技术领域 本发明涉及微生物领域。具体地，本发明涉及一种新的弧菌科弧 菌属菌株Vibrio sp.QY1，其保藏编号为CCTCC NO：M 205030，以及 以该菌株制备褐藻胶裂解酶和褐藻胶寡糖的应用。 背景技术 褐藻胶是一种来源丰富、用途广泛的酸性海洋多糖，来源于褐藻 和某些细菌(包括假单胞菌、固氮菌等)，由β-D-甘露糖醛酸和α-L- 古罗糖醛酸通过β-1，4糖苷键连接形成，可分为聚甘露糖醛酸、聚古罗 糖醛酸和甘露糖醛酸与古罗糖醛酸交替嵌段。近来，褐藻胶寡糖的生 物活性不断被发现，如抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗心血管疾病等，其 广阔的应用前景已引起人们的广泛关注。褐藻胶裂解酶可以通过β消 去机制打断褐藻胶的β-1，4糖苷键，并在非还原末端产生C4，5不饱和 双键，这些还原末端不饱和双键的产生对寡糖的某些生物活性有重要 影响，而物理、化学降解方法降解的产物却没有这些特性。酶法制备 褐藻胶寡糖因反应条件温和易控、产物单一、不造成环境污染等特点 已逐渐取代酸法。现已从细菌、无脊椎动物中分离到数十种褐藻胶裂 解酶，但普遍存在着产酶量低、底物特异性差的缺点，大大限制了褐 藻胶寡糖的应用。而本发明的发明人从海带糜烂物中分离到一株高产 胞外褐藻胶裂解酶的海洋细菌CCTCC NO：M 205030，产酶量比已报 道的高出2～5倍，并从其发酵产物中分离得到一种褐藻胶裂解酶。 发明内容 本发明的目的之一是提供一种新的弧菌科弧菌属菌株(Vibrio sp. QY1)CCTCC NO：M 205030。 本发明的另一目的是提供一种利用上述菌株制备的褐藻胶裂解 酶。 本发明的再一目的是提供利用上述褐藻胶裂解酶制备的褐藻胶寡 糖。 根据本发明的一个技术方案，从海带糜烂物中分离得到一种新的 弧菌科弧菌属菌株(Vibrio sp.QY1)，其保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏编号为CCTCC NO：M 205030。 根据本发明的另一技术方案，本发明提供了一种通过发酵上述菌 株、然后分离纯化得到的褐藻胶裂解酶，该酶的分子量为39kD。 根据本发明的再一技术方案，本发明提供一种通过使用上述褐藻 胶裂解酶分解褐藻胶而得到的褐藻胶寡糖。 本发明的弧菌CCTCC M 205030能够用于褐藻胶裂解酶的生物制 备，其产酶量比已报道的菌株的产酶量高出2～5倍。 具体实施方式 本发明的弧菌科弧菌属菌株(Vibrio sp.QY1)，于2005年4月7日 被保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国 武汉 武汉大学，邮 编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 205030。 实施例1弧菌CCTCC NO：M 205030的分离 取海带糜烂部分1g，浸于100毫升灭菌海水中，搅拌1小时，取 1毫升悬浮液接入100毫升液体培养基，25℃静止培养一周。取培养液 在固体平板上划线分离单克隆，连续5代单克隆纯化培养。挑取单克 隆接种到含3毫升液体培养基的试管中，25℃200r/min培养12小时。 将培养液按1％的比例接入含50毫升液体培养基的250毫升三角瓶中， 于25℃200r/min培养3天。培养液于4℃12000r/min离心10min去 除菌体，测定上清液的酶活力，选取酶活力最高的菌株。其中一株细 菌发酵产生的酶活力最高，为152U/L，将其命名为QY1。使用的液体 培养基配方为(g/L)：褐藻酸钠3.0g、KH2PO4 3.0g、K2HPO4 7.0g、 (NH4)2SO4 2.0g、MgSO4 0.1g、FeSO4 0.1g、NaCl 30.0g；固体培养基中添加 12.0g/L的琼脂。酶活力测定采用紫外吸收法，取0.9毫升3g/L褐藻 酸钠(用0.1mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液配制)，加入0.1ml酶液，30 ℃保温15min，测定反应体系在235nm处的光吸收值。在此条件下， 每分钟光吸收值增加0.1为一个酶活力单位(U)。 实施例2弧菌CCTCC NO：M 205030的鉴定 1、形态特征 所得菌株在常规使用的Zobell 2216E平板上培养24h的菌落呈圆 形，半透明，表面光滑，边缘整齐，直径为2.5mm；在常规使用的TCBS 平板上菌落呈黄色，直径为3.2mm。该菌株为革兰氏阴性，杆状，可 运动。 2、生长条件 菌株CCTCC NO：M 205030为兼性厌氧菌。CCTCC NO：M 205030 在1％～10％NaCl浓度范围内生长良好，最适NaCl浓度为4％，最适 生长温度25℃，最适生长pH7.0。 3、生理生化特征 常规生化实验表明，菌株CCTCC NO：M 205030氧化酶反应阳性， 发酵葡萄糖产酸不产气，对弧菌抑制剂O/129(2，4-二氨基-6，7-二异丙 基喋啶磷酸盐，150mg/L)敏感，不发光，不产色素。结合形态特征， 初步判断菌株CCTCC NO：M 205030属于弧菌科弧菌属(Vibrio sp.)。 4、生物学分类位置的确定 将菌株CCTCC NO：M 205030的形态特征、生理生化特征与弧菌 属部分细菌的特征进行了比较，结果(表1)表明，菌株CCTCC NO： M 205030与灿烂弧菌(Vibrio splendidus)最接近，仅在还原硝酸盐、 发光等2方面不同，与河口弧菌(Vibrio aestuarianus)在V-P产生、 40℃生长、淀粉酶产生、明胶酶产生等4方面不同，与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)在游动、精氨酸双水解酶、还原硝酸盐、V-P产生、4℃ 生长、肌醇发酵、溶藻酶产生等7方面不同，与双氮弧菌(Vibrio diazotrophicus)在还原硝酸盐、阿拉伯糖发酵、甘露糖发酵、乳糖发 酵、水杨苷发酵、明胶酶产生、脂酶产生、几丁质酶产生等8方面不 同。 表1菌株CCTCC NO：M 205030与弧菌属部分成员表型特征的比较 表型特征 本发明 的菌株 灿烂弧菌 河口弧菌 双氮弧菌 溶藻弧菌 运动性 游动 PHB积累 色素产生 O/129敏感性 精氨酸双水 解酶 氧化酶 还原硝酸盐 发光 从D-葡萄糖 产气 V-P产生 生长需要Na+ 需要生长因 + - - - + + + - - - - + - + - - - + + + + + - - + - + - - + + + - - D + - + - - + + + + - - - + - + + - - + - + + - - + + - 子 4℃生长 30℃生长 35℃生长 40℃生长 发酵产酸： 葡萄糖 阿拉伯糖 甘露糖 甘露醇 肌醇 山梨醇 蔗糖 乳糖 蜜二糖 水杨苷 酶产生： 淀粉酶 明胶酶 脂酶 溶藻酶 几丁质酶 + + + - + - + + - - + - - - + + + + + D + D - + - + + - - D - - - + + + D + + + + + + - - + + + + + - + - - + + - + + - - - - + + - + - D + D - + - - - + + + - + +，多于90％的菌株为阳性；-，多于90％的菌株为阴性；D，11～89 ％的菌株为阳性。 菌株CCTCC NO：M 205030为革兰氏阴性杆菌，可运动，氧化酶 反应阳性，发酵葡萄糖产酸不产气，对弧菌抑制剂O/129敏感，不发 光，不产色素，因此初步判断菌株CCTCC NO：M 205030属于弧菌科 弧菌属(Vibrio sp.)。根据该菌株与部分弧菌属细菌的生理生化特征的 比较，CCTCC NO：M 205030与V.splendidus最接近，但需要指出的 是，在伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)中对于V.aestuarianus有许多生 理生化特征没有描述，因此CCTCC NO：M 205030有可能与V. aestuarianus还有更多的异同点。 实施例3褐藻胶裂解酶的制备 (1)菌体培养 挑取弧菌CCTCC NO：M 205030的单克隆接种到含3毫升液体培 养基的试管中，25℃200r/min培养12小时。将培养液按1％的比例 接入含50毫升液体培养基的250毫升三角瓶中，于25℃200r/min培 养3天，收集培养液。使用的液体培养基配方为(g/L)：褐藻酸钠3.0g、 KH2PO4 3.0g、K2HPO4 7.0g、(NH4)2SO4 2.0g、MgSO4 0.1g、FeSO4 0.1g、 NaCl 30.0g。 (2)酶的分离纯化 培养液于4℃12000r/min离心10min去除菌体，收集上清液。 于上清液中缓慢加入硫酸铵至80％饱和度，4℃静置3h，4℃13000g 离心30min，弃去上清液，沉淀溶于20mmol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液， 4℃透析过夜，4℃13000g离心30min取上清液，即为粗酶液。粗酶液 上样于以20mmol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液平衡的DEAE Sepharose Fast Flow柱进行离子交换层析。层析柱体积为14ml(1cm×20cm)， 上样量为3ml，采取NaCl浓度梯度洗脱(A液为20mmol/L pH 7.5磷 酸盐缓冲液，B液为含有2.0mol/L NaCl的A液)，流速1.0ml/min， 检测收集物活性，大量收集活性组分。活性组分进行凝胶过滤层析， Superdex 75HR 10/30柱用20mmol/L pH7.5磷酸盐缓冲液平衡，上样 量1.0ml，以平衡液洗脱，流速0.5ml/min，检测收集物活性，大量收 集高活性组分，浓缩备用(以后称为“酶液”)。以上层析纯化操作均在 4℃进行。按Folin-酚法，以牛血清白蛋白为标准测定酶液中蛋白质的 浓度，其浓度为1.02mg/mL，比活力为15U/mg。 弧菌CCTCC NO：M 205030产酶量为152U/L，为已报道的菌株 产酶量的2～5倍。 SDS-PAGE分析结果表明该酶的分子量约为39KDa。 酶液分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下 保温1h，迅速冷却至0℃，测定酶活性；同时，分别测定酶液在不同 温度下的活性，以确定酶反应的最适温度。结果表明，酶反应的最适温 度为30℃；酶的活性在0～30℃之间基本稳定，而超过30℃以后，酶 活性随着温度的升高而降低。 在不同pH下测定酶活性，发现大约pH 7.5时酶活性最高，pH 低于7.5时，酶活性随着pH的升高而逐渐升高；pH高于7.5时，酶活 性随着pH的升高而逐渐降低。酶活性在pH 6.0～8.5之间较稳定。 Mn2+、Ca2+对于酶的活性有促进作用，而Ba2+、Fe2+、Ni2+以 及EDTA对于酶的活性有抑制作用。当在底物中加入一定浓度的NaCl时，对酶活有促进作用。实验表明，当底物中NaCl浓度为0.5mol/L时， 酶的活性最高，为未加NaCl时的136％，但是当NaCl浓度超过0.85 mol/L时，酶的活性受到一定抑制。 使用poly(M)和poly(G)对酶的底物特异性进行初步研究，结果 表明弧菌CCTCC NO：M 205030产生的褐藻胶裂解酶对两种底物具有 相同的活性。 实施例4褐藻胶寡糖的制备 将褐藻酸钠配成重量百分浓度为1-5％的水溶液，每升溶液加入 10-50U/L的上述褐藻胶裂解酶，在25-35℃温育8-16小时，最后 通过离心或过滤除去未降解的大分子褐藻胶，用Sephadex G25凝胶柱 进行层析分离，收集褐藻胶低聚糖组分，浓缩干燥。可获得聚合度为2 -10的褐藻胶寡糖。