060] 从图3可以看出，在20～90℃温度范围内，重组耐高温脂肪酶PFHL酶活呈现为先增加后降低的趋势，其中，重组耐高温脂肪酶PFHL的最适反应温度为60℃，相对酶活力最高，设为100％。在50～80℃，相对酶活力维持在80％以上；而在低于40℃时相对酶活力随温度的降低而下降。这表明重组耐高温脂肪酶PFHL对高温耐受性更强，更适合于工业应用；而对低温更加敏感，在低温环境下，重组耐高温脂肪酶PFHL的酶活力将受到很大抑制。

[0061] 从图4可以看出，重组耐高温脂肪酶PFHL在50～70℃下孵育2h内残余酶活均保持在70％以上，在最适反应温度为60℃时的半衰期为2.3h，具有良好的温度稳定性。

[0062] (2)不同pH对重组耐高温脂肪酶PFHL的活性的影响：

[0063] 为测定不同pH对该脂肪酶的影响，分别配制50mmol/L不同pH值如pH6.0～8.0的PBS缓冲液、pH8.0～9.0的Tris‑HCl缓冲液和pH 9.0～11.0的Gly‑NaOH缓冲液作为反应体系，以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物，分别在37℃水浴锅中进行反应，将其中最高酶活力设为100％，计算其他条件下的相对酶活，结果如图5所示。

[0064] 从图5可以看出，在pH为6.0～11.0的范围内，脂肪酶酶活呈现为先增加后降低的趋势，其中，脂肪酶PFHL的最适反应pH为7.0，相对酶活力最高，设为100％；并且在pH 7.0～10.0的碱性反应环境下具有较高的酶活性，其相对酶活力均保持在70％以上，但在酸性条件下酶活力迅速下降，仅为其在碱环境下酶活力的一半。

[0065] 综上所述，表明重组脂肪酶PFHL最适的反应温度为60℃，为高温脂肪酶，并且在50‑80℃下仍具有较好的酶活力，具有一定的温度耐受性。其最适的反应pH为7.0，在pH 
7.0‑10.0内酶活力稳定，有一定的耐碱性。因此该酶属于耐热耐碱脂肪酶，在高温和碱性环境下催化反应会具有较好的应用前景。

[0066] 实施例5：重组脂肪酶PFHL的脂肪酸特异性研究

[0067] 本实施例以不同烷基碳链长度的对硝基苯酚脂肪酸酯(p‑NPC2、p‑NPC4、p‑NPC8、p‑NPC12、p‑NPC16、p‑NPC18)为底物，在pH 7.0和温度60℃的条件下考察了脂肪酶PFHL的脂肪酸链长特异性，从图6可以看出，脂肪酶PFHL对中链脂肪酸酯p‑NPC12特异性最好，其相对酶活随着脂肪酸碳链长度的降低而不断降低。对于短链脂肪酸酯p‑NPC2、p‑NPC4特异性较低，水解活性比p‑NPC12水解活性降低86.32％和68.10％；对长链脂肪酸酯p‑NPC16特异性也较好，水解活性仅仅比p‑NPC12水解活性降低9.21％。因此，可看出脂肪酶PFHL对中长链的脂肪酸酯具有较好的特异性，尤其是对p‑NPC12和p‑NPC16的水解活性最高。

[0068] 综上所述，本发明对脂肪酶基因进行密码子优化，然后基于优化后的基因设计了用于大量特异性扩增脂肪酶的引物，并构建了表达该酶的重组菌株，诱导表达，得到重组耐高温脂肪酶PFHL；所述重组耐高温脂肪酶PFHL最适催化反应温度为60℃，并且在50～80℃的温度范围下反应仍能保持80％的活性，在pH7.0～10.0的反应pH下反应仍能保持70％的活性；所述脂肪酶还具对中长链脂肪酸酯底物具有偏好特异性，利用脂肪酶水解甘油酯所产生的不同中长链脂肪酸具有不同的功能，具有很好的实用性。所述重组耐高温脂肪酶PFHL可用于满足各种高热的工业应用，如在保健食品、药物合成、油脂改性、生物柴油、洗涤剂及造纸等工业。

[0069] 所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。