[0001] 本实用新型涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测猫呼吸道五种病原的试剂盒。

[0002] 猫疱疹病毒Ⅰ型、猫杯状病毒、支原体、衣原体、支气管败血波士杆菌是猫最常感染的呼吸道病原体。

[0003] 猫疱疹病毒Ⅰ型(Felineherpesvirus1，FHV‑1)是一种有囊膜的双链DNA病毒，对所有猫科动物易感。研究表明，该病毒感染可引起将近一半的猫呼吸道疾病，诱发猫的传染性
鼻气管炎，进一步导致猫急性、高度接触性上呼吸道感染，常见表现为打喷嚏、咳嗽、流涕、
结膜炎和发热等，发病率高达100％，死亡率达50％，感染后可终生带毒排毒，并可垂直传
播，孕猫可致流产。

[0004] 猫杯状病毒(Felinecalicivirus，FCV)是一种无囊膜的单链RNA病毒，其感染是猫的多发病，发病率较高，主要表现为上呼吸道症状，病猫表现精神沉郁、发热、结膜炎、口炎、
流涕等。感染FCV后部分病猫可恢复健康，部分成为无症状携带者，对健康猫造成威胁。

[0005] 支原体是一类介于细菌和病毒之间的原核生物，基因组含有DNA和RNA，广泛分布于外界环境及动植物体内。猫支原体感染主要引起猫传染性呼吸道疾病，造成打喷嚏、咳
嗽、流泪、结膜炎、流涕、呼吸困难等呼吸道症状，对幼猫危害较大。目前没有有效的猫支原
体感染的预防方法，因此一旦感染发病，需要及时治疗。

[0006] 衣原体是一类介于立克次体与病毒之间的微生物，含DNA和RNA两种核酸，能引起人和动物的衣原体病。猫衣原体感染发病率高，是猫的常见传染病之一，容易导致猫慢性结
膜炎。猫感染衣原体主要引起眼部及呼吸道感染，包括结膜炎、鼻炎、肺炎等。如治疗不及时
还可能会造成全身性的衣原体感染。

[0007] 支气管败血波士杆菌(Bordetellabronchiseptica，Bb)为一种呼吸道病原菌，可感染多种动物引起呼吸道疾病。病猫主要表现鼻液、流泪、打喷嚏等呼吸道症状，对幼猫感
染率更高。

[0008] 综上，从症状来看，上述五种病原感染后的临床表现接近，不通过针对性的诊断方法难以区分；此外，这五种病原容易发生混合感染，为临床准确诊断带来极大挑战。现有临
床常用的诊断技术需要依赖血清学、病毒分离鉴定、细菌培养等方法，往往操作时间长、分
离鉴定所需的培养条件复杂，成功率不高，影响医生及时、准确地制定治疗策略，急需建立
更加快速、准确的诊断方法。近年来以荧光定量PCR技术平台为基础的核酸检测产品已广泛
应用于人类病原体的诊断，且常作为诊断结果判定的“金标准”；针对动物诊断领域，也陆续
开发出了相关核酸检测产品，但多数产品仍存在检测操作步骤繁琐、耗时较长、检测性能不
佳等情况，且检测靶标多为单一病原，难以同时快速检测五种病原，不能良好匹配临床混合
感染的检测需求。为此，我们提出一种用于检测猫呼吸道五种病原的试剂盒。
实用新型内容

[0009] 本实用新型的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种用于检测猫呼吸道五种病原的试剂盒。

[0010] 为了实现上述目的，本实用新型采用了如下技术方案：

[0011] 一种用于检测猫呼吸道五种病原的试剂盒，包括盒体，所述盒体内底壁活动设置有与盒体内壁相贴合的底部海绵板，底部海绵板顶端面活动设置有内衬，且内衬顶端面活
动设置有顶部海绵板，内衬间隔开设有若干个第一限位孔和若干个第二限位孔，第一限位
孔内分别独立地放置扩增试剂一管、扩增试剂二管、质控品一管、质控品二管和稀释液管，
第二限位孔内放置核酸释放剂管，扩增试剂一管中包括PCR反应液和引物探针组一，扩增试
剂二管中包括PCR反应液和引物探针组二，质控品一管中包括核酸释放剂和阴性质控品，质
控品二管中包括核酸释放剂和阳性质控品。

[0012] 优选的，所述稀释液管中的组分为RNA专用稀释液，核酸释放剂的组分包括三羟甲基氨基甲烷。

[0013] 优选的，所述PCR反应液为单管一步法PCR试剂，PCR反应液组分包括dNTPs、TaqDNA2+
聚合酶、反转录酶、Mg 和无菌水。

[0014] 优选的，所述第一限位孔的数量设置为五个。

[0015] 优选的，所述盒体一侧侧壁顶端面设置有盒盖，且盒盖覆盖于顶部海绵板时，盒体呈良好封闭状态。

[0016] 本实用新型的有益效果是：

[0017] 1、稳定性好，试剂盒采用PCR反应液与引物探针混合的形式，可在37℃条件下稳定保存72小时，‑20℃反复冻融10次，扩增效果无明显差异；

[0018] 2、单管PCR反应液使用方便，避免使用过程中配制错误的情况发生，并且操作步骤简洁，无需单独的核酸提取步骤，核酸释放剂处理样本经稀释后可直接用于PCR扩增；

[0019] 3、海绵板的设置是为了提供缓冲，减少运输途中试剂管的晃动和碰撞。

[0023] 下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的
实施例。

[0024] 在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的
方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。

[0025] 此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者
隐含地包括一个或者更多个该特征。在本实用新型的描述中，“多个”的含义是两个或两个
以上，除非另有明确具体的限定。

[0026] 实施例1

[0027] 参照图1‑2，一种用于检测猫呼吸道五种病原的试剂盒，包括盒体8，盒体8内底壁活动设置有与盒体8内壁相贴合的底部海绵板7，底部海绵板7顶端面活动设置有内衬3，且
内衬3顶端面活动设置有顶部海绵板4；

[0028] 进一步的，盒体8一侧侧壁顶端面设置有盒盖801，且盒盖801覆盖于顶部海绵板4时，盒体8呈良好封闭状态；

[0029] 通过海绵板的设置，提供缓冲，减少运输途中试剂管的晃动和碰撞，扣上盒盖801时，使盒体8良好封闭。

[0030] 内衬3间隔开设有若干个第一限位孔5和若干个第二限位孔6，第一限位孔5内分别独立地放置扩增试剂一管、扩增试剂二管、质控品一管、质控品二管和稀释液管，第二限位
孔6内容置核酸释放剂管，扩增试剂一管中包括PCR反应液和引物探针组一，扩增试剂二管
中包括PCR反应液和引物探针组二，质控品一管中包括核酸释放剂和阴性质控品，质控品二
管中包括核酸释放剂和阳性质控品；

[0031] 其中，引物探针组一为检测猫杯状病毒，猫衣原体和猫支气管败血波士杆菌三种病原，引物探针组二为检测猫疱疹病毒Ⅰ型和猫支原体两种病原；

[0032] 进一步的，稀释液管中的组分为RNA专用稀释液，核酸释放剂的组分包括三羟甲基氨基甲烷，PCR反应液为单管一步法PCR试剂，PCR反应液组分包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、反
2+
转录酶、Mg 和无菌水，第一限位孔5的数量设置为五个。

[0033] 本实施例的多重PCR扩增试剂中包含5种病原及猫内参基因的引物组和探针组，探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团，且各探针序列标记的荧光基团和淬灭基团
各不相同。FHV‑1和Bb探针序列标记的荧光基团都为ROX，淬灭基团均为BHQ2；Cp和Mf探针序
列标记的荧光基团都为FAM，Cp探针淬灭基团为BHQ1，Mf探针淬灭基团为MGB；FCV探针序列
标记的荧光基团为CY5，淬灭基团为BHQ3；Feline探针序列标记的荧光基团为VIC，淬灭基团
为BHQ1。

[0034] 采用本试剂盒进行快速检测的一种较佳操作方法为：使用样本采集拭子收集病猫的呼吸道样本，取一支核酸释放剂，将拭子置于其中充分裂解释放核酸，使用移液枪吸取一
定体积的稀释液加入待测样本核酸释放剂内，充分混匀；再吸取待测样本稀释核酸分别加
扩增试剂一与扩增试剂二，质控品一分别加扩增试剂一与扩增试剂二，质控品二分别加扩
增试剂一与扩增试剂二于PCR八连管对应反应孔内，置于PCR仪内进行快速扩增检测；

[0035] 可选地，本发明中的多重荧光定量PCR扩增的单孔反应体系见下表：

[0036]

[0037] PCR扩增程序为：50℃5min；95℃2min；95℃5s，60℃15s(40Cycles)。

[0038] 判读结果：首先观察质控品的扩增情况，当质控品1无扩增曲线而质控品2有S型典型扩增曲线时，说明试剂盒运作正常，可以进行结果判读：

[0039] 当检测结果显示FAM/ROX/CY5通道有任一、任二、任三、任四、任五个病原体基因有S型典型扩增曲线且Ct值≤38，同时VIC通道有S型典型扩增曲线且Ct值≤38时，说明所测样
本中含有单一感染或混合感染；当FAM/ROX/CY5通道均无扩增曲线同时VIC通道有S型典型
扩增曲线且Ct值≤38时，检测结果为阴性，说明检测样本中不含有五种病原体；当VIC通道
没有S型典型扩增曲线或Ct值＞38时，需对该样本进行复检，各荧光通道对应病原体靶标见
下表：

[0040]

[0041] 检测结束后，将八连管与使用过的核酸释放剂一并丢弃到生化废弃物回收容器内。

[0042] 实施例2

[0043] 更换猫疱疹病毒Ⅰ型基因和猫支原体基因的探针标记，使之与猫杯状病毒FCV、衣原体、支气管败血波士杆菌和猫内参基因的探针标记不同，如此可将猫疱疹病毒Ⅰ型、杯状
病毒、支原体、衣原体、支气管败血波氏杆菌组合为单管六重荧光定量PCR，一次加样即可完
成五种病原体的同时检测，更为便捷。

[0044] 以上所述，仅为本实用新型较佳的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，根据本实用
新型的技术方案及其实用新型构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本实用新型的保护范
围之内。