技术领域
[0001] 本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种噬菌体及其应用。
相关背景技术
[0002] 噬菌体(Phage)在自然界分布广泛，在泥土或者动物的肠道都可以找到。噬菌体是胞内寄生，有严格的宿主特异性。近年来，由于致病菌在临床上不断发现耐药现象，甚至多重耐药，使用特异性的噬菌体进行替代治疗是目前的研究方向。
[0003] 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)广泛分布于自然界，在水、土壤、环境中大量存在，是临床上常见的条件致病菌，可以引起肺部、尿道、脑膜以及伤口感染，严重时发生败血症。由于抗生素的滥用以及不规范使用，粘质沙雷氏菌在临床上也产生了耐药性，开发新的抗生素时间漫长而且成本高昂，因此使用噬菌体来治疗耐药菌成为一种替代方案。但是，目前没有针对粘质沙雷氏菌的噬菌体。
具体实施方式
[0014] 为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0015] 本申请实施例第一方面提供一种噬菌体，所述噬菌体裂解粘质沙雷氏菌，所述噬菌体保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61141。
[0016] 具体地，粘质沙雷氏菌来源蚊虫肠道，本申请提供一种从自然界分离得到的能够强烈裂解粘质沙雷氏菌的噬菌体，该噬菌体分类学名称为Serratia marcescens bacteriophage；已于2020年08月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；本申请实施例中命名为SHENZHEN02。利用该噬菌体特有的性能，可以有效克服粘质沙雷氏菌在临床上的耐药性问题，为治疗粘质沙雷氏菌感染的临床治疗提供一种有效方案。
[0017] 该噬菌体在昆虫体内也有裂解效果，可作为耐药菌的一种替代治疗方式。
[0018] 具体地，当用该噬菌体进行裂解粘质沙雷氏菌时，添加量为1×108PFU/ml。
[0019] 本申请实施例第二方面提供一种本申请的噬菌体在制备抗粘质沙雷氏菌剂中的应用。
[0020] 因本申请提供的噬菌体能够强烈裂解粘质沙雷氏菌，因此其可以用于制备成抗粘质沙雷氏菌剂，在临床上有效治疗粘质沙雷氏菌的感染。
[0021] 具体地，上述抗粘质沙雷氏菌剂即为粘质沙雷氏菌裂解剂，因该噬菌体能够强烈裂解粘质沙雷氏菌，所以该抗粘质沙雷氏菌剂可以为治疗因粘质沙雷氏菌感染的药物。
[0022] 在一实施例中，该抗粘质沙雷氏菌剂为治疗因粘质沙雷氏菌感染的药物。
[0023] 在一实施例中，该抗粘质沙雷氏菌剂为治疗因粘质沙雷氏菌引起的肺部感染药物。
[0024] 在一实施例中，该抗粘质沙雷氏菌剂为治疗因粘质沙雷氏菌引起的尿道感染药物。
[0025] 在一实施例中，该抗粘质沙雷氏菌剂为治疗因粘质沙雷氏菌引起的伤口感染药物。
[0026] 在一实施例中，该抗粘质沙雷氏菌剂为治疗因粘质沙雷氏菌引起的脑膜炎药物。
[0027] 在一实施例中，该抗粘质沙雷氏菌剂为治疗因粘质沙雷氏菌引起的败血症药物。
[0028] 下面结合具体实施例进行说明。
[0029] 实施例1噬菌体的筛选和纯化
[0030] 1、污水处理
[0031] 取深圳某河边污水，4000rpm离心15min，用0.22μm的滤膜过滤除菌，将滤液装入无菌培养瓶。
[0032] 2、噬菌体培养
[0033] 取4mL过滤后的上清，加入200μL的对数期宿主菌培养液，放置37℃，220rpm培养箱培养3个小时，用微孔滤膜过滤得到噬菌体原液。
[0034] 3、单一性噬菌体筛选和鉴定
[0035] 在双层琼脂平板上挑取噬菌斑形状大小一致，单个独立的噬菌斑，用无菌的接种针穿刺选好的噬菌斑，接入3mL LB(Luria-Bertani)肉汤培养基，轻微搅拌几次，加入0.2mL含有粘质沙雷氏菌菌液，摇匀之后在室温静置1h，37℃培养12h，4℃下12000×g离心30min，然后用0.22μm的滤膜过去除菌，上清液4℃保存。
[0036] 具体地，该噬菌体Serratia marcescens bacteriophage SHENZHEN02已于2020年08月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所；微生物保藏号：GDMCC No.61141。
[0037] 4、噬菌体生长动力学
[0038] (1)将上述筛选到的噬菌体和1x108CFU/ml的粘质沙雷氏菌以感染复数(multiplicity of infection，MOI)＝0.1在37℃孵育20min后，12000g离心1min，去上清；用无菌无抗LB培养基洗三遍，吸干液体。
[0039] (2)将上述吸附了噬菌体的细菌加入20ml LB液体培养基，充分混匀，置于37℃培养，分别在0min和每隔10min取样200ul，12000g离心1min，取上清液用于测定。
[0040] (3)噬菌体滴度用双层琼脂平板进行测定，每个时间点重复三次。
[0041] 结果如图1所示，从图1可知Shenzhen 02噬菌体的潜伏期约为10min，爆发时间约为70min(潜伏期至稳定期)，爆发量为3.303×106PFU/cell。暴发量＝暴发末期噬菌体滴度14 8 6
÷感染初期宿主菌浓度，即3.303×10 (PFU/mL)/1.0×10 (CFU/mL)＝3.303×10 PFU/cell。
[0042] 实施例2噬菌体裂解粘质沙雷氏菌的验证
[0043] 1、在10ml无抗的液体LB培养基接种1％(即100ul粘质沙雷氏菌菌液接种到10ml无抗的LB液体培养基中)粘质沙雷氏菌，37℃培养箱，220r/min振荡培养4h。
[0044] 2、在BSL-2生物安全柜里将菌液分成两部分，一份继续培养，一份按照1‰的浓度接入噬菌体。在37℃培养箱静置培养12h，220r/min振荡培养4h。
[0045] 3、配制普通LB固体平板，用记号笔将平板分为2个区域，各吸取上述两种菌液100ul滴在平板中央，用无菌涂布棒均匀涂开，置于37℃温箱培养12h。
[0046] 结果如图2所示：涂有没加噬菌体的菌液的区域长出均匀的粘质沙雷氏菌，涂有加入噬菌体菌液的区域没有菌落出现(图2中C2标注区域)。由此判断，本实施例的噬菌体能够裂解粘质沙雷氏菌。
[0047] 实施例3噬菌体的裂解能力鉴定
[0048] 1、选取羽化5-7天的雌性埃及伊蚊，首先给蚊虫饲喂含有抗生素的10％蔗糖溶液(20单位青霉素和20毫克链霉素每毫升)，连续饲喂三天，每24h更换。
[0049] 2、饲喂三天后将含有抗生素的蔗糖溶液撤走，在温度28℃，湿度80％的条件下让其饥饿24小时。
[0050] 3、然后饲喂带有粘质沙雷氏菌的蔗糖溶液，连续饲喂三天。
[0051] 4、将上述蚊虫分成两组，其中一组只饲喂蔗糖溶液，另外一组饲喂添加了含上述实施例1的噬菌体(1×108PFU/ml)的蔗糖溶液。
[0052] 5、48h后每组挑选5只蚊虫进行实验。先用75％的乙醇溶液清洗伊蚊表面3次，灭菌PBS清洗一次，接着在体视显微镜下解剖伊蚊的中肠，放入装有400μL PBS的无菌的EP管中，用无菌的研磨棒进行研磨，稀释102倍涂板，37℃培养箱培养12h。
[0053] 结果如图3所示：对照组(即图3中mock组，10-2表示稀释102倍涂板)蚊子中肠涂板有粘质沙雷氏菌生长，而实验组(图3中C组和D组，10-2表示稀释102倍涂板)饲喂了噬菌体的平板没有粘质沙雷氏菌生长，表明本申请的噬菌体在蚊虫体内具有活性。
[0054] 以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
