技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及基于LAMP技术检测星形诺卡菌的引物组、探针及试剂盒。
相关背景技术
[0002] 诺卡菌属是一群需氧性放线菌，多为腐生菌，广泛分布于土壤，有51个菌种，对人体致病的主要有3种：星形诺卡菌、巴西诺卡菌和豚鼠诺卡菌。其中星形诺卡菌在我国最常见，致病力最强。
[0003] 星形诺卡菌主要经呼吸道或创口侵入机体，引起化脓性感染。免疫力低下的患者，如艾滋病、肿瘤和长期使用免疫抑制剂的患者，感染后可引起肺炎、肺脓肿。
[0004] 目前对星形诺卡菌的临床检测多依赖于实时荧光PCR技术和基于荧光染料的环介导等温扩增技术。但实时荧光PCR技术需要昂贵的仪器设备，容易产生交叉污染，对操作人员的技术要求较高。而基于荧光染料的环介导等温扩增技术虽然不需要昂贵的仪器设备、耗时短、可以用于快速检测，但容易产生非特异性扩增，无法对扩增产物进行鉴定，且不能使用内标，不能监控提取过程，无法防止假阴性。
[0005] 因此，寻找一种可以快速、简便、操作性强、特异性好、对仪器要求低的诊断星形诺卡菌感染的技术方法，对于解决临床上星形诺卡菌确诊时间周期长、仪器要求高等问题具有十分重要的意义，将为临床上早期诊断和及时治疗提供便利。
具体实施方式
[0070] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
[0071] 实施例1
[0072] (1)引物探针的设计与筛选
[0073] 本发明针对星形诺卡菌设计三组引物、探针，具体序列如表1；内标设计三组引物、探针，具体序列如表2。
[0074] 表1：星形诺卡菌引物探针序列
[0075]
[0076]
[0077] 表2：内标的引物探针序列
[0078]
[0079]
[0080] (2)配制扩增反应试剂混合物
[0081] 扩增反应试剂混合物含有上述表1和表2中的引物探针、pH8.5的Tris‑HCl缓冲液、Bst DNA聚合酶、UNG酶、镁离子以及dNTPs。其中，典型的扩增反应试剂混合物中各组分在PCR反应体系中的含量如下：20mM的Tris‑HCl缓冲液、8mM的MgSO4、每种dNTPs 0.4mM、0.1μM的第一条寡核苷酸探针、0.1μM的第二条寡核苷酸探针、8U的链置换DNA聚合酶、0.2U的UNG酶、外引物Na‑F3、Na‑B3、IC‑F3、IC‑B3的含量均为0.2μM、内引物Na‑FIP、Na‑BIP、IC‑FIP、IC‑BIP的含量均为1.6μM、环引物Na‑LB、IC‑LF、IC‑LB的含量均为0.8μM。采用纯水为溶剂，配制反应试剂混合物，备用。分别配制Na基因的三组引物探针的扩增反应试剂混合物，筛选出较佳的Na基因引物探针体系。另外，分别配制内标的三组引物探针的扩增反应试剂混合物，筛选出较佳的内标引物探针体系。
[0082] (3)待测样本的核酸提取
[0083] 获取感染星形诺卡菌的痰液阳性样本，使用核酸提取试剂盒提取样本DNA(3DMed，货号3000000000358)，提取的DNA为后续环介导等温扩增的模板。
[0084] (4)环介导等温扩增
[0085] 将上述提取到的待测样本的核酸作为模板，将12.5μL模板加入八连管中，然后加入12.5μL扩增反应试剂混合物，形成体积为25μL的反应体系，置于恒温扩增分析仪或实时荧光检测仪中，63℃扩增40min，反应结束后，判读结果。
[0086] (4)试验结果
[0087] 实验结果参见图1A和图1B，分别为星形诺卡菌以及内标靶标的引物探针筛选结果；其中，图1A为星形诺卡菌的引物探针筛选结果；图1B为内标的引物探针筛选结果。图1结果显示，星形诺卡菌的第一组引物探针的扩增效果较佳，内标的第一组引物探针扩增效果较佳。
[0088] 实施例2试剂盒的制备
[0089] (1)配制扩增反应试剂混合物，其中该扩增反应试剂混合物含有上述表1中Na的第一组引物探针和表2中内标的第一组引物探针、PH8.5的Tris‑HCl缓冲液、Bst DNA聚合酶、UNG酶、镁离子以及dNTPs。其中，典型的扩增反应试剂混合物中各组分在PCR反应体系中的含量如下：20mM的Tris‑HCl缓冲液、8mM的MgSO4、每种dNTPs 0.4mM、0.1μM的第一条寡核苷酸探针、0.1μM的第二条寡核苷酸探针、8U的链置换DNA聚合酶、0.2U的UNG酶、外引物Na‑F3、Na‑B3、IC‑F3、IC‑B3的含量均为0.2μM、内引物Na‑FIP、Na‑BIP、IC‑FIP、IC‑BIP的含量均为1.6μM、环引物Na‑LB、IC‑LF、IC‑LB的含量均为0.8μM。采用纯水为溶剂，配制反应试剂混合物，备用。
[0090] (2)待测样本的核酸提取
[0091] 取3个疑似感染星形诺卡菌的痰液样本，使用核酸提取试剂盒提取样本DNA(3DMed，货号3000000000358)，提取的DNA为后续环介导等温扩增的模板。
[0092] (3)环介导等温扩增
[0093] 将上述提取到的待测样本的核酸作为模板，将12.5μL模板加入八连管中，然后加入12.5μL扩增反应试剂混合物，形成体积为25μL的反应体系，置于恒温扩增分析仪或实时荧光检测仪中，63℃扩增40min，反应结束后，判读结果。
[0094] (4)试验结果
[0095] 实验结果参见图2，为星形诺卡菌和内标双重扩增临床样本的检测结果。图2结果显示，样本1和样本2的检测结果均为星形诺卡菌阳性和内标阳性，代表样本1和样本2中有星形诺卡菌的存在；而样本3的检测结果为星形诺卡菌阴性且内标阳性，代表样本3中无星形诺卡菌的存在。3个样本的检测结果与临床诊断结果一致。
[0096] 上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
