[0001] 本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种新型固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶及其制备方法及应用。

[0002] 随着肥胖、糖尿病、“三高”等慢性病在全球范围内漫延。饮食中糖分的“健康摄取”成为新的健康课题，其中，低热量甜味剂的开发和应用是最为有效的途径之一。

[0003] D‑阿洛酮糖是一种稀有糖，兼具低热量(0.4kcal/g)与高甜度(蔗糖相对甜度的70％)的特点，在抑制肥胖、降血糖等方面具有潜在，在食品、医药、保健品等领域具有极大的应用潜力，但在自然界含量稀少，由D‑阿洛酮糖‑3‑差‑向异构酶催化D‑果糖C‑3位置发生差向异构反应生成D‑阿洛酮糖的生物催化法逐渐受到人们的关注。D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶可催化D‑果糖和D‑阿洛酮糖之间的相互转化，在反应过程中无需添加其他物质，反应后副产物少，有利于降低生产成本，使后续D‑阿洛酮糖的分离更加方便。

[0004] 但D‑阿洛酮糖3‑异构酶催化果糖转化为阿洛酮糖过程中，由于酶无法重复利用，使得该工艺成本较高，且反应结束后，D‑阿洛酮‑3‑异构酶本身作为杂蛋白，需要从反应体系中除去，增加了分离成本，因此，开发D‑阿洛酮糖3‑异构酶的固定化技术，使得D‑阿洛酮糖3‑异构酶可以重复利用，不仅可以大幅压缩发酵成本，也可以降低后续分离成本，对阿洛酮糖的产业发展具有十分重要的意义。

[0005] 然而，传统载体材料并不具有良好的可调性和结晶性，这可能会导致低蛋白装载效率、不稳定性以及酶易浸出，进而影响固定化酶的活性。将酶嵌入纳米材料成为近年来研究的热点，研究表明固定在纳米材料上的酶具有比天然酶更宽的pH和温度适应范围以及更高的热稳定性的特点。由于三维结构的纳米材料在表面积、反应活性、稳定性等方面优于其他纳米材料，因此三维纳米材料成为近年来研究酶固定的热点。无机硅纳米花(SNF)是一种新型的三维纳米材料，具有多孔隙、高比表面积及良好的化学和热稳定性等诸多优点，有望成为固定化酶制剂的新型优良载体。

[0066] 本发明提出的一种新型的固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的设计构思是：以D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶为酶蛋白，以无机硅纳米花(SNF)为固定化载体。主要包括，首先将所述SNF用3‑氨基丙基三乙氧基硅烷氨基化，随后加入交联剂戊二醛活化，最后加入D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶液在摇床中固化反应一段时间后，将反应物离心并洗涤，所得产物即为固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶。所述的固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的形貌呈球形，直径为300nm±10nm，该球形具有孔隙，孔隙中固定有所述的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶。本发明制备方法充分发挥SNF三维纳米材料所具有的多孔隙、高比表面积及良好的化学和热稳定性等诸多优点，使得制备得到的固定化酶具备稳定的纳米结构，可以固定更多的酶蛋白，从而使单位质量的固定化酶具有更高的酶学活性，并较游离酶而言，本发明制备的固定化酶具备更好的热稳定性、pH稳定性、储藏稳定性与重复使用性。

[0067] 下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的说明，但下述实施例绝非对本发明有任何限制。

[0068] 实施例1：固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶制备，包括以下步骤：

[0069] 1)SNF的制备：将1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，1g正丁醇，30g浓度为0.4M的尿素溶液一起加入圆底烧瓶，搅拌至清澈；加入12g环己烷，超声搅拌至混合溶液清澈，后转移到油浴锅稍微搅拌均匀后用针管滴加2g硅酸乙酯(TEOS)，随后封住瓶口，升温到70℃，密封环境下持续搅拌20h，将混合溶液10000rpm离心5min后得到白色沉淀，将该白色沉淀放入管式煅烧炉以550℃持续煅烧5h，煅烧过程全程通空气，煅烧产物即为SNF。

[0070] 2)SNF的氨基修饰：将0.29g的SNF置于250mL的圆底烧瓶中，分散到100mL正已烷中超声波震荡处理30min后，加入1mL 3‑氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，随后将圆底烧瓶置于水浴锅中，80℃下冷凝回流12h，所得产物记为氨基化纳米花，记为NH2‑SNF，将产物8000rpm离心5min分离,使用无水乙醇清洗几次，60℃烘箱干燥12h。

[0071] 3)戊二醛活化NH2‑SNF：将50mg NH2‑SNF加入到20mL终浓度为1.5％的戊二醛溶液中，将混合溶液于室温，摇床220rpm条件下反应4h，过滤分离沉淀并用纯水清洗三遍。

[0072] 4)固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶(DAEase@SNF)的制备：取10mg戊二醛修饰的NH2‑SNF分散到3mL的PBS缓冲溶液(100mM，pH＝7.5)中，超声分散均匀，再向混合溶液中加入2mL的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶(DAEase)蛋白浓度为12.5mg/mL的酶液，然后将混合液置于摇床上以220rpm在40℃下条件下反应3h，反应完成后8000rpm离心5min得到红棕色沉淀，将该红棕色沉淀用PBS缓冲溶液洗涤三次并冷冻干燥12h，所得产物即为固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶，记作DAEase@SNF。

[0073] 实施例2：催化活性的测定

[0074] 本发明中催化活性的测定方法是：以单位时间里阿洛酮糖的生成量来测定游离酶及实施例1制备得到的固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶DAEase@SNF的催化活性，一个酶活单位(U)定义为在最适pH(游离酶与固定化酶均为7.5)和55℃条件下，单位时间内每产生1μmoL阿洛酮糖的酶量。标准反应体系为2mL，包括40μL浓度为1mg/mL的DAEase或同等酶量的DAEase@SNF，1mL 200g/L果糖和960μL PBS缓冲溶液(100mM，pH＝7.5)，混合均匀，55℃水浴锅中孵育10min，于55℃水浴中准确计时反应10min，反应结束后，立即转移至100℃干式恒温仪中加热5min终止反应，离心后取1mL上清液用孔径0.22μm有机滤膜进行过滤，使用液相检测。

[0075] 对实施例1的DAEase@SNF催化活性测定得到其比酶活为1033.09U/g蛋白。

[0076] 实施例3：固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶交联剂戊二醛浓度优化[0077] 与实施例1的制备过程基本相同，不同仅为，在步骤3)戊二醛活化NH2‑SNF步骤中，制备出采用戊二醛溶液终浓度不同的7个DAEase@SNF的样品，即分别将7份的50mg NH2‑SNF加入到20mL终浓度分别为0.5％、1.0％、1.5％、2.5％、3％、4％、6％的戊二醛溶液中，将混合溶液于室温，摇床220rpm条件下反应4h，过滤分离沉淀并用纯水清洗三遍。将最终得到的7个DAEase@SNF样品用实施例2中的催化活性的测定方法进行催化活性进行测定。

[0078] 本实施例3制备的7个DAEase@SNF样品的催化活性如图1所示，当交联剂戊二醛终浓度为1.5％时，DAEase@SNF的相对酶活最高，固定化效果最好。

[0079] 实施例4：固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶交联时间优化

[0080] 与实施例1的制备过程基本相同，不同仅为，在步骤3)戊二醛活化NH2‑SNF步骤中，选择NH2‑SNF和戊二醛混合溶液于室温下摇床震荡的时间不同，最终制备7个DAEase@SNF的样品，即分别将7份的50mg NH2‑SNF加入到20mL终浓度分别为1.5％的戊二醛溶液中，将混合溶液于室温，摇床220rpm条件下震荡反应的时间(交联时间)分别为0.5h、1.5h、2.5h、3h、4h、4.5h、5h。将最终得到的7个DAEase@SNF样品用实施例2中的催化活性的测定方法进行催化活性进行测定，从而测定出最高的酶活力为100％，计算相对酶活。

[0081] 本实施例4制备的7个DAEase@SNF样品催化活性如图2所示，当交联时间为4h时，DAEase@SNF的相对酶活最高，固定化效果最好。

[0082] 实施例5：固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶蛋白浓度的优化[0083] 与实施例1的制备过程基本相同，不同仅为，步骤4)DAEase@SNF)的制备步骤中，向NH2‑SNF与PBS缓冲溶液的分散液中，加入2mL的不同蛋白浓度的DAEase酶液，最终制备得到5个DAEase@SNF样品。即：分别取5份的10mg戊二醛修饰的NH2‑SNF，各自分散到3mL的PBS缓冲溶液(100mM，pH＝7.5)中，超声分散均匀，再向混合溶液中加入2mL的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶(DAEase)酶液；每份样品中，混合溶液酶蛋白终浓度分别为2.5mg/mL、5.0mg/mL、
7.5mg/mL、10.0mg/mL、15.0mg/mL，最终得到5个DAEase@SNF样品。并用实施例2中的催化活性的测定方法进行催化活性进行测定，从而测定出最高的酶活力为100％，计算相对酶活。

[0084] 本实施例5制备的5个DAEase@SNF样品的催化活性如图3所示，当固定化酶蛋白浓度为5.0mg/mL时，DAEase@SNF的相对酶活最高，固定化效果最好。

[0085] 实施例6：固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化温度的优化

[0086] 与实施例1的制备过程基本相同，不同仅为，在步骤4)DAEase@SNF)的制备步骤中，将加有酶液的混合液于摇床上以220rpm在不同的固定化温度下反应3h，最终制备8个DAEase@SNF的样品。即分别取8份10mg戊二醛修饰的NH2‑SNF分散到3mL的PBS缓冲溶液(100mM，pH＝7.5)中，超声分散均匀，再向混合溶液中加入2mL的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶(DAEase)蛋白浓度为12.5mg/mL的酶液，然后将混合液置于摇床上以220rpm分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃下条件下反应3h，最终得到8个DAEase@SNF样品。并用实施例2中的催化活性的测定方法进行催化活性进行测定，从而测定出最高的酶活力为100％，计算相对酶活。

[0087] 本实施例制备的8个DAEase@SNF样品的催化活性如图4所示，当固定化温度为40℃时，DAEase@SNF的相对酶活最高，固定化效果最好。

[0088] 实施例7：固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化pH值的优化

[0089] 与实施例1的制备过程基本相同，不同仅为，在步骤4)DAEase@SNF)的制备步骤中，将戊二醛修饰的NH2‑SNF分散到3mL不同浓度和pH值的PBS缓冲溶液中，加入酶液后，控制混合溶液的最终pH值，最终最终制备6个DAEase@SNF的样品。即分别取6个10mg戊二醛修饰的NH2‑SNF分散到3mL的pH值分别为6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0的PBS缓冲溶液中，最终得到6个DAEase@SNF样品。并用实施例2中的催化活性的测定方法进行催化活性进行测定，从而测定出最高的酶活力为100％，计算相对酶活。

[0090] 本实施例制备的6个DAEase@SNF样品的催化活性如图5所示，当固定化pH＝8.5时，DAEase@SNF的相对酶活最高，固定化效果最好。

[0091] 实施例8：固定化D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化时间优化

[0092] 与实施例1的制备过程基本相同，不同仅为，在步骤4)DAEase@SNF)的制备步骤中，将加有酶液的混合液置于摇床上以220rpm在40℃下条件下反应，选取不同的固化反应时间，最终最终制备6个DAEase@SNF的样品。即取6份10mg戊二醛修饰的NH2‑SNF分别分散到3mL的PBS缓冲溶液(100mM，pH＝7.5)中，超声分散均匀，再向混合溶液中加入2mL的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶(DAEase)蛋白浓度为12.5mg/mL的酶液，然后将混合液置于摇床上以
220rpm在40℃下条件下反应0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，；最终得到6个DAEase@SNF样品。并用实施例2中的催化活性的测定方法进行催化活性进行测定，从而测定出最高的酶活力为100％，计算相对酶活。

[0093] 本实施例制备的6个DAEase@SNF样品的催化活性如图6所示，当固定化时间为3.0h时，DAEase@SNF的相对酶活最高，固定化效果最好。

[0094] 实施例9：对SNF和DAEase@SNF的表征

[0095] 采用扫描电镜(Scanning  electron  microscope，SEM)、透射电镜(Transmissionelectron microscope，TEM)、N2吸附‑脱附和激光共聚焦(Confocal laser scanningmicroscopy，CLSM)对SNF进行表征。

[0096] 图7为实施例1制备得到的无机硅纳米花(SNF)的扫描电镜图，可以看出，SNF表面粗糙多孔，具有明显的花状结构，粒径在340nm左右。

[0097] 图8为实施例1制备得到的无机硅纳米花(SNF)的透射电镜图，通过透射电子显微镜分析SNF的形貌结构，显示SNF具有通向中心的放射状孔道结构，这种结构极大增加了材料的比表面积，为酶提供了大量附着位点，可提高传质效率。

[0098] 图9为实施例1制备得到的无机硅纳米花(SNF)的扫描透射高角形环形暗场和对应的mapping图像，其中，图9‑1是扫描透射高角形环形暗场，对SNF进一步进行元素检测得到对应的mapping图像；图9‑2显示SNF材料中C、N、O和Si元素均匀分布，证实了无机硅纳米花的成功制备。

[0099] 图10‑1和图10‑2分别是实施例1制备得到的固定化酶的N2吸附‑脱附曲线和孔径分布图。10‑1显示实施例1制备得到的SNF具备典型的IV型吸附‑脱附等温线，证明SNF是一种典型的介孔材料。图10‑2显示SNF孔道的平均孔径分布在10‑15nm。由BET和BJH结果分析2 3
可知，SNF的比表面积和孔体积分别为587.0m/g和1.78cm/g，说明SNF具有较大的比表面积和孔体积，有助于提高固定效率，减少催化过程中底物和产物的扩散限制。实施例1制备得
2 3
到的NH2‑SNF的比表面积和孔体积分别为159.9m/g和0.99cm/g。相比于SNF，NH2‑SNF的比表面积和孔体积都有一定程度的降低，证明SNF的孔道结构有一定程度的覆盖，这也从侧面证实了SNF的成功氨基化。实施例1制备得到的DAEase@SNF的比表面积和孔体积分别为
2 3
99.5m/g和0.62cm /g，相比于NH2‑SNF，DAEase@SNF的比表面积和孔体积都有一定程度的降低，证明SNF的孔道结构有一定程度的覆盖，这也从侧面证实了DAEase@SNF的成功制备。

[0100] 图11为实施例1制备得到的固定化酶的激光共聚焦分析图。使用罗丹明B对DAEase进行荧光标记。用荧光标记的蛋白来制备固定化酶，并在激光共聚焦显微镜下观察DAEase@SNF。在特定波长的激发光作用下荧光标记的酶分子显示出红色。证明DAEase@SNF成功固定在载体上。

[0101] 实施例10：反应温度对实施例1的DAEase@SNF酶活的影响

[0102] 在pH＝7.5条件下，采用标准反应体系(标准反应体系与实施例2相同)测定DAEase@SNF在30‑80℃温度范围内的活性，以测定的最适温度下的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图12所示，DAEase@SNF的最适反应温度为55℃。

[0103] 实施例11：反应pH对实施例1的DAEase@SNF酶活的影响

[0104] 在55℃条件下，采用标准反应体系(标准反应体系与实施例2相同)测定DAEase@SNF在pH＝4‑10的pH范围内的活性，以测定的最适pH下的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图13所示，DAEase@SNF的最适反应pH为7.5。

[0105] 实施例12：30℃环境下DAEase和DAEase@SNF的稳定性

[0106] 分别用pH＝7.5的缓冲液将DAEase及实施例1的DAEase@SNF制备成溶液，将此溶液置于30℃水浴锅中，每隔一段时间取一次样，采用标准反应体系(标准反应体系与实施例2相同)测定DAEase及DAEase@SNF的活性，以未作热处理的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图14所示，DAEase@SNF具有较好的热稳定性，30℃孵育6h后仍保留初始活性的90.09％，而而游离酶活性仅剩55.24％。以实施例3中4％终浓度戊二醛活化得到的DAEase@SNF重复30℃环境下稳定性的实验，测得该DAEase@SNF在30℃孵育6h后保留的初始活性为
5.18％。

[0107] 实施例13：70℃环境下DAEase和DAEase@SNF的稳定性

[0108] 分别用pH＝7.5的缓冲液将DAEase及实施例1的DAEase@SNF制备成溶液，将此溶液置于70℃水浴锅中，每隔一段时间取一次样，采用标准反应体系(标准反应体系与实施例2相同)测定DAEase及DAEase@SNF的活性，以未作热处理的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图15所示，DAEase@SNF具有较好的热稳定性，70℃孵育6h后仍保留初始活性的9.72％，而而游离酶活性为0％。以实施例3中4％终浓度戊二醛活化得到的DAEase@SNF重复70℃环境下稳定性的实验，测得该DAEase@SNF在70℃孵育6h后保留的初始活性为82.56％。

[0109] 实施例14：pH＝5.0环境下DAEase和DAEase@SNF的稳定性

[0110] 分别用pH＝5.0的缓冲液将DAEase及实施例1的DAEase@SNF制备成溶液，将此溶液置于4℃保存，每隔一段时间取一次样，采用标准反应体系(标准反应体系与实施例2相同)测定DAEase及DAEase@SNF的活性，以未作酸性环境处理的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图16所示，DAEase@SNF具有较好的pH稳定性，pH＝5.0环境下孵育6h后仍保留初始活性的88.28％，而而游离酶活性为48.63％。以实施例3中4％终浓度戊二醛活化得到的DAEase@SNF重复pH＝5.0环境下稳定性的实验，测得该DAEase@SNF在pH＝5.0孵育6h后保留的初始活性为75.63％。

[0111] 实施例15：pH＝9.0环境下DAEase和DAEase@SNF的稳定性

[0112] 分别用pH＝9.0的缓冲液将DAEase及实施例1的DAEase@SNF制备成溶液，将此溶液置于4℃保存，每隔一段时间取一次样，采用标准反应体系(标准反应体系与实施例2相同)测定DAEase及DAEase@SNF的活性，以未作碱性环境处理的酶活力为100％，计算相对酶活。结果如图17所示，DAEase@SNF具有较好的pH稳定性，pH＝5.0环境下孵育6h后仍保留初始活性的97.86％，而而游离酶活性为69.56％。以实施例3中4％终浓度戊二醛活化得到的DAEase@SNF重复pH＝9.0环境下稳定性的实验，测得该DAEase@SNF在pH＝9.0孵育6h后保留的初始活性为94.73％。

[0113] 实施例16：DAEase@SNF的储藏稳定性

[0114] 将实施例1的DAEase@SNF置于4℃条件下保存，每隔一天取等量的DAEase@SNF在55℃，pH＝7.5条件下，在标准反应体系(标准反应体系与实施例2相同)中检测DAEase@SNF的活性，重复上述操作15d，记录每天反应后的催化活性，以第一天反应的酶活力为100％，计算之后反应过程的相对酶活，以此来测定DAEase@SNF的储藏稳定性。结果如图18所示，DAEase@SNF具有良好的储藏稳定性，储藏15d后仍保留初始活性的54.38％。以实施例3中4％终浓度戊二醛活化得到的DAEase@SNF重复储藏稳定性的实验，测得该DAEase@SNF储藏
15d后保留的初始活性为46.27％。

[0115] 实施例17：DAEase@SNF的重复使用次数

[0116] 在55℃，pH＝7.5条件下，在标准反应体系(标准反应体系与实施例2相同)中检测实施例1的DAEase@SNF的活性，反应完成后以10,000rpm的速度离心5min，从反应液中将固定化酶分离出来，使用超纯水清洗一次后再次重复上述反应过程，以此类推，记录每次反应后的催化活性，以第一次反应的酶活力为100％，计算之后反应过程的相对酶活，以此来测定DAEase@SNF的重复利用率。结果如图19所示，DAEase@SNF具有良好的重复使用性，重复使用10次后仍保留初始活性的70.78％。以实施例3中4％终浓度戊二醛活化得到的DAEase@SNF重复重复使用次数的实验，测得该DAEase@SNF重复使用10次后保留的初始活性为70.78％。

[0117] 实施例18：DAEase@SNF催化果糖制备阿洛酮糖的固定化酶转化能力

[0118] 在2mL 100g/L果糖溶液中加入10mg实施例1的DAEase@SNF，混合均匀，于55℃水浴中准确计时反应2h，反应结束后，立即转移至100℃干式恒温仪中加热5min终止反应，离心后取1mL上清液用孔径0.22μm有机滤膜进行过滤，使用液相检测。重复上述过程，调整反应时间分别为4、6、8、10、12、14、16、18、20h，然后均分别使用液相检测。

[0119] 检测结果如图20所示，DAEase@SNF可催化果糖制备阿洛酮糖，反应2‑10h阿洛酮糖转化率上升较快，反应时间12h时转化率为31.42％，反应20h转化率为31.27％，曲线较平直，即使延长反应时间，转化率也未发生明显变化，说明固定化酶转化能力稳定在31％左右，同时也说明此酶没有促进逆反应的活力。

[0120] 尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多改进和变化，例如，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，这些均属于本发明的保护之内。