[0001] 本实用新型属于微生物基因检测领域，具体涉及一种鉴别结核分枝杆菌和龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的膜条。

[0002] 结核分枝杆菌(M.TB)感染引起的结核病仍是目前我国最常见的传染性疾病之一，而非结核分枝杆菌病是指除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌感染引起相关组织、脏器的病变。伯杰系统细菌学手册根据非结核分枝杆菌(NTM)的生长速度将其分为快速生长型和缓慢生长型，其中我国快速生长型NTM所引起疾病中最常见的菌种类型是龟/脓肿分枝杆菌。目前已有市场化的检测分枝杆菌菌种的基因芯片试剂盒，采用检测16S rRNA基因序列的原理，探针采用荧光标记，但是却无法区分龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，且需用比较昂贵的激光共聚焦扫描仪予以完成，操作步骤较复杂,现有领域中还没有一种可以同时检测结核分枝杆菌和龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的膜条。实用新型内容

[0003] 本实用新型的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供鉴别结核分枝杆菌和龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的膜条。

[0004] 本实用新型为实现上述目的，采用以下技术方案：

[0005] 一种鉴别结核分枝杆菌和龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的膜条，包括膜条基体以及固定在所述的膜条上的特异性探针；所述的特异性探针包括用于检测结核分枝杆菌的碱基序列SEQ ID NO.1-2；用于检测龟分枝杆菌的碱基序列SEQ ID NO.3-4；用于检测脓肿分枝杆菌的碱基序列SEQ ID NO.5-6以及分枝杆菌属质控探针SEQ ID NO.7-8。探针序列可由其碱基互补序列替换。

[0006] 用于检测结核分枝杆菌(M.TB)的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如 SEQ ID NO.1-2任意一项所示：

[0007] M.Tb1:GCCCACTACAGACAAGAACCCCTCA(SEQ ID NO.1)

[0008] M.Tb2:CGTATCCATTGATGCTCGCAACCAC(SEQ ID NO.2)

[0009] 用于检测龟分枝杆菌(M.Che)的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列SEQ ID NO.3-4 任意一项所示：

[0010] M.Che1:CGTTTCAATTCTATTGACAGTTCGA(SEQ ID NO.3)

[0011] M.Che2:ACAGAAACTCGCTTTATGTTCCCAA(SEQ ID NO.4)

[0012] 用于检测脓肿分枝杆菌(M.Abs)的特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如 SEQ ID NO.5-6任意一项所示：

[0013] M.Abs1:TACTTTATGTTCCCTAGTTCGTTCGA(SEQ ID NO.5)

[0014] M.Abs2:CCAGCCTCACTCGAAAACGAGCG(SEQ ID NO.6)

[0015] 所述基底硝酸纤维素膜条还固定如下几种探针：

[0016] 分枝杆菌属质控探针(PC)，其碱基序列如SEQ ID NO.7-8任意一项所

[0017] PC1:TTAGGCCACTGGCTTCGGGTGTTAC(SEQ ID NO.7)

[0018] PC2:ACTTCGTCCCAATCGCCGATCCCAC(SEQ ID NO.8)

[0019] 所述的膜条基体为硝酸纤维素膜。

[0020] 所述的膜条长为6.0cm，宽为0.5cm，其中分枝杆菌属质控分子探针PC位于膜条上端以下1.0cm处，结核分枝杆菌特异性分子探针M.TB位于膜条上端以下2.0cm处，龟分枝杆菌特异性分子探针M.Che位于膜条上端以下3.0cm处，脓肿分枝杆菌特异性分子探针M.Abs位于膜条上端以下4.0cm处。当探针单独或者联合使用时，在膜条上点样位置以可区分即可。

[0021] 一种所述的鉴别结核分枝杆菌和龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的膜条的制备方法，使用50mg/mL新鲜配置的EDC·HCL溶液完全浸泡膜条基体30-60min，蒸馏水洗膜，晾干；将膜条基体裁剪成条状，将膜条基体不同的探针液点在膜条基体上，80℃烤膜2-3h固定探针于膜上，即得检测膜条。

[0022] 一种所述的鉴别结核分枝杆菌和龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的膜条的使用方法，包括下述步骤：

[0023] 1)待测分枝杆菌核酸为模板，使用生物素标记后的ITS引物进行PCR扩增，得到的扩增产物即可用于核酸分子杂交；

[0024] 2)将检测膜条放于塑料小槽中，先使用预杂交液预杂交40-60min，然后进行杂交，杂交前将步骤1)得到的50μl扩增产物95℃变性5min，将50μl扩增产物全部加入1ml杂交液中，置于小塑料槽中放入杂交仪杂交2-3h后，使用 1×SSC溶液洗膜；NBT/BCIP显色10-30min，观察显色程度，适时将膜条放入去离子水中终止显色，拍照记录。

[0025] 步骤1)用于扩增的引物对为SEQ ID NO.9-10。

[0026] ITS-F1：5’-Biotin-TACACACCGCCCGTCACGTCATG-3(SEQ ID NO.9)；

[0027] ITS-R1：5’-TGCCAAGGCATCCACC-3’(SEQ ID NO.10)。

[0028] 其中，所述的1×SSC溶液的配置方法为20×SSC液100mL，10％SDS液10mL，加H2O定容至1000mL。NBT/BCIP显色液为NBT 40μl+1ml的AP缓冲液+BCIP 40μl。

[0029] 与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：

[0030] 本研究的主要目的在于提供了可针对性检测M.TB和龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的菌种检测膜条，通过在不同的位置设置不同的特异性探针,可以快速、准确的区分结核分枝杆菌、龟、脓肿分枝杆菌，可作为一种市场化分枝杆菌菌种鉴定试剂盒的有益补充鉴定方法，具有良好的临床应用前景。

[0036] 为了使本技术领域的技术人员更好地理解本实用新型的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本实用新型作进一步的详细说明。

[0037] 图1中示出一种鉴别结核分枝杆菌和龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌的膜条，包括引物对、膜条基体1以及固定在所述的膜条上的特异性探针；所述的特异性探针包括用于检测结核分枝杆菌的碱基序列SEQ ID NO.1-2(21)；用于检测龟分枝杆菌的碱基序列SEQ ID NO.3-4(22)；用于检测脓肿分枝杆菌的碱基序列SEQ ID NO.5-6(23)以及分枝杆菌属质控探针SEQ ID NO.7-8(24)；对应的引物对为SEQ ID NO.9-10。

[0038] 所述的膜条基体为硝酸纤维素膜。

[0039] 所述的膜条长为6.0cm，宽为0.5cm，其中分枝杆菌属质控分子探针PC位于膜条上端以下1.0cm处，结核分枝杆菌特异性分子探针M.TB位于膜条上端以下2.0cm处，龟分枝杆菌特异性分子探针M.Che位于膜条上端以下3.0cm处，脓肿分枝杆菌特异性分子探针M.Abs位于膜条上端以下4.0cm处

[0040] 实施例1、检测方法的建立:

[0041] 1、细菌:天津市海河医院分枝杆菌菌种库保存的结核分枝杆菌标准株 H37Rv、临床分离培养后的龟、脓肿分枝杆菌菌株，其中龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌采用北京博奥生物集团公司生产的基因芯片法分枝杆菌菌种鉴定试剂盒鉴定后采用本实用新型中的ITS引物扩增测序后序列分析比对所得。

[0042] 2、细菌DNA提取

[0043] 分枝杆菌菌株液1ml，12000rpm，离心5min，沉淀部分生理盐水洗涤2次，弃上清后沉淀部分加100μl的TE缓冲液重悬，超声仪300W功率下超声破碎 15min，100℃加热10min，12000rpm离心5min后上清即为细菌DNA溶液。

[0044] 3、PCR扩增ITS基因片段

[0045] 测序引物、生物素标记的引物合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成， PCR扩增ITS基因片段，PCR反应体系包括：Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液，使用北京索莱宝科技有限公司PCR MasterMix(货号PC1150)。

[0046] 50μl的PCR反应体系：

[0047]

[0048] 反应程序：94℃预变性5min，94℃变性lmin，64℃退火lmin，72℃延伸 lmin，共30个循环，最后72℃延伸7min。

[0049] ITS基因片段扩增使用引物序列如表1所示：

[0050] 表1

[0051]

[0052]

[0053] 4、PCR扩增产物序列比对：采用上述测序用引物扩增临床分离培养后的分枝杆菌纯菌落核酸，扩增产物电泳结果见图2。将测序所得序列导入美国NCBI 的Blast在线分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，选取ITS序列同源性最高的细菌名称为最终鉴定结果。将序列导入BioEdit分析软件，即得结核分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌同源性比对结果。

[0054] 5、三种分枝杆菌鉴定特异性探针设计后送苏州金唯智生物科技有限公司进行合成：

[0055] 6、检测膜条的制备：

[0056] 使用新鲜配置的EDC·HCL溶液(50mg/mL)完全浸泡硝酸纤维素膜条 30-60min，蒸馏水洗膜，晾干；将膜条裁剪成条状，按照图1的布局将不同的探针液(10μM，2μl)点在硝酸纤维素膜上，80℃烤膜2-3h固定探针于膜上，即得检测膜条。

[0057] 实际样本的检测：

[0058] 1、待测样本为：1份H37Rv标准菌株、3份龟分枝杆菌、10份脓肿分枝杆菌、1份鸟分枝杆菌、1份胞内分枝杆菌、1份偶发分枝杆菌、1份堪萨斯分枝杆菌、1份戈登分枝杆菌，1份浅黄分枝杆菌，均为天津市海河医院分枝杆菌菌株库所存菌株。

[0059] 2、核酸分子杂交：

[0060] 提取三种分枝杆菌核酸为模板，使用生物素标记后的ITS引物进行PCR扩增，扩增产物即可用于核酸分子杂交。将检测膜条放于塑料小槽中，先使用预杂交液预杂交40-60min，然后进行杂交，杂交前将50μl扩增产物95℃变性 5min，将50μl扩增产物全部加入
1ml杂交液中，置于小塑料槽中放入杂交仪杂交2-3h后，使用1×SSC溶液(配制方法：20×SSC液100mL，10％SDS液10mL，加H2O定容至1000mL)洗膜。NBT/BCIP显色(使用NBT 40μl+1ml的AP缓冲液 +BCIP 40μl即得显色液)约10-30min，观察显色程度，适时将膜条放入去离子水中终止显色，拍照记录。

[0061] 3、检测结果与分析

[0062] ITS基因序列测序后分析鉴定三种分枝杆菌：提取结核分枝杆菌H37Rv标准菌株、市售基因芯片法试剂盒鉴定为龟/脓分枝杆菌菌株的核酸，使用上游引物：  5’-TACACACCGCCCGTCACGTCATG-3’；下游引物：5’-TGCCAAGGCATCCACC-3’进行PCR扩增，扩增片段大小为480bp左右，PCR产物送苏州金唯智生物科技公司进行测序，所得序列导入NCBI在线比对分析软件Blastn后，同源性以得分值由高到低从上往下排列，序列同源性最高的细菌即为鉴定结果，14株分枝杆菌采用ITS测序同源性比对鉴定结果见表2。

[0063] 表2

[0064]

[0065] 膜条检测14株分枝杆菌菌株

[0066] 使用生物素标记后的ITS扩增引物扩增14株分枝杆菌的ITS基因片段，扩增产物长度约480bp大小。使用14株分枝杆菌的ITS基因扩增产物分别与制备的膜条进行核酸分子杂交，分析膜条的敏感性和特异性，结果显示在膜条上相应的位置出现特异信号。图2为结核分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌ITS基因扩增后电泳胶图，M:Marker；1：结核分枝杆菌H37Rv株；2-4：龟分枝杆菌；5-14：脓肿分枝杆菌；图3为本实用新型膜条分别验证检测三种分枝杆菌结果图，1：结核分枝杆菌H37Rv菌株；2-4：3株龟分枝杆菌；5-14：10 株脓肿分枝杆菌；图4为本实用新型膜条分别检测其他6种非结核分枝杆菌膜条图，1：鸟分枝杆菌；2：胞内分枝杆菌；3：偶发分枝杆菌；4:堪萨斯分枝杆菌；5：戈登分枝杆菌；6：浅黄分枝杆菌。图5为本实用新型膜条分别检测2 例结核分枝杆菌(M.TB)混合龟分枝杆菌(M.Che)以及结核分枝杆菌混合脓肿分枝杆菌(M.Abs)ITS的PCR扩增产物结果图，1-2：M.TB+M.Che，3-4：M.TB+M.Abs。

[0067] 图中可以看出采用的其他6种非结核分枝杆菌的ITS扩增产物与膜条杂交确未有相应的信号，说明膜条能准确检测出结核分枝杆菌、龟、脓肿分枝杆菌及混合感染情况(图3、图4、图5)。尽管已经示出和描述了本实用新型的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本实用新型的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本实用新型的范围由所附权利要求及其等同限定。

[0068] 以上内容仅为本实用新型的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本实用新型的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本实用新型的限制。