[0001] 本实用新型涉及一种微生物分析器材，具体涉及活菌DNA快速筛选仪。

[0002] 弧菌(Vibrio)是水产品中最为常见的致病菌，副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是我国主要水产源致病菌，由该菌引起的食物中毒事件居细菌性食物中毒事件的首位，同时也被视为世界范围内导致腹泻类疾病的最为主要因素之一。霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是导致人体产生霍乱疾病的主要源头，流行广泛且属于烈性传染病之一，曾多次引起大面积的疾病，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，严重的可导致死亡，如何快速、精准和高效地检测水产品中致病弧菌具有重要意义。

[0003] 传统定量检测食品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法通常需要1周时间，基于DNA的 qPCR定量技术虽简便快捷，但无法区分样品中死菌和活菌，容易导致假阳性现象。光敏型核酸染料叠氮溴化丙锭(PMA)与qPCR技术相结合，可以选择性地识别水产品中的活菌DNA，可用于进行活菌定量检测。但是，PMA前处理包括暗处理和光交联两个关键步骤，传统的 PMA前处理方法通常在一个密闭的环境进行暗处理，手持600W左右的钠钨灯进行光交联，过程繁琐，全程人工操作费时耗力；基于蓝光LED管的光交联仪器(产自PMA公司)虽可大大简化PMA前处理过程，但其将暗处理和光交联的两个步骤分开处理，仍需繁琐的人工转移操作。实用新型内容

[0004] 本实用新型的目的是提供一种活菌DNA快速筛选仪，可将暗处理和光交联两个核心结构合二为一，实现PMA前处理过程一体化和全自动化，可以快速、精准和高效地检测水产品中致病弧菌。

[0005] 为实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：

[0006] 本实用新型提供的活菌DNA快速筛选仪，包括PMA顶盖、LED蓝光灯光源和由带有凹槽结构的上箱体和内置有电机的下箱体固定连接为一体的长方体箱式结构；

[0007] 还包括置于所述上箱体内的数显式计时器、数显式旋转调节器和旋转混匀器，所述旋转混匀器平行固定于所述上箱体的凹槽内侧且可沿其中轴旋转，其上均匀分布有若干样品放置孔；

[0008] 所述LED蓝光灯光源为多个且均匀分布于所述上箱体内；

[0009] 所述PMA顶盖为不透明材质且橡胶封边的L形平板结构，位于所述旋转混匀器的上方，其一边固定于所述上箱体凹槽开口一侧，另一边可沿所述上箱体凹槽开口另一侧自由开合，当其闭合时与所述上箱体凹槽开口完全密封。

[0010] 优选地，所述PMA顶盖外侧设有防水绝缘门把手。

[0011] 优选地，所述LED蓝光灯光源的数量为24个，功率为1‑3w，电压参数为3.0‑3.7V，电流为350‑1000mA，色温波长为410‑420nm蓝中偏紫/深蓝光，且与PMA的激发波长一致。

[0012] 优选地，所述旋转混匀器为304不锈钢材质。

[0013] 优选地，所述活菌DNA快速筛选仪的尺寸为25cm×20cm×20cm。

[0014] 优选地，所述数显式计时器和数显式旋转调节器的控制面板均位于所述上箱体上表面。

[0015] 所述活菌DNA快速筛选仪对待检测样品进行活菌DNA检测的方法，包括以下步骤：

[0016] (1)待检测样品中添加PMA并置于旋转混匀器的样品放置孔内，启动所述活菌DNA 快速筛选仪，设定暗处理时间、光交联时间和混匀速度参数，开启LED蓝光灯光源并关闭 PMA顶盖，形成同时进行暗处理和光交联反应环境；

[0017] (2)根据上述设定参数同时进行暗处理和光交联反应：在避光黑暗条件下PMA选择性地进入检测样品中细胞膜损伤的死菌细胞内，在激发光源激活下PMA的叠氮基团分解为氮稀类化合物与双链DNA的碳氢化合物发生光交联反应，得到共价交联沉淀物，抑制死菌 DNA扩增。

[0018] 上述活菌DNA快速筛选仪可用于定量检测水产品中弧菌，如副溶血性弧菌ATCC 33847 或霍乱弧菌GIM1.449。

[0019] 与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：

[0020] 1.本实用新型将暗处理和光交联两个核心步骤设计合二为一，实现PMA前处理过程的一体化和全自动化，从根本上简化PMA‑qPCR的前处理过程，提升PMA的处理效率。

[0021] 2.本实用新型可根据自身需求设定暗处理时间、光交联时间和混匀速度，PMA前处理条件灵活，采用的LED蓝光灯光源能够在长时间工作下保持较低的热能输出且不会破坏样本DNA，避免传统卤素灯(600‑1000W)照射时释放大量热量灼伤样品中活菌DNA引起假阴性的缺陷，同时保证PMA与死菌DNA充分交联，安全可靠。

[0022] 3.本实用新型的检测方法对细胞膜完整的死菌没影响，且可完全消除死菌DNA假阳性结果，用于检测水产品中致病弧菌(如副溶血性弧菌ATCC33847与霍乱弧菌GIM1.449)快速、精准和高效。

[0023] 4.本实用新型的活菌DNA快速筛选仪为一体箱式结构，小巧便携。

[0024] 以下将结合附图对本实用新型的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本实用新型的目的、特征和效果。

[0028] 下面通过具体实例和附图，对本实用新型的技术方案做进一步的菌体说明。应当理解，以下描述的具体实例仅用于解释文本实用新型，并不用于限定本实用新型。所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本实用新型中的实施例，本领域的普通技术人员咋没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

[0029] 参见图1，示例性地描述了一种活菌DNA快速筛选仪，包括PMA顶盖1、LED蓝光灯光源2和由带有凹槽结构的上箱体7和内置有电机6的下箱体8固定连接为一体的长方体箱式结构；

[0030] 还包括置于上箱体7内的数显式计时器3、数显式旋转调节器4和旋转混匀器5，旋转混匀器5平行固定于上箱体7的凹槽内侧且可沿其中轴旋转，其上均匀分布有若干样品放置孔；

[0031] LED蓝光灯光源2为多个且均匀分布于上箱体7内；

[0032] PMA顶盖1为不透明材质且橡胶封边的L形平板结构，位于旋转混匀器5的上方，其一边固定于上箱体7凹槽开口一侧，另一边可沿上箱体7凹槽开口另一侧自由开合，当其闭合时可与上箱体7凹槽开口完全密封。

[0033] 一实施例中，PMA顶盖1外侧设有防水绝缘门把手。

[0034] 一实施例中，LED蓝光灯光源2的数量为24个，功率为1‑3w，电压参数为3.0‑3.7V，电流为350‑1000mA，色温波长为410‑420nm蓝中偏紫/深蓝光，且与PMA的激发波长一致。

[0035] 一实施例中，旋转混匀器5为304不锈钢材质。

[0036] 一实施例中，活菌DNA快速筛选仪的尺寸为25cm×20cm×20cm。

[0037] 一实施例中，数显式计时器3和数显式旋转调节器4的控制面板均位于上箱体7上表面。

[0038] 实施例1

[0039] 采用如图1所示的活菌DNA快速筛选仪定量检测南美白对虾中弧菌，步骤如下：

[0040] (1)构建活菌DNA快速筛选仪

[0041] LED蓝光灯购自于美国CREE公司，共24个，功率为1‑3w，电压参数为3.0‑3.7V，电流范围为350‑1000mA，色温波长为410‑420nm蓝中偏紫/深蓝光；数显式计时器购自于温州大华仪器有限公司；数显式旋转调节器购自于中国台湾精研电机有限公司(JSCC)；变压器购自于中国台湾明伟有限公司；焊接仪器使用氩弧焊机购自于深圳锐龙焊机，产品型号：TIG 400GT；不锈钢板购自于厦门钨业，1.5mm，食品级304。

[0042] (2)副溶血性弧菌和霍乱弧菌菌株

[0043] 菌株采用副溶血性弧菌ATCC33847与霍乱弧菌GIM1.449，霍乱弧菌GIM1.449购自于广东微生物研究所，为非O1和非O139的低毒性菌株。取甘油管中菌种液划线接种于科玛嘉弧菌显色培养基平板，挑取单菌落于10mL TSB(1％NaCl，pH 8.0)之中，整个过程在生物安全柜中进行。将接种后的菌液置于培养条件为37℃、转速为200r/min的细菌培养箱中，过9 7
夜培养16‑24h，获得10CFU/mL的副溶血性弧菌培养液，以及10CFU/mL的霍乱弧菌培养液。

[0044] (3)叠氮溴化丙锭前处理

[0045] 取100μL PMAxx(Biotium,Hayward,CA,USA)溶解于900μL双蒸水中，得到2mM 的母液，放置于‑20℃冰箱避光保存。用移液枪量取25μL的PMA溶液加入975μL样品，获得终浓度为50μM的PMA‑样品混合液，将样品置于黑暗条件下处理30min，使PMA穿透死细胞并与死菌的DNA相交联。

[0046] 将暗处理之后的样品置于仪器PMA‑LiteTMLED蓝光光交联装置(Biotium,Hayward, CA,USA)中，利用LED光源曝光30min，以确保PMA与死菌的DNA完全相互交联在一起。将样品液置于13,400×g条件下高速离心10min，收集菌体，用于后续的DNA提取和PCR 反应分析。

[0047] (4)基于活菌DNA筛选仪器的PMA前处理过程

[0048] 在1mg PMA中加入980μL的双蒸水，配制2mM的PMA储存液。将12.5μL的PMA 母液加入待测样品中，得到终浓度为50μM的PMA与样品的混合液。将样品放置于步骤(1) 构建的活菌DNA筛选仪器中，设定暗处理时间为30min，光处理时间为30min，启动仪器。在1000rpm的转速下，使样品中的死菌DNA与PMA在仪器中充分反应，形成稳定的共价交联沉淀物，以达到筛选活菌DNA的目的，将充分反应后的样品于12000rpm下高速离心收集活菌菌体，用天根细菌DNA提取试剂盒提取样本中的活菌DNA。

[0049] (5)引物、探针及PCR反应条件

[0050] a.用于定量检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的引物和探针如表1所示，于美国 Thermofisher旗下的子公司英潍捷基Invitrogen公司订制。

[0051] 表1:PMA‑qPCR的引物及探针

[0052]

[0053] 注：VP：副溶血性弧菌；VC霍乱弧菌。

[0054] b.qPCR反应条件

[0055] 预变性温度：95℃，2min；变性95℃，变性时间：15s；退火温度：60℃，退火时间： 1min变性和退火过程共40个循环。

[0056] c.20μL qPCR反应体系：

[0057] 0.2μL Taq DNA聚合酶、0.5μL的正向引物、0.5μL的反向引物、0.2μL的TaqMan 探2+
针、2μL的PCR反应溶液、1.2μL的Mg 溶液、0.8μL的dNTPs溶液、1μL的模板，其余加ddH2O补足
20μL。

[0058] 上述试剂均来自于美国Thermofisher旗下的子公司英潍捷基Invitrogen公司，上述 PCR反应在7500Fast real‑time PCR仪器中进行。

[0059] (6)PMA两重qPCR技术的特异性分析

[0060] 用于PMA两重qPCR特异性检测的菌株如表2所示，包括62株副溶血性弧菌、31株霍乱弧菌、3株弧菌属的其他菌株以及7株非弧菌属的菌株。用天根细菌DNA提取试剂盒提取不同菌株的DNA，进行PMA两重qPCR检测，以验证PMA两重qPCR的专一性和特异性，每组实验重复3次。

[0061] 表2:用于特异性分析的菌株

[0062]菌株种类 菌株编号 菌株数量
弧菌属    
副溶血性弧菌 ATCC 33847 1
  ATCC 17802 1
  VPD1‑VPD20(水产样本分离株) 20
  VPC1‑VPC40(临床样本分离株) 40
霍乱弧菌 GIM1.449 1
  VCW1‑VCW30(水产样本分离株) 30
鳗弧菌 CICC 10475 1
河流弧菌 CGMCC 1.1611 1
创伤弧菌 MCCC 1H0006 1
其他菌属 ‑ ‑
单增李斯特菌 ATCC 19112 1
英诺克李斯特菌 ATCC 33090 1
威尔士李斯特菌 ATCC 43548 1
肠炎沙门氏菌 CMCC 50041 1
鼠伤寒沙门氏菌 CICC 21484 1
大肠杆菌O157:H7 ATCC 43889 1
金黄色葡萄球菌 CCTCC AB 91093 1

[0063] (7)PMA两重qPCR技术标准曲线的构建

[0064] 基于实际样品构建标准曲线，生鲜南美白对虾购于上海浦东新区的水产市场。称取25g 南美白对虾分别加入225mL的碱性蛋白胨水(APW)中，于均质仪中进行均质，获得南9 7
美白对虾均质液。取10CFU/mL的副溶血性弧菌和10CFU/mL霍乱弧菌菌液，用南美白对虾均
1 8 1
质液对菌液进行稀释，获得携带10 至10CFU/mL(g)副溶血性弧菌的样本，以及携带10 至
6
10CFU/mL(g)霍乱弧菌的样本。

[0065] 进行PMA前处理、DNA提取以及PMA两重qPCR定量检测，利用菌落计数的结果和两重 qPCR的CT值构建反应的标准曲线，以判断该PMA两重qPCR的最低检测限(LOD)。以标准曲线‑1/k的斜率(k)，利用公式E＝10 ‑1计算PMA两重qPCR反应的扩增效率，副溶血性弧菌标准曲
2 2
线的R为0.980、标准曲线的斜率为‑3.16、扩增效率为107.23％，霍乱弧菌标准曲线的R 为
0.985、标准曲线的斜率为‑3.16、扩增效率为94.92％。

[0066] (8)致病性弧菌死菌的制备

[0067] 吸取10mL、107CFU/mL的副溶血性弧菌和霍乱弧菌菌液，置于121℃高温高压灭菌锅中处理20min，以获得副溶血性弧菌和霍乱弧菌的死菌细胞。运用科玛嘉弧菌显色培养确认细菌的活力，并用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)和胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)进行二次确认：于37℃培养18‑24h，若无细菌生长，则证明细菌已经彻底死亡。

[0068] (9)PMA两重qPCR在南美白对虾中的应用

[0069] 用于人工接种的生鲜南美白对虾购于上海浦东新区的水产市场，选用9组南美白6
对虾样本接种不同比例的死活菌，具体接种方式如表3所示。加入10CFU/mL(g)的死菌进行干扰，验证PMA两重qPCR方法区分死活菌的能力，并使用传统平板计数方法以及普通 qPCR方法作为对照。

[0070] 表3:PMA两重qPCR技术在南美白对虾中区分死活菌的能力

[0071]

[0072] 注：VP：副溶血性弧菌；VC霍乱弧菌。

[0073] 实施例2

[0074] 本实施例与实施例1基本相同，所不同的地方是应用样本为购于上海浦东新区的2
水产市场的太平洋牡蛎。PMA两重qPCR技术标准曲线中，副溶血性弧菌标准曲线的R 为
2
0.999、标准曲线的斜率为‑3.47、扩增效率为94.17％，霍乱弧菌标准曲线的R为0.975、标准曲线的斜率为‑3.47、扩增效率为93.07％，结果如表4所示。

[0075] 表4：PMA两重qPCR技术在对太平洋牡蛎中区分死活菌的能力

[0076]

[0077] 注：VP：副溶血性弧菌；VC霍乱弧菌。

[0078] 实施例3

[0079] 本实施例与实施例1基本相同，所不同的地方是应用样本为采自于上海市奉贤区2
集贤虾业的对虾养殖环境水体。PMA两重qPCR技术标准曲线中，副溶血性弧菌标准曲线的R
2
为0.988、标准曲线的斜率为‑3.49、扩增效率为93.43％，霍乱弧菌标准曲线的R为0.994、标准曲线的斜率为‑3.49、扩增效率为90.94％，结果如表5所示。

[0080] 表5：PMA两重qPCR技术在对虾养殖环境水体中区分死活菌的能力

[0081]

[0082]

[0083] 注：VP：副溶血性弧菌；VC霍乱弧菌。

[0084] 实施例4

[0085] 本实施例与实施例1基本相同，所不同的地方是应用样本采集于上海市东方国际水产中心，共采集水产品108份样品，包括虾类样品48份、贝类样品23份、淡水鱼类样品18 份、海藻类样品19份。运用PMA两重qPCR技术进行普查，并利用ISO标准方法(2007) 进行验证，结果如表6所示。

[0086] 表6：PMA两重qPCR技术在实际水产样本中的应用

[0087]

[0088] 注：VP：副溶血性弧菌，VC：霍乱弧菌。

[0089] 以上所述，仅为本实用新型的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。因此，本实用新型的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。