[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及梭菌属菌株及其应用。

[0002] 内蒙古自治区是煤炭大省，已探明的煤炭储量居全国第二位。该区煤炭种类以煤化程度最低的褐煤为主，其高水分、高灰分、低发热量的特点，导致在综合利用中大大受阻。但褐煤具备的上述特点适合微生物对其进行降解利用产煤层气，此过程没有污染物，绿色环保。可目前这一课题研究国内外大部分停留在试验阶段，且所用微生物菌群大多为高温菌，多为取自煤层的内源产甲烷菌群，试验过程需要高温高压的厌氧环境。降解褐煤时所需环境条件苛刻，操作过程具有一定的危险性；因此发现能在简单操作的可控条件下降解褐煤的微生物菌群，以及菌群中的有效菌株在褐煤降解过程中具有重要作用。筛选出有效菌株，对其性能进行试验，明确菌株的代谢途径，这对褐煤降解过程的控制具有重要意义。

[0033] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0034] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0035] 微量元素溶液配方为：氨乙酸1.5g/L、CaCl2 0.1g/L、MgSO4·7H2O 3.0g/L、H3BO3 0.05g/L、FeSO4 0.1g/L、NaCl 1.0g/L、CoCl2 0.1g/L、MnSO4 0.5g/L、ZnSO40.1g/L、NaMoO4 
0.05g/L、AlK(SO4)2 0.01g/L、NiCl2 0.1g/L、CuSO4 0.01g/L。

[0036] 维生素溶液配方为：生物素2mg/L、尼古酸5mg/L、叶酸2mg/L、硫胺素5mg/L、盐酸吡哆醇10mg/L、钴胺素0.1mg/L、核黄素5mg/L、对氨基苯甲酸5mg/L、泛酸5mg/L、硫辛酸5mg/L。

[0037] 实施例1、梭菌属菌株LY‑ap1的获得和鉴定

[0038] 1.梭菌属菌株LY‑ap1的获得

[0039] 梭菌属菌株LY‑ap1获取自本实验室从内蒙古自治区呼和浩特市春华污水处理厂厌氧消化池污泥中的产甲烷厌氧菌群。

[0040] 获取方法具体如下：

[0041] (1)取样：用实验室已有的稳定的可降解褐煤的产甲烷菌群作为原始菌液(即上述采集的样品进行培养驯化获得的菌群)，对其中的梭菌属进行分离；

[0042] (2)初筛：以去离子水配置培养基，1L去离子水中加入K2HPO4 0.4g、NH4Cl 1.0g、MgCl2 2.0g、半胱氨酸0.5g、KH2PO4 0.4g、Na2S 0.2g、酵母提取粉2.0g、NaHCO30.2g、乙酸钠2.0g、NaCl 2.0g、KCl 0.2g、维生素溶液10mL、微量元素溶液10.0mL。培养基配方中Na2S和NaHCO3以及半胱氨酸作为还原剂除去培养基中的溶解氧，同时，煮沸5分钟，以彻底除去培养基中的氧。每5ml培养基分装到Hungate滚管中，封口压盖，抽真空后，121℃高压灭菌
30min；洁净工作台紫外杀菌30min后，准备烧杯装入50℃以上的热水并将滚管中培养基完全浸没在热水中；将步骤(1)的原始菌液以5％的接种量接种于Hungate滚管中，迅速滚管，确保培养基充分、平滑、均匀的铺在管滚内壁，置于37℃摇床中，并观察菌落生长情况；

[0043] (3)复筛：挑取菌落密度分布均匀的滚管用作菌种分离纯化，将挑取的单菌落接种到培养基中培养；

[0044] (4)待菌液浑浊后，重复步骤(2)、(3)的试验内容，直至滚管内的菌落形态一致，获得菌株LY‑ap1。

[0045] 2.菌株LY‑ap1的鉴定

[0046] 形态学鉴定

[0047] 在培养基上菌株LY‑ap1的菌落呈圆形、表面湿润、光滑、乳白色且不透明、边缘不整齐，质地均匀且呈扁平状；细胞呈革兰氏阳性杆状。生理生化特性：该菌株在37～39℃范围内，pH为7.0时生长状态良好，具有运动性，专性厌氧。

[0048] 16S rDNA序列同源性分析

[0049] 引物选用细菌的16S rRNA基因扩增的通用引物对菌株LY‑ap1进行扩增，27F(5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’)(序列表中的SEQ  ID  No.1)和1492R(5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’)(序列表中的SEQ ID No.2)；PCR反应体系为40μL：Premix Taq20μl(购于TaKaRa工程有限公司),20μM的引物27F和1492R各2μl，菌液2μl，补充灭菌蒸馏水14μL，进行PCR反应。反应条件为94℃2min、(94℃30s、55℃30s以及72℃60s)，72℃5min经过30个循环。扩增产物进行测序，得到16S rDNA序列为序列表中SEQ ID No.3，将得到的16S rDNA序列在NCBI的基因库上比对，比对发现基因组覆盖率达到100％的菌属为：
Clostridium(梭菌属)。进而构建进化树并给出相似度高的菌种，据进化树图相似度最高的为Clostridium bifermentans‑双酶梭菌。

[0050] 鉴于上述形态、生理生化特性分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将菌株LY‑ap1鉴定为梭菌属(Clostridium sp.)。

[0051] 梭菌属菌株LY‑ap1在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为GDMCC No：61746，保藏名称为Clostridium sp.LY‑ap1。

[0052] 实施例2、梭菌属菌株LY‑ap1降解褐煤

[0053] 将实施例1获得的梭菌属菌株LY‑ap1菌液5mL，接种至50mL褐煤培养基，温度37℃，pH值7.0，厌氧条件下培养15天，并检测降解产物。

[0054] 褐煤培养基组成：

[0055] 酵母提取粉2.00g/L，磷酸氢二钾0.42g/L，磷酸二氢钾0.42g/L，氯化镁2.50g/L，氯化钠1.98g/L，氯化钾0.20g/L，L‑半胱氨酸0.50g/L，NH4Cl 1.00g，碳酸氢钠0.26g/L，硫化钠0.20g/L，褐煤2.00g/L，用去离子水定容至1L，加入维生素溶液10.00mL、微量元素溶液10.00mL，充分搅拌后用NaOH颗粒调节pH＝7.00±0.10。

[0056] 降解产物检测方法：分别将上述厌氧培养5天后(5d)和15天后(15d)的产物，先进行过滤得到产物液体，然后对产物液体进行有机物萃取，最后对萃取得到的有机物进行液质联用分析，获得该菌降解褐煤得到的产物的定性定量分析。

[0057] 检测结果如表1所示，取样自LY‑ap1降解褐煤过程中的不同时期，有机物的成分含量变化明显，且向不稳定的结构发展，表明梭菌属菌株LY‑ap1能够降解褐煤为小分子有机物，为后期产甲烷菌有效利用有机物产甲烷提供了新途径。

[0058] 表1微生物降解褐煤不同时期的有机物成分

[0059]

[0060] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。