[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株及其构建方法和应用。

[0002] 2‑酮葡萄糖酸盐(2‑ketogluconic acid，2KGA)是一种在工业上通过生物氧化葡萄糖而制备的有机酸，可以直接用作水泥增塑剂、水泥缓凝剂、洗涤剂的增涤剂以及作为饲料富钙添加剂的重要组分，也可作为手性化合物和杂环化合物合成的重要砌块，但其目前最为重要的工业用途是作为合成抗氧化剂D‑异抗坏血酸及其盐类的前体。

[0003] 假单胞菌(Pseudomonas)、葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、醋酸杆菌(Acetobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)等微生物的细胞质膜上具有葡萄糖的直接氧化系统(葡萄糖的胞外氧化途径)，能够在细胞的周质空间中较为高效地氧化葡萄糖为2KGA。其中，假单胞菌大多具有适应不同理化环境和营养环境、显著耐受内源性和外源性胁迫、能够更为高效安全地转化葡萄糖为2KGA等特征，因而在国际上2KGA工业发酵生产中得到了普遍采用。但是，假单胞菌工业发酵生产2KGA的产率和效率还有待提高。

[0037] 本发明提供了3‑磷酸甘油醛脱氢酶在调控变形假单胞菌生物合成2‑酮葡萄糖酸盐中的应用；所述3‑磷酸甘油醛脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

[0038] 本发明还提供了敲除或沉默gapA基因或者gapA基因的片段的试剂在促进变形假单胞菌生物合成2‑酮葡萄糖酸盐中的应用；所述gapA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0039] 在本发明中，所述敲除或沉默gapA基因的片段序列的长度以能够使3‑磷酸甘油醛脱氢酶不能表达为准；所述敲除或沉默gapA基因的片段序列的长度优选的至少为800bp；在本发明中，所述gapA基因片段优选的至少包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

[0040] 在本发明中，所述变形假单胞菌包括变形假单胞菌J‑T3；所述变形假单胞菌J‑T3的保藏编号为CGMCCNo.22137。

[0041] 在本发明中，所述敲除或沉默gapA基因或者gapA基因的片段的试剂优选的包括重组自杀质粒；所述重组自杀质粒优选为将线性化的pK18mobsacB与gapA基因上下游同源臂融合片段进行连接得到；所述gapA基因上下游同源臂融合片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0042] 本发明还提供了一种变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株，是在变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)J‑T3的基础上敲除或沉默gapA基因或者敲除或沉默gapA基因的片段序列得到的；所述gapA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述变形假单胞菌J‑T3的保藏编号为CGMCCNo.22137。

[0043] 在本发明中，变形假单胞菌J‑T3的gapA基因全长1002bp，编码由333个氨基酸残基组成的3‑磷酸甘油醛脱氢酶。该酶是参与糖酵解和糖异生途径的NAD结合酶，理论分子质量为36.15kDa，定位于细胞质内。

[0044] 在本发明中，gapA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示核苷酸序列)具体为：

[0045] atgacccttcgcatcgccatcaatggatttggccgcatcggacgcaacgtcctgcgcgcactctatacccaaggctaccgccaggacctgcaggtcgtcgccatcaacgacctgggcgacagtgcgatgaacgcccacctgctcaagtacgacagcgtgcacggcacgttcgaggccagcgtcgaagccgaccaggagagcctgacggtcaacggtgaccgcatctcggtcagtgccatccgcaacccggcagagctgccgtggaaggccgagggcgtggatgtagtgttcgaatgcaccggcctgttcaccgaccgggccaaggccgccgcccacctggccgccggggcacgcaaggtgatcgtctcggcacctgccaagggcgccgacgccacggtggtctacggggtcaaccatgacagcctgcgagcctcgcaccagatcatctccaacgcctcctgcaccaccaactgcctggcaccgatcgcccaggtcctgcaccgcgagttcggcatcgagcaagggttgatgaccaccatccacgcctataccaatgaccaggtgctcaccgacgtctaccacagcgacccttaccgggcgcgctcggccacccagtcgatgatcccgagcaagaccggcgccgccgaggccgtgggcctggtgctgccggaactggccggaaagctcaccggcatggccgtgcgggtgccggtgatcaacgtatcgctggtggacctgaccgtgaacctcaggcgcgaagccaccgccgagcaggtcaaccaactgttcctcgaggccagccggcactcccgggtattgggctacaacgcgttgccgctggtgtcgtgcgacttcaaccacaacccgttgtcgtcgatcttcgatgccaaccatacccgggccagcggaaggatgctcaaggtgctggcctggtacgacaacgagtggggcttctccaaccgcatgctggataactgtctggcgttgtgcaacgcccgctga。

[0046] 在本发明中，3‑磷酸甘油醛脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：

[0047] MTLRIAINGFGRIGRNVLRALYTQGYRQDLQVVAINDLGDSAMNAHLLKYDSVHGTFEASVEADQESLTVNGDRISVSAIRNPAELPWKAEGVDVVFECTGLFTDRAKAAAHLAAGARKVIVSAPAKGADATVVYGVNHDSLRASHQIISNASCTTNCLAPIAQVLHREFGIEQGLMTTIHAYTNDQVLTDVYHSDPYRARSATQSMIPSKTGAAEAVGLVLPELAGKLTGMAVRVPVINVSLVDLTVNLRREATAEQVNQLFLEASRHSRVLGYNALPLVSCDFNHNPLSSIFDANHTRASGRMLKVLAWYDNEWGFSNRMLDNCLALCNAR。

[0048] 在本发明中，所述敲除或沉默gapA基因的片段序列的长度以能够使3‑磷酸甘油醛脱氢酶不能表达为准；所述敲除或沉默gapA基因的片段序列的长度优选的至少为800bp；在本发明中，所述gapA基因片段优选的至少包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；SEQ ID NO.2所示核苷酸序列长度为929bp，具体为：

[0049] tcggacgcaacgtcctgcgcgcactctatacccaaggctaccgccaggacctgcaggtcgtcgccatcaacgacctgggcgacagtgcgatgaacgcccacctgctcaagtacgacagcgtgcacggcacgttcgaggccagcgtcgaagccgaccaggagagcctgacggtcaacggtgaccgcatctcggtcagtgccatccgcaacccggcagagctgccgtggaaggccgagggcgtggatgtagtgttcgaatgcaccggcctgttcaccgaccgggccaaggccgccgcccacctggccgccggggcacgcaaggtgatcgtctcggcacctgccaagggcgccgacgccacggtggtctacggggtcaaccatgacagcctgcgagcctcgcaccagatcatctccaacgcctcctgcaccaccaactgcctggcaccgatcgcccaggtcctgcaccgcgagttcggcatcgagcaagggttgatgaccaccatccacgcctataccaatgaccaggtgctcaccgacgtctaccacagcgacccttaccgggcgcgctcggccacccagtcgatgatcccgagcaagaccggcgccgccgaggccgtgggcctggtgctgccggaactggccggaaagctcaccggcatggccgtgcgggtgccggtgatcaacgtatcgctggtggacctgaccgtgaacctcaggcgcgaagccaccgccgagcaggtcaaccaactgttcctcgaggccagccggcactcccgggtattgggctacaacgcgttgccgctggtgtcgtgcgacttcaaccacaacccgttgtcgtcgatcttcgatgccaaccatacccgggccagcggaaggatgctcaaggtgctggcctggtacgacaacgagtggggcttctccaaccgcatg。

[0050] 在本发明中，J‑T3菌株gapA基因的上、下游核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：

[0051] cgtagaaagtacaggtgcccgggctgtggtaggacttcatctccgattccaacagctcctcgcggctggccttgccttcggcgtagcgctggcgcacgtcagccttttccttgttggagatgcccgacggcatcggcccacccggtacgaagatagtcggcaggtgaccgaagcgcagggcgcccatcatcaggccggggacaatcttgtcgcagatacctagcatcagcgccgcatcgaacatgttgtgcgacagcgcgatggccgtggacagggcgatcacctcgcggctggcgatggccagctccatgcccggctcgccttgggtgacgccgtcgcacatggccggcacgccaccggcgaactgcccgaccgagccgatctcgcgcagggcctgcttgatctgttccgggaagtgctggtacggctggtgggccgagagcatgtcgttgtaggccgagacgatggccacgttggcggcgttcatcatgcgcaggctttgcttgtcctgggcgccacagccggccacgccatgggcgaagttcgcacattgcaggctggcgcgcatggggccgtcgctggccgcgccgcgaatcagctccaggtagcgttcacgggtggcacggctgcgttcgaccaaccgttcggtgacctcaaggatgcgcggatgcatgtactggactccaggctaactgtggggtggtgtcttcgggcatttcccctccaaacgattgcggcctaggctcaaggtgagggtgcctgacgcgatcaaggggtggtctgcccgaccactcgttgtaggtttaacaaaatactgccatcaaaaaggcttgttttctatcctgcgaggaataatcttgtaattccaataacaaaaccgtttcagtgaagtcacctttttgccacaggcttcacccggaccgccagaggtaatgccatgacccttcgcatcgccatcaatggatttggccgcatcggacgcaacgtcctgcgcgcactctatacccaaggctaccgccaggacctgcaggtcgtcgccatcaacgacctgggcgacagtgcgatgaacgcccacctgctcaagtacgacagcgtgcacggcacgttcgaggccagcgtcgaagccgaccaggagagcctgacggtcaacggtgaccgcatctcggtcagtgccatccgcaacccggcagagctgccgtggaaggccgagggcgtggatgtagtgttcgaatgcaccggcctgttcaccgaccgggccaaggccgccgcccacctggccgccggggcacgcaaggtgatcgtctcggcacctgccaagggcgccgacgccacggtggtctacggggtcaaccatgacagcctgcgagcctcgcaccagatcatctccaacgcctcctgcaccaccaactgcctggcaccgatcgcccaggtcctgcaccgcgagttcggcatcgagcaagggttgatgaccaccatccacgcctataccaatgaccaggtgctcaccgacgtctaccacagcgacccttaccgggcgcgctcggccacccagtcgatgatcccgagcaagaccggcgccgccgaggccgtgggcctggtgctgccggaactggccggaaagctcaccggcatggccgtgcgggtgccggtgatcaacgtatcgctggtggacctgaccgtgaacctcaggcgcgaagccaccgccgagcaggtcaaccaactgttcctcgaggccagccggcactcccgggtattgggctacaacgcgttgccgctggtgtcgtgcgacttcaaccacaacccgttgtcgtcgatcttcgatgccaaccatacccgggccagcggaaggatgctcaaggtgctggcctggtacgacaacgagtggggcttctccaaccgcatgctggataactgtctggcgttgtgcaacgcccgctgatcgcgggcagggccttgtgggagtgggcttgtcccgcgattaggcggcactgccaatacagttcatggcaagggcttcgcccttgatcgcgggacaagcccgctcctacaggcatcgccagcagattcgcgccgatagcatgttggacttgaccaatagggcagatgataagcattatcattcgcctctcgttggtcaggttttcccgtgagtcagtcccgcttcgataccgtcttcctcacccagcgccttaccttgctgcgcacactgcagcgcatggtcggcaaccccagcacggccgaggacctactgcaggaaacctacctgcgggtcacccgtgccctgggcgagcggccgatcgagcacctcgagcccttcgtgttccagacggcgcgcaacctcgccctggaccacctccgtgcacgcaaggtgcaggcacgtacattggtcgacgatgtgcccgacgacatcctgtacaacgtcgctgcccccaccaccagcaacgaagatgccgcccacgccgagcagttgctcgagcgcttgagcatcagcctcggtcagttgaccccgcgccaacaacgtatcttcatcctcagccgcctgcatggcgccagctacctggaaatcgccgaccagctgaaggtttcggccagcaccgtgcagaaggagctcaagctgatcatggcgatctgcatgggcgtggccgagcgcctcgaataaccgccactcgccggtcggcccaggcaaggcgcttgccatggcttcgcgcagccgtgatcatttgcgaaaagacctacagcaaggattcttcgtgacagacagccctgcctctcgcccatcacctgcagggcctgacgcccgtgccatggacgaggcgatggactggct，其中下划线序列为gapA基因的全长序列。

[0052] 本发明还提供了上述方案所述变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株的构建方法，包括以下步骤：

[0053] 将线性化的pK18mobsacB与gapA基因上下游同源臂融合片段进行连接，得到重组自杀质粒；所述gapA基因上下游同源臂融合片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

[0054] 将所述重组自杀质粒转入变形假单胞菌J‑T3的感受态细胞后，涂布于含有50μg/L卡那霉素的LB固体培养基上培养，得到带有卡那霉素抗性基因的重组菌株；

[0055] 将所述的带有卡那霉素抗性基因的重组菌株涂布于含有0.1g/mL蔗糖的LB固体培养基上，进行培养，得到变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株。

[0056] 本发明首先将线性化的pK18mobsacB与gapA基因上下游同源臂融合片段进行连接，得到重组自杀质粒。

[0057] 在本发明中，所述线性化的pK18mobsacB的制备方法优选的包括以下步骤：

[0058] 以pK18mobsacB为模板，利用P5引物和P6引物进行反向扩增，得到反向扩增产物；对所述反向扩增产物进行凝胶电泳，切胶回收目的片段，得到线性化pK18mobsacB。在本发明中，所述目的片段的长度为5719bp。

[0059] 在本发明中，所述P5引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：5′‑gacaagggaaaacgcaag‑3′；所述P6引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：5′‑gggataacgcaggaaagaac‑3′。

[0060] 在本发明中，所述反向扩增优选的利用高保真酶2×Phanta Flash Master Mix(Dye Plus)进行。

[0061] 在本发明中，所述反向扩增的反应体系优选的以25μL计，包括以下组分：高保真酶12.5μL，上、下游引物各1.0μL，模版DNA50 ng，用ddH2O定容；所述反向扩增的反应程序优选为：98℃预变性，30s；98℃变性，10s；60℃退火，5s，30个循环；72℃延伸，5s；72℃彻底延伸，
60s。

[0062] 在本发明中，所述gapA基因上下游同源臂融合片段ΔgapA(1931bp)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：ctttcctgcgttatccccgtagaaagtacaggtgcccgggctgtggtaggacttcatctccgattccaacagctcctcgcggctggccttgccttcggcgtagcgctggcgcacgtcagccttttccttgttggagatgcccgacggcatcggcccacccggtacgaagatagtcggcaggtgaccgaagcgcagggcgcccatcatcaggccggggacaatcttgtcgcagatacctagcatcagcgccgcatcgaacatgttgtgcgacagcgcgatggccgtggacagggcgatcacctcgcggctggcgatggccagctccatgcccggctcgccttgggtgacgccgtcgcacatggccggcacgccaccggcgaactgcccgaccgagccgatctcgcgcagggcctgcttgatctgttccgggaagtgctggtacggctggtgggccgagagcatgtcgttgtaggccgagacgatggccacgttggcggcgttcatcatgcgcaggctttgcttgtcctgggcgccacagccggccacgccatgggcgaagttcgcacattgcaggctggcgcgcatggggccgtcgctggccgcgccgcgaatcagctccaggtagcgttcacgggtggcacggctgcgttcgaccaaccgttcggtgacctcaaggatgcgcggatgcatgtactggactccaggctaactgtggggtggtgtcttcgggcatttcccctccaaacgattgcggcctaggctcaaggtgagggtgcctgacgcgatcaaggggtggtctgcccgaccactcgttgtaggtttaacaaaatactgccatcaaaaaggcttgttttctatcctgcgaggaataatcttgtaattccaataacaaaaccgtttcagtgaagtcacctttttgccacaggcttcacccggaccgccagaggtaatgccatgacccttcgcatcgccatcaatggatttggccgcactggataactgtctggcgttgtgcaacgcccgctgatcgcgggcagggccttgtgggagtgggcttgtcccgcgattaggcggcactgccaatacagttcatggcaagggcttcgcccttgatcgcgggacaagcccgctcctacaggcatcgccagcagattcgcgccgatagcatgttggacttgaccaatagggcagatgataagcattatcattcgcctctcgttggtcaggttttcccgtgagtcagtcccgcttcgataccgtcttcctcacccagcgccttaccttgctgcgcacactgcagcgcatggtcggcaaccccagcacggccgaggacctactgcaggaaacctacctgcgggtcacccgtgccctgggcgagcggccgatcgagcacctcgagcccttcgtgttccagacggcgcgcaacctcgccctggaccacctccgtgcacgcaaggtgcaggcacgtacattggtcgacgatgtgcccgacgacatcctgtacaacgtcgctgcccccaccaccagcaacgaagatgccgcccacgccgagcagttgctcgagcgcttgagcatcagcctcggtcagttgaccccgcgccaacaacgtatcttcatcctcagccgcctgcatggcgccagctacctggaaatcgccgaccagctgaaggtttcggccagcaccgtgcagaaggagctcaagctgatcatggcgatctgcatgggcgtggccgagcgcctcgaataaccgccactcgccggtcggcccaggcaaggcgcttgccatggcttcgcgcagccgtgatcatttgcgaaaagacctacagcaaggattcttcgtgacagacagccctgcctctcgcccatcacctgcagggcctgacgcccgtgccatggacgaggcgatggactggctgacaagggaaaacgca。

[0063] 在本发明中，所述gapA基因上下游同源臂融合片段的制备方法优选的包括以下步骤：

[0064] 提取变形假单胞菌J‑T3的基因组DNA；

[0065] 以所述变形假单胞菌J‑T3的基因组DNA为模版，采用引物P1和引物P2进行第一PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；对所述第一PCR扩增产物进行凝胶电泳后，切胶回收目的片段，得到gapA基因的上游同源臂；

[0066] 以所述变形假单胞菌J‑T3的基因组DNA为模版，采用引物P3和引物P4进行第二PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；对所述第二PCR扩增产物进行凝胶电泳后，切胶回收目的片段，得到gapA基因的下游同源臂；

[0067] 以所述gapA基因的上游同源臂和gapA基因的下游同源臂为模板，采用引物P1和引物P4进行第三PCR扩增，得到第三PCR扩增产物；对所述第三PCR扩增产物进行凝胶电泳后，切胶回收目的片段，得到gapA基因上下游同源臂融合片段；

[0068] 所述gapA基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

[0069] 所述gapA基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

[0070] 所述引物P1和引物P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述引物P3和引物P4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

[0071] 本发明提取变形假单胞菌J‑T3的基因组DNA。在本发明中，所述变形假单胞菌J‑T3的基因组DNA优选的采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到。

[0072] 得到变形假单胞菌J‑T3的基因组DNA后，本发明以所述变形假单胞菌J‑T3的基因组DNA为模版，采用引物P1和引物P2进行第一PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；对所述第一PCR扩增产物进行凝胶电泳后，切胶回收目的片段，得到gapA基因的上游同源臂。在本发明中，所述引物P1和引物P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具体为：5′‑ctttcctgcgttatccccgtagaaagtacaggtgcccg‑3′；SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列具体为：5′‑cgccagacagttatccagtgcggccaaatccattga‑3′。在本发明中，所述第一PCR扩增的反应体系优选的以25μL计，包括以下组分：高保真酶12.5μL，上、下游引物各1.0μL，模版DNA50 ng，用ddH2O定容；所述第一PCR扩增的反应程序优选为：98℃预变性，30s；98℃变性，10s；60℃退火，5s，30个循环；72℃延伸，5s；72℃彻底延伸，
60s。在本发明中，第一PCR扩增产物的目的片段的长度为1009bp。在本发明中，所述gapA基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

[0073] ctttcctgcgttatccccgtagaaagtacaggtgcccgggctgtggtaggacttcatctccgattccaacagctcctcgcggctggccttgccttcggcgtagcgctggcgcacgtcagccttttccttgttggagatgcccgacggcatcggcccacccggtacgaagatagtcggcaggtgaccgaagcgcagggcgcccatcatcaggccggggacaatcttgtcgcagatacctagcatcagcgccgcatcgaacatgttgtgcgacagcgcgatggccgtggacagggcgatcacctcgcggctggcgatggccagctccatgcccggctcgccttgggtgacgccgtcgcacatggccggcacgccaccggcgaactgcccgaccgagccgatctcgcgcagggcctgcttgatctgttccgggaagtgctggtacggctggtgggccgagagcatgtcgttgtaggccgagacgatggccacgttggcggcgttcatcatgcgcaggctttgcttgtcctgggcgccacagccggccacgccatgggcgaagttcgcacattgcaggctggcgcgcatggggccgtcgctggccgcgccgcgaatcagctccaggtagcgttcacgggtggcacggctgcgttcgaccaaccgttcggtgacctcaaggatgcgcggatgcatgtactggactccaggctaactgtggggtggtgtcttcgggcatttcccctccaaacgattgcggcctaggctcaaggtgagggtgcctgacgcgatcaaggggtggtctgcccgaccactcgttgtaggtttaacaaaatactgccatcaaaaaggcttgttttctatcctgcgaggaataatcttgtaattccaataacaaaaccgtttcagtgaagtcacctttttgccacaggcttcacccggaccgccagaggtaatgccatgacccttcgcatcgccatcaatggatttggccgcactggataactgtctggcg。

[0074] 得到变形假单胞菌J‑T3的基因组DNA后，本发明以所述变形假单胞菌J‑T3的基因组DNA为模版，采用引物P3和引物P4进行第二PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；对所述第二PCR扩增产物进行凝胶电泳后，切胶回收目的片段，得到gapA基因的下游同源臂。在本发明中，所述引物P3和引物P4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列具体为：5′‑tcaatggatttggccgcactggataactgtctggcg‑3′；SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列具体为：5′‑tgcgttttcccttgtcagccagtccatcgcct‑3′。在本发明中，所述第二PCR扩增的反应体系优选的以25μL计，包括以下组分：高保真酶12.5μL，上、下游引物各1.0μL，模版DNA50 ng，用ddH2O定容；所述第二PCR扩增的反应程序优选为：98℃预变性，30s；98℃变性，10s；60℃退火，5s，30个循环；72℃延伸，5s；72℃彻底延伸，60s。在本发明中，第二PCR扩增产物的目的片段的长度为958bp。在本发明中，所述gapA基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

[0075] tcaatggatttggccgcactggataactgtctggcgttgtgcaacgcccgctgatcgcgggcagggccttgtgggagtgggcttgtcccgcgattaggcggcactgccaatacagttcatggcaagggcttcgcccttgatcgcgggacaagcccgctcctacaggcatcgccagcagattcgcgccgatagcatgttggacttgaccaatagggcagatgataagcattatcattcgcctctcgttggtcaggttttcccgtgagtcagtcccgcttcgataccgtcttcctcacccagcgccttaccttgctgcgcacactgcagcgcatggtcggcaaccccagcacggccgaggacctactgcaggaaacctacctgcgggtcacccgtgccctgggcgagcggccgatcgagcacctcgagcccttcgtgttccagacggcgcgcaacctcgccctggaccacctccgtgcacgcaaggtgcaggcacgtacattggtcgacgatgtgcccgacgacatcctgtacaacgtcgctgcccccaccaccagcaacgaagatgccgcccacgccgagcagttgctcgagcgcttgagcatcagcctcggtcagttgaccccgcgccaacaacgtatcttcatcctcagccgcctgcatggcgccagctacctggaaatcgccgaccagctgaaggtttcggccagcaccgtgcagaaggagctcaagctgatcatggcgatctgcatgggcgtggccgagcgcctcgaataaccgccactcgccggtcggcccaggcaaggcgcttgccatggcttcgcgcagccgtgatcatttgcgaaaagacctacagcaaggattcttcgtgacagacagccctgcctctcgcccatcacctgcagggcctgacgcccgtgccatggacgaggcgatggactggctgacaagggaaaacgca。

[0076] 得到gapA基因的上游同源臂和gapA基因的下游同源臂后，本发明以所述gapA基因的上游同源臂和gapA基因的下游同源臂为模板，采用引物P1和引物P4进行第三PCR扩增，得到第三PCR扩增产物；对所述第三PCR扩增产物进行凝胶电泳后，切胶回收目的片段，得到gapA上下游同源臂融合片段。

[0077] 在本发明中，所述第三PCR扩增的反应体系优选的以25μL计，包括以下组分：高保真酶12.5μL，上、下游引物各1.0μL，模版DNA50 ng，用ddH2O定容；模版DNA中gapA基因的上游同源臂和gapA基因的下游同源臂各25ng。

[0078] 在本发明中，所述第三PCR扩增的反应程序优选为：98℃预变性，30s；98℃变性，10s；60℃退火，5s，30个循环；72℃延伸，5s；72℃彻底延伸，60s。在本发明中，第三PCR扩增产物的目的片段的长度为1931bp。

[0079] 在本发明中，将线性化的pK18mobsacB与gapA基因上下游同源臂融合片段进行连接优选的通过无缝克隆技术进行；所述连接的反应体系以10μL计，优选的包括以下组分：pK18mobsacB 100ng、ΔgapA 7ng，2×CE Mix 5μL，ddH2O定容；所述连接的反应条件优选为：50℃，5min。

[0080] 在将线性化的pK18mobsacB与gapA基因上下游同源臂融合片段进行连接后，本发明优选的还包括将pK18mobsacB与ΔgapA的连接产物热激转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109的感受态细胞，然后经卡那霉素抗性筛选、菌落PCR验证和和测序验证，得到正确构建的重组自杀质粒pK18mobsacB‑ΔgapA。

[0081] 得到重组自杀质粒后，本发明将所述重组自杀质粒转入变形假单胞菌J‑T3的感受态细胞中，然后经卡那霉素抗性筛选，得到带有卡那霉素抗性基因的重组菌株。

[0082] 在本发明中，所述转入优选的包括电激转入。将重组菌株涂布于含有50μg/L卡那霉素的LB固体培养基上，在卡那霉素筛选的压力下，质粒与宿主基因组发生第一次同源重组，获得了带有卡那霉素抗性基因的重组菌株J‑T3/pK18mobsacB‑ΔgapA。

[0083] 得到带有卡那霉素抗性基因的重组菌株后，本发明将所述带有卡那霉素抗性基因的重组菌株接种于含有0.1g/mL蔗糖的LB固体培养基中，进行培养，得到变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株。

[0084] 带有sacB基因的菌株无法在含有蔗糖的LB平板上生长，因此发生第二次同源重组，从而可以筛选出gapA基因缺失的突变株。

[0085] 在所述培养得到培养产物后，本发明优选的还包括进行PCR验证和测序验证，得到J‑T3菌株的gapA基因敲除菌株(JT3ΔgapA)。

[0086] 在本发明中，所述PCR验证包括以下步骤：以JT3ΔgapA菌落或其基因组DNA为模版，采用引物P1和引物P4进行PCR扩增，得到的PCR产物应为ΔgapA(1931bp)。PCR反应体系与反应程序与上述方案所述第三PCR扩增的反应体系和反应程序相同；所述测序验证包括以下步骤：对上述的PCR产物送相关公司进行测序，其核苷酸序列应与ΔgapA(1931bp)完全一致。

[0087] 本发明还提供了上述方案所述的变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株或者所述构建方法构建得到的变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株在发酵生产2KGA中的应用。

[0088] 在本发明中，所述发酵生产2KGA包括以下1)～4)中的一个或几个方面：1)提高发酵生产2KGA的产量；2)提高发酵生产2KGA的糖酸转化率；3)降低发酵生产2KGA过程中的能源消耗；4)提高40℃的条件下发酵生产2KGA的生产性能。

[0089] 本发明还提供了一种发酵生产2KGA的方法，包括以下步骤：

[0090] 将上述方案所述的变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株或者所述构建方法构建得到的变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株的种子液接种于发酵培养基，进行发酵，得到含有2KGA的发酵产物。

[0091] 在本发明中，所述发酵的温度优选为32～40℃，更优选为32℃、36℃或40℃；所述发酵的过程优选的伴随振荡；所述振荡的条件优选的包括：265r/min、偏心距25mm；所述发酵培养的时间优选的以发酵培养基中的葡萄糖被完全消耗为准。

[0092] 在本发明中，所述发酵培养基优选的包括以下浓度的组分：结晶葡萄糖180g/L、玉米浆20g/L和轻质CaCO345g/L；所述发酵培养基的pH为6.7。

[0093] 在本发明中，所述种子液的制备方法优选的包括以下步骤：将上述方案所述的变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株或者所述构建方法构建得到的变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株接种于种子培养基，进行种子培养，得到种子液；所述种子培养基包括以下浓度的组分：结晶葡萄糖20g/L、玉米浆10g/L、尿素2g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L和轻质CaCO35g/L，其中：先将葡萄糖配制为40％左右的葡萄糖水溶液，并利用0.22μm滤膜过滤除菌，然后将其与经过灭菌(121℃灭菌20min)的其他组分混合；所述种子培养基的pH为7。为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种变形假单胞菌3‑磷酸甘油醛脱氢酶缺失突变株及其构建方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0094] 实施例1变形假单胞菌J‑T3基因gapA的敲除

[0095] (1)菌株J‑T3基因组DNA(gDNA)的提取

[0096] 将‑80℃下保存的J‑T3菌株室温解冻，然后将菌液适当稀释后涂布在LB培养基平板上，32℃培养13h。从平板上挑取单菌落并将其接入5mL的LB液体培养基中，30℃、200r/min的条件下振荡培养过夜。取1.5mL培养液于无菌的2mL的离心管中，在冷冻离心机中8000r/min离心2min，收集菌体。然后，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取gDNA。经核酸蛋白定量仪和琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的纯度和完整度后，样品于‑20℃下保存备用。

[0097] LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，pH 7.0，121℃灭菌20min。

[0098] LB固体培养基(g/L)：在LB液体培养基的基础上添加琼脂20.0，pH 7.0，121℃灭菌20min。

[0099] (2)用于敲除gapA的PCR引物的设计与合成

[0100] 根据gapA的基因序列及其上下游序列，设计敲除gapA的PCR引物P1、P2、P3和P4。其中，引物P1和P4包含自杀质粒pK18mobsacB的同源序列(用下划线标注)。设计与合成的引物如下：

[0101] P1：5′‑ctttcctgcgttatccccgtagaaagtacaggtgcccg‑3′；(SEQ ID NO.6)[0102] P2：5′‑cgccagacagttatccagtgcggccaaatccattga‑3′；(SEQ ID NO.7)[0103] P3：5′‑tcaatggatttggccgcactggataactgtctggcg‑3′；(SEQ ID NO.8)[0104] P4：5′‑tgcgttttcccttgtcagccagtccatcgcct‑3′(SEQ ID NO.9)。

[0105] (3)PCR扩增gapA基因的上、下游同源臂

[0106] 以J‑T3菌株的gDNA为模版，利用高保真PCR酶2×PhantaFlashMasterMix(Dye Plus)扩增gapA基因的上、下游同源臂。扩增上游同源臂时采用的引物为P1和P2；扩增下游同源臂时采用的引物为P3和P4。

[0107] PCR反应体系(25.0μL)：高保真PCR酶12.5μL，上、下游引物各1.0μL，模版DNA50 ng，用ddH2O定容。

[0108] PCR反应程序：98℃预变性，30s；98℃变性，10s；60℃退火，5s，30个循环；72℃延伸，5s；72℃彻底延伸，60s。

[0109] 利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物(gapA基因的上、下游同源臂)进行分离(图1)，切胶后利用胶回收试剂盒回收目的片段，并经测序验证得到gapA基因的上游同源臂片段(1010bp)和gapA基因的下游同源臂片段(958bp)。

[0110] (4)gapA基因上下游同源臂融合片段(ΔgapA)的扩增

[0111] 采用降落PCR(TD‑PCR)技术，以gapA的上、下游同源臂为混合模板，P1和P4为引物，扩增gapA基因上下游同源臂融合片段(ΔgapA)。

[0112] TD‑PCR反应体系与gapA基因的上、下游同源臂扩增的反应体系相同。

[0113] TD‑PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸10s，共1个循环；98℃变性10s，70℃退火15s，72℃延伸10s，共10个循环，每个循环降1℃；98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸10s，共20个循环；72℃彻底延伸1min。

[0114] 利用琼脂糖凝胶电泳对TD‑PCR扩增产物进行分离(图2)，切胶后利用胶回收试剂盒回收目的片段，并经测序验证得到gapA基因上下游同源臂融合片段(1931bp)。

[0115] (5)线性化pK18mobsacB载体的制备

[0116] 根据自杀质粒pK18mobsacB的序列，设计了特异性引物P5和P6。

[0117] P5：5′‑gacaagggaaaacgcaag‑3′(SEQ ID NO.11)

[0118] P6：5′‑gggataacgcaggaaagaac‑3′(SEQ ID NO.12)

[0119] 以pK18mobsacB为模板，以P5和P6为引物，利用高保真酶2×Phanta Flash MasterMix(Dye Plus)对其进行反向扩增，得到了线性化pK18mobsacB载体。

[0120] PCR的反应体系与反应程序与gapA基因的上、下游同源臂扩增相同。

[0121] (6)重组自杀质粒pK18mobsacB‑ΔgapA的构建

[0122] 将线性化的pK18mobsacB与gapA基因上下游同源臂融合片段(ΔgapA)通过无缝克隆技术进行连接，其反应体系(10.0μL)为：pK18mobsacB 100.0ng，ΔgapA70.0ng，2×CE Mix 5.0μL，ddH2O定容。连接反应条件：50℃，5min。

[0123] 将pK18mobsacB与ΔgapA的连接产物热激转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109的感受态细胞，然后经卡那霉素抗性筛选、菌落PCR验证(图3)和测序验证，得到了正确构建的重组自杀质粒pK18mobsacB‑ΔgapA。

[0124] (7)J‑T3菌株gapA基因的敲除(JT3ΔgapA的构建)

[0125] 将构建重组自杀质粒pK18mobsacB‑ΔgapA电激转入变形假单胞菌J‑T3的感受态细胞中，然后将其涂布于含有50μg/L硫酸卡那霉素的LB固体培养基上，在卡那霉素筛选的压力下，质粒与宿主基因组发生第一次同源重组，获得了带有卡那霉素抗性基因的重组菌株J‑T3/pK18mobsacB‑ΔgapA。将其接种至含有50μg/L硫酸卡那霉素的LB液体培养基中扩‑3 ‑4大培养，取培养菌液并将其稀释至10 或10 倍，然后取100μL稀释菌液均匀涂布于含有
10％蔗糖的LB固体培养基中，30℃倒置培养过夜。带有sacB基因的菌株无法在含有蔗糖的LB平板上生长，因此发生第二次同源重组，从而可以筛选出gapA基因缺失的突变株，这一过程可能产生回复突变株(J‑T3)。经PCR验证和测序验证，得到了J‑T3菌株的gapA基因敲除菌株(JT3ΔgapA)，参见图4。其中，PCR验证包括以下步骤：以JT3ΔgapA菌落或其基因组DNA为模版，采用引物P1和引物P4进行PCR扩增，得到的PCR产物应为ΔgapA(1931bp)。PCR反应体系与反应程序与上述方案所述第三PCR扩增的反应体系和反应程序相同；测序验证包括以下步骤：对上述的PCR产物送相关公司进行测序，其核苷酸序列应与ΔgapA(1931bp)完全一致。

[0126] 实施例2变形假单胞菌J‑T3和JT3ΔgapA在不同温度下种子培养过程的比较[0127] 种子培养基(g/L)：结晶葡萄糖20.0，玉米浆10.0，尿素2.0，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，轻质CaCO35.0，pH 7.0。其中：葡萄糖溶液利用0.22μm滤膜过滤除菌，其他组分121℃灭菌20min。

[0128] 种子培养：将J‑T3和JT3ΔgapA分别接入装有50mL的种子培养基的500mL锥形瓶中，在不同温度下(32℃、36℃和40℃)下振荡(265r/min、偏心距25mm)培养24h。

[0129] 种子培养结果如图5～图8所示。从图中可以看出：在不同温度下，J‑T3和JT3ΔgapA均能利用葡萄糖生长并合成2KGA，且在培养10h左右将培养基中的葡萄糖完全消耗，然后J‑T3和JT3ΔgapA利用2KGA作为替代碳源进行二次生长。J‑T3和JT3ΔgapA的细胞生长、葡萄糖利用速率以及种子培养液pH的变化趋势几乎没有差异，且均在培养10h时2KGA的产量达到峰值，但JT3ΔgapA的最大2KGA产量高于J‑T3在相应温度下的最大2KGA产量。另外，相对于32℃和36℃下的细胞生长量和2KGA最大产量，J‑T3和JT3ΔgapA在40℃下的细胞生长量和2KGA最大产量均有比较明显的降低。

[0130] 实施例3变形假单胞菌J‑T3和JT3ΔgapA的2KGA发酵结果的比较

[0131] 发酵培养基(g/L)：结晶葡萄糖180.0，玉米浆20.0，轻质CaCO345.0，pH6.7。

[0132] 摇瓶发酵：将4mL的J‑T3和JT3ΔgapA种子液分别接入装有40mL发酵培养基的500mL的锥形瓶中，在不同温度下(32℃、36℃和40℃)下振荡(265r/min、偏心距25mm)培养至发酵培养基中的葡萄糖被完全消耗。发酵结果如表1所示。

[0133] 表1突变株JT3ΔgapA与亲株J‑T3的2KGA发酵结果比较

[0134]

[0135] 从表1可以看出：在相同的温度(32℃、32℃或40℃)下，J‑T3和JT3ΔgapA的细胞生长量(OD650nm)没有明显的差异，但JT3ΔgapA的2KGA产量及糖酸转化率明显高于J‑T3的2KGA产量及糖酸转化率(相对提高5.0％以上)。以上结果表明，突变株JT3ΔgapA保持了其亲株J‑T3的高温耐受性，且具有更为优良的2KGA发酵生产性能。在40℃的发酵温度下，突变株JT3ΔgapA的2KGA产量、糖酸转化率和发酵生产强度分别达到162.98g/L、0.9241mol/mol和2.91g/L·h，相对于亲株J‑T3均提高了5.0％以上。