经改进的核黄素生产 [0001] 本发明是申请日为2009年11月9日、申请号为200980144726.X、题为“经改进的核黄素生产”的申请的分案申请。 [0002] 本发明提供了经改进的核黄素生物技术生产，所述生产通过在含有核黄素生物合成基因的操纵子(rib操纵子)中进行的修饰，特别是相应的核黄素生物合成基因(rib操纵子)上游前导序列(rib前导区)的／在相应的核黄素生物合成基因(rib操纵子)上游 前导序列(rib前导区)中的修饰来完成。另外，本发明涉及带有所述经修饰的序列的经遗传改造的微生物，产生所述经修饰的序列／微生物的方法，及其用于生产核黄素的用途。 [0003] 核黄素由所有植物和许多微生物合成，但是不被高等动物所生产。核黄素是基础代谢必需的，因为它是碳水化合物的酶促氧化中需要的辅酶(例如黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸)的前体。在高等动物中，核黄素供应不足可引起脱发、皮肤炎症、视力衰退和生长障碍(growth failure)。 [0004] 核黄素的生物合成从三磷酸鸟苷(GTP)和5-磷酸核酮糖开始。涉及核黄素生物合成的基因已知来自多种来源，例如Bacillus subtilis，Ereothecium ashbyii，Ashbya gossypii，Candida flareri，Saccharomyces cerevisiae，E.coli( 见 例 如 EP405370th 或 Ullman ′ s Encyclopedia of Industrial Chemistry，7 Edition，2007，Chapter Vitamins)。 [0005] 以Bacillus subtilis中的情况作为生产核黄素的(微)生物的一个例子，涉及核黄素生物合成的基因包括ribG(ribD)、ribB(ribE)、ribA和ribH。ribA基因编码两种酶活性，即催化核黄素生物合成中第一步的GTP环式水解酶II和催化5-磷酸核糖体转化成 4-磷酸3，4-二羟基-2-丁酮(DHBP)的4-磷酸3，4-二羟基-2-丁酮合酶(DHBPS)。脱氨 酶和还原酶由操纵子的第一个基因ribG(ribD)编码。核黄素生物合成的倒数第二步由2， 4-二氧四氢蝶啶(lumazine)合酶催化，所述2,4-二氧四氢蝶啶是ribH的基因产物。催 化途径最后一步的核黄素合酶由操纵子的第二个基因ribB(ribD)编码。位于rib操纵子 3′端的ribT的功能目前是不清楚的；然而，其基因产物不是核黄素合成所必需的。 [0006] 核黄素操纵子从rib启动子(Prib)起的转录由核糖开关(riboswitch)控制，所述核糖开关涉及位于rib操纵子5′区中几乎300个核苷酸的非翻译调节前导区(下文 中称作rib前导区)，所述非翻译调节前导区在操纵子中第一个基因ribG的转录起点和翻译起始密码子之间。根据使用Bacillus subtilis的研究已知，rib前导区内至少三个不同的部分涉及rib操纵子的转录调节：(i)位于rib前导区3′-端的rho-非依赖性终止 子，其包含反向重复，所述反向重复之后是rho-非依赖性转录终止或弱化结构特征性的多聚-T段(Kil et al.，Mol.Gen.Genet.233，483-486，1992；Mironov et al.，Mol.Biol.24， 256-261，1990)；(ii)提示发挥反终止子功能的终止子5′-半边的反向重复(Mironov et al.，Cell111，747-756，2002)；(iii)推测发挥反-反终止子作用，防止反终止子与终止子碱基配对，并且干扰反终止结构形成的，位于终止子中心部分并且彼此反向互补的两个元件(Mironov et al.，Cell111(5)：747-56，2002)。体外转录研究已经证实，终止子的功能取决于转录实验中FMN的存在(Winkler et al.，PNAS99(25)：15908-13，2002)。对例如SEQ ID NO：1中展示的B.subtilis的rib操纵子而言，分别地，终止子由SEQ ID NO：1的核苷酸230到263组成，反终止子由SEQ ID NO：1的核苷酸30到37组成，反-反终止子由SEQ ID NO：1的核苷酸157到164组成。 [0007] 根据目前的rib基因表达调节的模型，从rib前导区转录的新生mRNA采取两种替代性的结构(所谓的FMN核糖开关)：如果FMN与位于rib前导区内的RFN元件(见例如 SEQ ID NO：1中从第25到164位的DNA序列)结合，则反-反终止子与反终止子碱基配对，因此不能干扰转录终止环形成，导致rib基因转录过早终止。FMN不与RFN元件结合时，反终止子与转录终止子的反向互补序列碱基配对，允许通读转录和全长rib mRNA的形成。这种机制将决定FMN-结合型RFN元件与未结合形式比例的细胞内FMN浓度与全长rib mRNA 形成的程度联系在一起。其显示RFN元件仅用作FMN而非核黄素的结合位点(Mironov et al，2002；Winkler et al，2002)。 [0008] 因此，脱调节(deregulation)、核黄素过量生产和分泌进培养液中可以通过以下任何途径来实现：(i)干扰FMN与从rib前导序列转录的新生mRNA的结合，(ii)修饰反-反终止子，使其不能与反终止子有效地碱基配对，或(iii)修饰或缺失终止子。 [0009] 经鉴定的一类过量生产核黄素的B.subtilis突变体在rib前导序列5′-半边 中的多个位置处含有称作ribO突变的单点突变(Kil et al.，1992)。ribO突变或者位 于RFN元件中并因此干扰FMN结合，或者位于反-反终止子DNA序列中。可以预期，缺失 终止子结构后实现核黄素分泌和rib基因表达的最大脱调节，因为在这种情况下，rib基因转录阻抑所依赖的最终元件被去除。RibO突变还在例如Lactobacillus plantarum、Leuconostoc mesenteroides或Propionibacterium freudenreichii中被鉴定(Burges et al.，Microbial Cell Factories5：24，2006)。 [0010] 在称作ribC突变体的第二类过量生产核黄素的B.subtilis突变体中，染色体 损伤被定位于B.subtilis基因组的147°(Kreneva and Perumov，Mol.Gen.Genet.222， 467-469，1990)。RibC突变体在ribC基因中含有错义突变。已显示ribC基因编码 B.subtilis的黄素激酶／FAD合酶(Mack et al.，J.Bacteriol.，180：950-955，1998)。突变脱调节核黄素生物合成降低ribC基因产物的黄素激酶活性，导致降低的黄素单核苷酸(FMN)细胞内浓度，所述黄素单核苷酸是核黄素调节系统的效应器模块。 [0011] 另外，经典的诱变被用于产生在所选生物基因组中带有随即突变的变体，之后例如选择对嘌呤类似物的更高抗性。或者，如下过表达涉及核黄素生物合成的基因：例如用强启动子代替天然(弱)启动子，或在染色体内扩增表达盒，所述表达盒含有与感兴趣的基因以及可扩增的可选择标记物基因(例如抗生素抗性标记物)可操作地连接的单个启动 子。扩增导致在基因组中生产多拷贝的表达盒和可选择标记物基因。另外，可以通过将核黄素生产与所述宿主细胞的生长脱偶合(decoupling)来实现提高的进入培养液的核黄素分泌。 [0012] 上述方式伴随着若干缺点。例如，通过由单个启动子驱动的基因的扩增，可能无法实现饱和的mRNA水平。另外，宿主细胞染色体中多拷贝表达盒和可选择标记物基因的生产可能不稳定，或者可能甚至阻止各个基因的进一步表达(反馈抑制)。 [0013] 惊讶地发现，除了目前模型所设想的作为rib基因表达负调节器的功能以外，rib前导区还对全长rib mRNA的丰度具有强的影响，从而表明了5′mRNA稳定化功能。向rib前导序列中引入特定的突变／缺失导致提高的核黄素生产。 [0014] 因此，通过提供下述突变体核黄素生产菌株提高核黄素生产的产率和／或生产力是本发明的一个目的，所述突变体核黄素生产菌株中rib前导区以下述方式被修饰，所述方式导致对连续的rib基因表达的抑制效应松弛或减小，导致完整的、全长的rib mRNA转录本的积累。因此，向合适的宿主细胞中引入经修饰的rib前导区(即与野生型rib前导区相比经改进的rib前导区)导致全长rib mRNA更高的稳定性或更多的rib操纵子脱调 节，即更加脱调节的核黄素生产。 [0015] 特别地发现，rib前导区3′端的缺失在改进核黄素生产的产率和／或生产力中尤其有效，所述缺失包括(i)终止子序列或其功能性部分和(ii)终止子的5′侧翼区。其中从RFN元件3′端到终止子3′端的整个DNA序列被缺失的经修饰的rib前导区在改进 核黄素生产中特别有用。 [0016] 另外已发现，ribO突变与rib前导区3′端的缺失(包括终止子序列或其功能性部分)的组合在改进核黄素生产的产率和／或生产力中尤其有效。这可通过包括终止子的 5′侧翼区被进一步增强。出乎意料的是，与更大的缺失(包括终止子以及5′侧翼区)或终止子缺失与ribO突变的组合相反，整个终止子序列或其功能性部分的缺失或修饰(而不与ribO突变组合)对核黄素生产没有强的影响。事实上，仅仅终止子序列或其功能性部分的缺失或修饰在脱调节核黄素生产中清楚地不如经典的ribO突变有效。其中从RFN元件 3′端到终止子3′端的整个DNA被缺失并组合了一个或多个ribO突变的经修饰的rib前 导区在改进核黄素生产中特别有用。RFN元件的更大部分被缺失时，例如RFN元件3′端的约五分之一被缺失时，这可被进一步增强。 [0017] 因此，本发明涉及经修饰或经突变的多核苷酸，所述多核苷酸选自由： [0018] (a)包含根据SEQ ID NO：42的核苷酸序列的多核苷酸， [0019] (b)包含具有rib前导区活性的(a)片段或衍生物的多核苷酸， [0020] (c)具有rib前导区活性的多核苷酸，其互补链在严格条件下与(a)到(b)任一中定义的多核苷酸杂交， [0021] (d)具有rib前导区活性的多核苷酸，其与(a)到(b)任一中定义的多核苷酸至少 70％，例如80％，85％，90％，95％或98％相同；和 [0022] (e)是(a)到(d)中定义的多核苷酸互补链的多核苷酸， [0023] 组成的组， [0024] 其中所述多核苷酸，特别是以SEQ ID NO：42展示的多核苷酸，包含修饰／突变，并且其中与未经修饰的rib前导区相比，完整的、全长rib mRNA转录本的积累被提高至少 5％，并且还导致核黄素生产的提高，所述修饰／突变选自由以下组成的组： [0025] (i)rib前导区3′端的一个或多个突变，包括终止子及其5′侧翼区；和 [0026] (ii)一个或多个ribO突变以及rib前导区3′端的一个或多个突变。 [0027] 未经修饰的rib前导区(例如SEQ ID NO：42中所示的)可以是未经修饰的rib 操纵子(例如分离自Bacillus subtilis的SEQ ID NO：1中所示)的部分。本发明的rib 前导区序列可以与天然rib启动子一起使用，或与组成型启动子一起使用，所述组成型启动子例如Pspo15或Pveg并例如SEQ ID NO：55或56中所示。 [0028] 被引入rib前导区中并与前导区3′端修饰组合从而导致本文定义的经修饰的 rib前导序列的ribO突变是指位于rib前导区5′端任何位置的任何突变(碱基交换、缺 失、插入)，包括Kil et al.，1992定义／表征的RFN元件，并且所述突变导致与带有本文定义的未经修饰的rib前导区的菌株相比经改进的核黄素生产。 [0029] 特别地，本发明涉及经修饰的rib前导区，其在3′部分中被修饰，并且额外含有对应于Kil et al.(1992)所鉴定突变的一个或多个ribO突变，或在对应于SEQ ID NO：42中所示选自例如第31、39、40、41、55、85、86、88、93、116、121和128位位置的位置上含有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个)ribO突变(即取代)。优选地，ribO突变选自T31G、G39A、G40A、G41A、C55T、C85T、C86T、G88A、C93T、A116C、G121A、C128G及其组合，其中所述核苷酸对应于SEQ ID NO：42中所示位置。带有此类ribO突变(包括5′端的天然rib启动子)的rib前导序列的例子展示于SEQ ID NOs：45、46和47中。这些ribO突变也可以与组成型启动子(例如分别在SEQ ID NOs：57、58或60和SEQ ID NO：59中展示的例如Pveg or Pspo15)融合。优选地，本文定义的经修饰的rib前导区包含单个ribO突变，例如位于对应于SEQ ID NO：42中第39、40、41、85或121位的位置上，更优选地，ribO突变选自G39A、G40A、G41A、C85T(称作“RK41”)、G121A(称作“RK1a”)及其组合。所述ribO突变还与本文定义的rib前导区3′中的突变组合。 [0030] 在一个特别的实施方案中，本发明的经修饰的rib前导区带有与rib前导区3′端中突变组合的多于一个ribO突变。优选的是三种ribO突变的组合，更优选地是对应于SEQ ID NO：42第39、40和41位的位置上的ribO突变，进一步更优选地是称作“三重ribO”的ribO突变G39-G40A-G41A。引入rib前导区中的此类三重ribO突变的一个例子展示于 SEQ ID NO：47中(包括天然的rib启动子)。也可以通过代替天然启动子将这些ribO突 变与组成型启动子(例如SEQ ID NO：57中所示)融合。 [0031] 所述ribO突变还与rib前导区3′端中的修饰组合。Rib前导区3’端中的此类 修饰可至少包括终止子或其功能性部分的缺失，以得到本发明的经修饰的rib前导区，所述本发明的经修饰的rib前导区导致在引入合适的宿主细胞后与带有未经修饰的rib前导区的宿主细胞相比提高的核黄素生产。3’端中的所述修饰可还包括终止子5’侧翼区、特别是对应于RFN元件3’端的核苷酸、例如对应于SEQ ID NO：42的核苷酸166到263或136 到263的修饰(例如缺失)。 [0032] 在一个优选的实施方案中，与上文所示ribO突变组合的rib前导区3’端处／中的修饰位于RFN元件3’端(即位于RFN元件下游的所有序列)与rib前导区3’端之间， 其中可以缺失任一条完整序列或仅其部分。在一个特别的实施方案中，终止子或至少其功能性部分包括在所述缺失中。 [0033] 从B.subtilis分离的终止子序列的一个例子展示于SEQ ID NO：39中，其可从rib前导区中缺失，导致例如SEQ ID NOs：51或80中所示包括天然rib启动子的经修饰的rib前导区。天然启动子也可以被组成型启动子例如Pspo15和Pveg(见例如SEQ ID NOs：63或 64)代替。因此，本发明的经修饰的rib前导区可在对应于SEQ ID NO：42的核苷酸231到 263的核苷酸中被缺失，即称作“del终止子”的整个终止子(不含侧翼区)缺失，与上文定义的任何ribO突变组合。 [0034] 终止子功能性部分的缺失可包括一个或多个茎环和／或其侧翼区的缺失。其中仅终止子功能性部分被缺失并组合上述ribO突变的rib前导序列的例子展示于SEQ ID NOs： 48、49、50、77、78和79中。天然rib启动子也可以被组成型启动子例如Pspo15和Pveg(见例如SEQ ID NOs：61或62)代替。以SEQ ID NO：42中所示B.subtilis rib操纵子作为参照序列，所述功能性部分缺失可包括对应于核苷酸250到257(称作“del茎环-右”)，核苷酸 231到238(称作“del茎环-左”)或核苷酸239到263(称作“del侧翼-右”)的核苷酸 缺失。 [0035] 其中终止子和5’侧翼区被缺失并组合上述ribO突变的经修饰的rib前导序列的例子展示于SEQ ID NOs：52、53、81和82中。天然rib启动子也可以被组成型启动子例如Pspo15和Pveg(见例如SEQ ID NO：65)代替。以SEQ ID NO：42中所示B.subtilis rib操纵子作为参照序列，本发明的经修饰的rib前导区可含有对应于SEQ ID NO：42的核苷酸166到263(称作“SWITCH缺失”)的核苷酸缺失，与任何上述ribO突变组合。 [0036] 本文所述经修饰的rib前导序列带有上文定义的ribO突变，所述ribO突变与rib前导区3’端中的突变／修饰组合，其中3’端中的修饰可选自例如完整终止子、终止子功能性部分或与5’侧翼区一起的终止子的缺失。 [0037] 另外，作为本发明的部分，本文定义的经修饰的rib前导序列在rib前导区的3’端带有突变／修饰，其中所述修饰可选自终止子与其5’侧翼区一起的缺失，例如多达终止子上游60、70、80、90或100，特别是上游64或94个核苷酸，优选地对应于SEQ ID NO：42的核苷酸166到263或136到263。 [0038] 在一个特别优选的实施方案中，与Kil et al.(1992)中定义的已知ribO突变 体例如ribO突变T31G、G39A、G40A、G41A、C55T、C85T、C86T、G88A、C93T、A116C、G121A、C128G(其中核苷酸对应于SEQ ID NO：42中所示位置)及其组合相比，带有上文定义的经修饰的rib前导区的宿主细胞在培养基中积累了多于25mg／l核黄素，例如50、100、200、 300、400、500、600、700、800mg／l或更多核黄素，或甚至多于1g／l的核黄素。技术人员已知这些量取决于例如培养条件、宿主菌株和／或底物而变化。 [0039] 在一个实施方案中，本发明的经修饰的rib前导区含有对应于选自B.subtilis rib操纵子(SEQ ID NO：42)中RK1a、RK41或三重rib的ribO突变的ribO突变，与选自整个终止子缺失、SWITCH缺失或del mro175(见上文)的3’端缺失组合。一种优选的组合是RK1a与del终止子、SWITCH缺失或del mro175。还优选的是RK41与del终止子、SWITCH缺失或del mro175的组合。还优选的是三重ribO与del终止子、SWITCH缺失或del mro175的组合。更优选地，本发明的经修饰的rib前导区含有RK41与del终止子、RK41与SWITCH缺失、三重ribO与del mro175的组合。进一步更优选的是与组成型启动子例如Pspo15 and Pveg(见例如SEQ ID NOs：67、68、69、70或71)融合的所述经修饰的rib前导序列。 [0040] 根据本发明的经修饰的rib前导区也可以通过引入mRNA稳定化元件来包括修饰。 所述元件可以被引入rib基因的启动子和编码序列之间。此类元件的例子包括SEQ ID NO： 43(所谓的aprE mRNA稳定化元件)或SEQ ID NO：44(所谓的grpE mRNA稳定化元件)中 所示元件和优选地在高度严格的条件下与之杂交的序列。 [0041] 本发明的核酸序列，即经修饰的rib前导序列可与适当的启动子可操作地连接，所述启动子可以是组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然启动子，或者是原来与涉及核黄素生物合成的各个基因不天然连接的启动子。技术人员应当知道如何选择合适的启动子。有用的启动子的例子可在文献(特别是例如EP405370)中找到。 [0042] 因此，本发明在一个优选的实施方案中涉及选自由以下多核苷酸组成的组的经修饰或经突变的多核苷酸(rib前导序列)： [0043] (a)包含根据SEQ ID NOs：65、67、68、69、70或71的(经修饰的)核苷酸序列的多核苷酸； [0044] (b)具有经修饰的rib前导区活性的多核苷酸，其互补链在严格条件下与(a)中定义的多核苷酸杂交， [0045] (c)具有经修饰的rib前导区活性的多核苷酸，其与(a)中定义的多核苷酸至少 70％，例如80％，85％，90％，95％或98％相同；和 [0046] (d)是(a)到(c)中定义的多核苷酸互补链的多核苷酸； [0047] 其中所述多核苷酸，特别是在SEQ ID NO：65、67、69、70或71下展示的序列被称作经修饰或经突变的序列，其中在引入合适的宿主细胞后与带有相应的未经修饰的序列的细胞相比，完整的、全长rib mRNA转录本的积累被提高至少5％。 [0048] 在本文中使用时，术语“rib前导序列”是指任何下述DNA序列，所述DNA序列与一个或多个下游rib基因相关联，并且含有影响连续的rib基因表达的非翻译调节元件。 这些调节元件典型地包含(i)DNA序列3’端的终止子，(ii)反-终止子，和(iii)终止子上游的RFN结合位点。如从Bacillus subtilis所已知的，rib前导区包括位于rib操纵 子5′区中操纵子中第一个基因ribG的转录起点和翻译起始密码子之间的几乎300个核 苷酸。B.subtilis的rib前导区中的终止子序列位于核苷酸231和263之间(见图1)。 此类rib前导序列还已在其他真细菌如Bacillus、Corynebacterium、Pseudomonas特别是B.anthracis、B.cereus、B.stearothermophilus、B.halodurans、B.amyloliquefaciens、C.diphteriae和C.glutamicum、P.aeroginosa、P.putida或P.syringiae中被鉴定(见 Vitreschak et al.，Nucleic Acid Res30，3141-3151，2002的表1，所述文献通过引用并入本文)。 [0049] 在本文中使用时，术语“RFN元件”是指rib前导序列中高度保守的DNA序列。 转录进mRNA中后，RFN可折叠成保守的结构，五个发夹形成FMN的结合位点。可以使用 RFAM鉴定潜在的RFN元件，这是代表非编码RNA家族的协方差模型和多序列比对的集合 (Griffiths-Jones et al.：Rfam：an RNA family database.Nucleic Acids Res2003，31： 439-441；可在http：／／www.sanger.ac.uk／cgi-bin／Rfam／getacc?RF00050获得)。 多种细菌基因组中RFN元件的例子由Gelfand et al.，Trends Genet.15，439-442，1999提供。Vitreschak et al.，Nucleic Acid Res30，3141-3151，2002的图2中给出了包含来自不同生物的RFN元件核苷酸序列的综述。根据Mironow et al.，Cell111(5)：747-56，2002的定义，B.subtilis的rib前导序列内的RFN元件位于核苷酸22到165之间(见图1或 SEQ ID NO：42)。通过Vitreschak et al.，2002的图2中所示比对的帮助，技术人员能够在含有此类RFN元件的生物中产生经修饰的rib前导区，导致提高的核黄素生产。 [0050] 术语“未经修饰的rib前导区”或“未经修饰的多核苷酸”和“野生型rib前导区”或“野生型多核苷酸”在本文中可互换使用。未经修饰的rib前导区或未经修饰的多核苷酸可包括优选地在高度严格条件下与SEQ ID NO：42中所示序列杂交的任何多核苷酸，期望提高其比活性从而缓解rib前导区的阻抑效应，提高rib基因mRNA的稳定性，导致更脱调节的rib操纵子和／或提高给定微生物中核黄素的生产。然后使用这些序列作为设计根据本发明的具有提高的活性的突变体rib前导序列的起点。本发明上下文中，“野生型”可包括可源自天然的序列以及合成序列的变体，只要它们能够通过本发明的任何教导变得更有活性即可。特别地，此类多核苷酸是原核起源的，优选地是细菌起源，特别是源自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，例如Bacillus，优选地Bacillus subtilis。 [0051] 术语“经修饰的多核苷酸”或“经修饰的rib前导区”和“突变体多核苷酸”或“突变体rib前导区”在本文中可互换使用。突变体／经修饰的多核苷酸或经修饰的rib前导区可包括根据本发明的教导可源自给定的野生型多核苷酸／rib前导区(根据上文的定 义)并且比各自野生型序列更有活性(例如可作为由给定底物生产的核黄素的提高或提高的rib mRNA稳定性来测量)的任何变体。就本发明的范围而言，如何获得突变体并不重要，此类突变体可以例如通过完整细胞／生物的定点诱变、饱和诱变、随即有百年／定向进化、化学或UV诱变和本领域已知的其他方法获得。这些突变体也可以例如通过设计合成的基因来产生。Rib前导序列中的修饰及其对rib基因表达的影响可以通过本领域技术人员已知的方法测量。例如，这些模型包括下述实验，所述实验使用β-半乳糖苷酶作为报告子基因，或进入下述微生物培养液中的核黄素分泌，所述微生物含有经修饰的rib前导序列代替野生型rib前导序列，或除野生型rib前导序列以外还含有经修饰的rib前导序列。也可以通过Northern印迹或实时PCR测定经修饰的rib前导区对各个mRNA水平的(积极) 影响。 [0052] 技术人员知道如何产生经突变的／经修饰的rib前导序列，包括引入mRNA稳定化元件和／或替换天然启动子。在一个实施方案中，通过将mRNA稳定化元件引入先前未经修饰的rib前导区中，产生经修饰的rib前导区。引入此类mRNA稳定化元件的有用方法的一个例子展示于图2中。 [0053] 经突变的／经修饰的rib前导序列的所述产生可例如如下完成：以使得宿主生物生产经突变的rib前导区的方式遗传修饰宿主生物，其中与未经修饰的rib前导区相比对rib基因表达的阻抑作用被减轻或减小，这随即导致完整、全长rib mRNA转录本的提高的积累，因此导致核黄素生产效率和／或产率的提高。因此，具有经修饰的rib前导区时，rib操纵子与带有未经修饰的rib前导区的菌株相比更少被调节或更加脱调节。 [0054] 在本文中使用时，“经改进的活性”或“增强的活性”应当被理解为核黄素生产微生物中rib前导区调节的减小／阻抑效应的减轻(完全或部分)或减小。因此，就本发明的目的而言，具有提高的活性的经修饰的rib前导区对rib基因转录具有更少的阻抑影响，导致与未经修饰的rib前导区相比rib操纵子的脱调节。另外，本文定义的具有经改进的活性的经修饰的rib前导区导致完整、全长rib mRNA的积累，通过Northern印迹或实时PCR测定时所述mRNA增加至少5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％或甚至多于500％。这可以通过最小化rib前导区阻抑／调节后核黄素生产的提高或通过全长转录本的mRNA浓度测定或由rib基因转录而来的核黄素生物合成酶的浓度测定来(间接)测量。与野生型rib 前导区相比，经修饰的rib前导区对rib基因表达的阻抑／调节至少减少5％、10％、25％、 50％、75％、100％、200％或甚至多于500％。因此，具有经改进的活性的经修饰的rib前导区是指与本文所述未经修饰的rib前导区相比，脱调节水平被提高至少5％、10％、25％、 50％、75％、100％、200％或甚至多于500％的rib前导区。 [0055] 在本文中使用时，术语“mRNA稳定化元件”是指下述DNA序列，所述DNA序列在引入5’-非翻译区中(例如各个基因转录起点下游)后，能够对由包含所述mRNA稳定化元件的各个基因转录而来的mRNA提供提高的稳定性。mRNA稳定化元件优选地含有1个或多个茎环，但是也可不含有茎环。 [0056] 能够形成一个或多个茎环，导致来自(优选地涉及核黄素生产的)一个或多个目标基因的mRNA具有提高的稳定性的任何核酸序列可以在本发明的范围内。也可能通过强核糖体结合位点(RBS)进行mRNA的稳定化，所述核糖体结合位点不必须形成环。 [0057] 上文定义的mRNA稳定化元件可以是任何长度，但是优选地由至少15个核苷酸组成，更优选地由至少20、30、40、50、60、70、80、90、100个核苷酸组成，最优选地由39-87个核苷酸组成，所述核苷酸优选地包含1个或多个茎环，特别是1个或2个茎环。茎可由至少4个碱基对，优选地至少8、10、12、15个碱基对(可能存在错配核苷酸／内部环和／或膨胀环)组成，环可由例如3-30个非结合的核苷酸，优选地4、6、8、10、11、14、15、25或更多个核苷酸组成。内部环的长度优选地是2、4、6、8、10、12个非结合的核苷酸。可存在一个或多个膨胀环，由例如1、2或甚至6个非结合的核苷酸组成。计算的茎环热动力学稳定性(ΔG)可根据Zuker(2003，Nucleic Acids Res.31：3406-3415)发明的算法来计算。在一个实施方案中，计算的热动力学稳定性是-2.8kcal／mol或更低，优选地是-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-15、-20kcal／mol或更低。在本发明的另一个实施方案中，mRNA稳定化元件可不包含环。 [0058] 可例如使用例如Allenby et al.，Microbiology，150，p.2619-2628(2004)或Sharp and Bechhofer，Mol.Microbiol.57，484-495(2005)所述的Northern印迹和／或实时PCR稳定化测定mRNA半衰期，来测量rib mRNA转录本的稳定性。在本文中使用时，如果与野生型rib操纵子(即不含有本发明的经修饰的rib前导区)转录而来的mRNA半衰期 相比，mRNA的半衰期被提高至少1％、2％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％或甚至多于500％，则所述mRNA稳定性或完整性被提高(或mRNA降解被减小／阻断)。 [0059] 模板DNA可源自用于生产核黄素的相同或不同的宿主生物。另外，反应的模板可以是通过反转录下述mRNA获得的cDNA，所述mRNA由已知或怀疑包含本发明多核苷酸的菌株制备。可以对PCR产物亚克隆和测序，以确保被扩增的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能性等同物。另外，可以使用本领域公知的方法完全或部分合成根据本发明的核酸序列。 [0060] 本发明还涉及下述多核苷酸(rib前导序列)及其用于生产核黄素的用途，所述多核苷酸的互补链在严格条件下与本文定义的多核苷酸杂交，并且能够改进完整、全长的rib mRNA转录本的积累。 [0061] 本发明还涉及下述多核苷酸及其用于生产核黄素的用途，所述多核苷酸与本文定义的多核苷酸至少70％相同，并且具有经修饰的rib前导区的活性。在一个实施方案中，本发明的核酸与SEQ ID NO：42、55、56、67、68、69、70、71中所示多核苷酸或其互补体至少 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更加相同。 [0062] 本发明还涉及下述引物、探针和片段，所述引物、探针和片段可用于扩增或检测根据本发明的DNA和鉴定也带有此类rib前导序列的相关微生物物种或科。 [0063] 本发明还涉及包含本发明多核苷酸的载体，和用多核苷酸或所述载体遗传改造的微生物。 [0064] 本发明还涉及用于产生带有本文定义的经修饰的多核苷酸的微生物(即遗传改造合适的微生物从而提高完整、全长的rib mRNA转录本的积累)的方法，及其用于改进和／或增强核黄素生产产率和／或效率的用途。 [0065] 本文使用的DNA序列的引入可例如是通过转化、接合或转导进宿主细胞染色体中来添加或插入DNA序列。所述添加或插入可通过DNA重组进行，这可导致或不导致染色体DNA核苷酸的去除或缺失。将DNA序列引入宿主细胞(例如微生物)中的方法尤其通过位点特异性引入来实现，这是本领域公知的并且描述于例如Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；and Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons，N.Y.)中。 [0066] 合适的宿主细胞包括下述微生物细胞，所述微生物细胞能够生产核黄素(例如将给定的碳源转化成核黄素)，并且带有未经修饰的rib操纵子，包括未经修饰的前导区或其等同物或同源物(随后以如本文所述导致核黄素生产提高的方式被突变)，或向其 中引入经修饰版本的所述rib操纵子／rib前导区或其等同物。此类细胞随后被称作 “重组细胞”或“经转化的细胞”。带有此类未经修饰的rib操纵子／rib前导区或其等同物的合适的微生物可选自细菌，例如革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，其为野生型菌株、通过经典诱变和选择方法获得的突变体菌株，或重组菌株。带有RFN元件的合适菌株列于Vitreschak et al.，Nucleic Acid Res30，3141-3151，2002的表1和图2中。此类 细菌的例子包括Bacillus、Streptococcus、Lactococcus、Streptomyces、Clostridium、Deionococcus、Thermus、Fusobacterium、Chloroflexus和Thermomonospora。优选地，微生物或宿主细胞选自由以下组成的组：Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus stearothermophilus、Bacillus halodurans、Bacillus licheniformis 和 Streptococcus aureus、Streptococcus pneumoniae、Clostridium acetobutylicum、Clostridium difficile、Lactococcus lactis或相关度较低的生物如Streptomyces coelicolor、Thermomonospora fusca、Deionococcus radiodurans、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Fusobacterium nucleatum 和 Chloroflexus aurantiacus。更优选的是B.subtilis，特别是B.subtilis1A747或B.subtilis168。还在本发明范围内的是本文公开的例如来自B.subtilis的脱调节／经修饰的rib前导区被用于代替上文所述其他微生物之一中的天然／野生型rib前导区，或上文提到的另一生物的经修饰的rib前导区被用于B.subtilis的rib操纵子之前。 [0067] 带有所述经修饰的rib前导区的此类微生物还涉及经遗传修饰的或重组的微生物，或重组生产的／经遗传改造的宿主细胞。 [0068] 公众可以从不同的来源例如Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，Inhoffenstrasse7B，D-38124Braunschweig，德国，American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box1549，Manassas，VA20108USA，Agricultural Research Culture Collection(NRRL)，Peoria，IL，USA，Culture Collection Division，NITE Biological Resource Center，2-5-8，Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba，292-0818，日本(曾用名：Institute for Fermentation，Osaka(IFO)，17-85，Juso-honmachi2-chome,Yodogawa-ku，Osaka532-8686，日本)或Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)，The Ohio State University，Columbus，Ohio43210USA获得可用于本发明的微生物。 [0069] 关于本发明应当理解，上述微生物还包括具有相同生理特性的此类物种的同 物异名(synonyms)或有效名(basonyms)，如International Code of Nomenclature of Prokaryotes定义。本文使用的微生物的命名法是International Committee on Systematics of Prokaryotes and the Bacteriology和Applied Microbiology Division of the International Union of Microbiological Societies正式接受(在优 先 权文件的提交日)并由其官方出版媒介International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(IJSEM)公开的命名法。 [0070] 本发明涉及经修饰的微生物，其中所述修饰导致由底物(例如葡萄糖)到核黄素提高的产率、生产和／或效率。这可通过提高本文所述的rib前导区的活性，即降低调节水平来进行。另外，本发明的微生物可带有更多修饰，只要此类修饰对核黄素生产的产率、生产和／或效率具有直接影响即可。 [0071] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及带有本文所述经修饰的rib前导区和额外修饰的微生物，所述额外修饰例如是用强(组成型或诱导型)启动子例如Pspo15或Pveg代替rib操纵子的天然启动子。此类强启动子的引入导致与在天然启动子下游带有经修饰的rib前导区的微生物相比，核黄素生产被提高至少50％、75％、100％、200％、250％、300％、 350％、500％或甚至多于1000％。这可通过一个或多个rib基因、特别是ribA的过表达，或通过在宿主细胞中引入多拷贝的rib操纵子被进一步提高，例如在B.subtilis菌株RB50中完成(见例如EP405370)。与B.subtilis RB50中的核黄素生产相比，通过遗传改变微生物使其在与强启动子融合的本文定义的rib前导区中带有修饰，可以将核黄素生产提高至少100％、200％、250％、500％或甚至多于750％。带有任选地与强启动子和／或多拷贝rib操纵子组合的本文定义的经修饰的rib前导区的微生物可以如下被进一步改变：将生长与核黄素的生产脱偶合，例如引入营养缺陷型(例如EP1186664中针对例如生物素所述)，和／或进一步与经修饰的转酮酶基因的引入组合，例如WO07／051552中所述。 [0072] 本发明提供了本文定义的经修饰的rib前导区，其包含(i)一个或多个ribO突 变，与rib前导区3’端的修饰一起，或(ii)终止子及其5’侧翼区的缺失，其中所述经修饰的rib前导区与强启动子例如Pspo15或Pveg融合。 [0073] 用于生产核黄素的一种特别优选的菌株是B.subtilis。一种更优选的菌株是含有多(n)拷贝(例如约5到约20个拷贝)pRF69的B.subtilis RB50：：[pRF69]n，pRF69编 码用强启动子Pspo15修饰的rib操纵子，以增强rib基因的转录(菌株的构建和导致核黄素生产的培养条件见例如EP405370和Perkins et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，22： 8-18，1999)。B.subtilis RB50和质粒pRF69可分别得自NRRL(登记号B18502)和ATCC(登记号ATCC68338)。 [0074] 根据本发明的又一个目的，提供了上文定义的经修饰的多核苷酸或用此类多核苷酸遗传改造的微生物用于核黄素生产的用途。 [0075] 本发明还提供了用于在微生物中表达包含经修饰的rib前导区的(经修饰的)rib操纵子的方法，在微生物中生产上文定义的(经修饰的)多核苷酸的方法，和生产能够生产核黄素的此类经修饰的微生物的方法。所有这些方法可包含改变微生物的步骤，其中在本文中使用时，“改变”包括以下述方式“遗传改变”的方法，所述方式使得与野生型微生物相比核黄素的产率和／或生产力以及完整、全长rib mRNA的积累能够被改进。术语“改变”还包括本文所述经修饰的多核苷酸、特别是rib前导区修饰的产生。在本文中使用时，“经改进的核黄素产率”表示与野生型／未经修饰的微生物(即没有被遗传改变的微生物)相比，至少50％、75％、100％、200％、250％、300％、350％、500％或甚至多于10000％或100000％(见上文)的提高。 [0076] 术语“经遗传改造的”或“经遗传改变的”表示生物中遗传材料结构的科学性改变。 其涉及重组DNA的生产和使用。更特别地，其被用于描绘来自天然存在的生物的经遗传改造的或经修饰的生物。遗传改造可以通过本领域中已知的大量技术(例如基因替换，基因扩增，基因破裂、添加、插入、缺失，使用质粒、病毒或其他载体的转染、转化)完成。经遗传修饰的生物(例如经遗传修饰的微生物)通常也被称作重组生物，例如重组微生物。经遗传改造的微生物带有如上文定义的经修饰的rib前导区。 [0077] 根据本发明提供了经遗传改造／重组生产的宿主细胞(也称作重组细胞或经转化的细胞)，所述细胞带有本发明的此类经修饰的rib前导区，使得核黄素生产的产率、生产和／或效率被改进。宿主细胞可选自能够由给定碳源生产核黄素的微生物，特别是Bacillus，优选地是B.subtilis。 [0078] “经转化的细胞”或“重组细胞”是下述细胞，所述细胞中通过重组DNA技术引入了根据本发明的核酸，导致提高的和／或增强的完整、全长rib mRNA的积累。其还包括向所述细胞中已经存在的野生型rib前导区中引入一个或多个突变。合适的宿主细胞包括能够生产核黄素(例如将给定的碳源转化成上文定义的核黄素)的微生物细胞。进行所述发酵过程的有用的菌株列于上文并且是本领域已知的。 [0079] 本发明的核酸优选地以经分离的方式提供，并优选地被纯化至同质。 [0080] 术语“经分离的”表示材料从其原始环境(例如在天然存在时为天然环境)中取出。例如，存在于活微生物中天然存在的多核苷酸不是经分离的，但是从天然系统中一些或所有共存材料中分离的相同多核苷酸则是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的部分和／或此类多核苷酸可以是组合物的部分并且仍然是经分离的，因为此类载体或组合物不是其天然环境的部分。 [0081] 在本文中使用时，术语“基因”是指可从染色体DNA中分离的核酸分子，其包括编码蛋白质(例如涉及核黄素合成的蛋白质，例如来自B.subtilis核黄素生物合成途径的酶)的开放读码框。 [0082] 基因可包括编码序列、非编码序列(例如位于基因编码区3’和5’端的非翻译序列，例如对源自基因的多肽的适当表达和稳定化而言重要的启动子区、调节子区和终止子区)。 [0083] 在本文中使用时，术语“多核苷酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核 酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)来合成核酸。此类寡核苷酸可被用于例如制备下述核酸，所述核酸具有改变的碱基配对能力或提高的核酸酶抗性。 [0084] 除非另有说明，通过对本文的DNA分子测序确定的所有核苷酸序列均使用自动DNA测序仪测定。因此，如本领域所已知的，对通过该自动化途径测定的任何DNA序列而言，本文测定的任何核苷酸序列可含有一些错误。通过自动化测定的核苷酸序列与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列典型地至少约90％相同，更典型地至少约95％到至少约99.9％相同。可以通过其它途径(包括本领域公知的手动DNA测序法)更精确地测定实际序列。 [0085] 本领域技术人员能够鉴定此类被错误鉴定的碱基，并知道如何纠正此类错误。 [0086] 根据本发明的多核苷酸可以被用作杂交探针或PCR引物，无论它们是经修饰的或是未经修饰的。还包括在内的是本文所述的多核苷酸用于增强和／或改进与Bacillus密切相关和在上文中被描述为合适宿主细胞的其他生物中同源性rib前导序列功能或活性的用途。在本文中使用时，术语“同源性rib前导序列”包括根据Vitreschak et al.，Nucleic Acid Res30，3141-3151，2002中图2(其中比对了不同的RFN元件)来自不同生物的rib前导序列。通过所述比对，技术人员能够容易地鉴定对应于源自B.subtilis的本文所述rib前导序列部分的rib前导序列的部分，从而在所列的本文所述生物中产生经修饰的rib前导序列。 [0087] 本发明还涉及能够在严格条件下，优选地在高度严格条件下，与本发明的多核苷酸，例如SEQ ID NOs：42、45、46、47、48、49、50、51、52、53、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82中所示，优选地选自SEQ ID NO：42、67、68、69、71、70的多核苷酸杂交的经分离的多核苷酸。有利地，此类多核苷酸可得自能够生产核黄素的微生物，特别是Bacillus subtilis。 [0088] 在本文中使用时，术语“杂交”旨在描述下述杂交和洗涤的条件，在所述条件下彼此至少约50％、至少约60％、至少约70％、更优选地至少约80％、进一步更优选地至少约 85％到90％、最优选地至少95％同源的核苷酸序列典型地保持彼此杂交。 [0089] 严格杂交条件的一个优选的非限制性例子是：于约45℃下在6X氯化钠／柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后于50℃、优选55℃、更优选60℃和进一步更优选65℃下，在1X SSC、 0.1％SDS中洗涤一次或多次。 [0090] 高度严格条件包括：例如，使用经标记的DNA探针例如地高辛(DIG)-标记的DNA探针，于42℃下孵育若干天的一段时间，之后于室温下在2x SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次，和于65-68℃下在0.5x SSC，0.1％SDS或0.1x SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。 具体地，高度严格条件包括例如于42℃下，在溶液例如含有或不含100μg／ml鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、 15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基硫酸钠、0.1％N-月桂酰肌氨酸和2％封闭试剂的溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，使用DIG-标记的DNA探针(通过例如使用DIG标记系统制备；Roche Diagnostics GmbH，68298Mannheim，德国)孵育2小时到4天，之后将滤纸于室温下在2x SSC和0.1％SDS中洗涤两次，每次5到15分钟，然后于65-68℃下在0.5x SSC 和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗涤两次，每次15-30分钟。 [0091] 技术人员应当知道对于严格和高度严格的杂交条件而言应用何种条件。涉及此类条件的其它指示在本领域中、例如在Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；and Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley&Sons，N.Y.)中能够容易地获得。 [0092] 另外，对应于本发明核苷酸序列或能与本发明核苷酸序列杂交的寡核苷酸可以通过标准合成技术，例如使用自动化DNA合成仪来制备。 [0093] 术语“同源性”或“同一性百分比”在本文可互换使用。就本发明的目的而言，其在本文被定义来测定两条核酸序列的同一性百分比，所述序列就最适比较的目的被排列(例如为了与第二核酸序列最适比对，可以向第一核酸序列的序列中引入缺口)。然后比较相应的位置上的核苷酸。当第一条序列中的一个位置被与第二序列中相应位置上相同的核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的。两条序列之间的同一性百分比是所述序列共享的相同位置数的函数(即％同一性=相同位置数／位置总数(即重叠位置)x100)。优选两条序列有相同的长度。 [0094] 技术人员应当明白下述事实：可获得若干种不同的计算机程序以测定两条序 列之间的同源性。例如，可以使用数学算法完成两条序列之间的序列比较和同一性百 分比测定。在一个优选的实施方案中，使用Needleman and Wunsch(J.MoI.Biol.(48)： 444-453(1970))算法，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两条氨基酸序列之间的同一性百分比，所述算法已经被整合进GCG软件包内的GAP程序中(可得自http：／／www.gcg.com)。技术人员应 当知道：所有这些不同的参数会产生轻微差异的结果，但是使用不同算法时两条序列的整体同一性百分比不会被显著改变。 [0095] 还在另一实施方案中，使用GCG软件包(可得自http：／／www.gcg.com)中的 GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两条核苷酸序列之间的同一性百分比。在另一实施方案中，使用E.Meyers and W.Miller算法(CABIOS，4：11-17(1989))，使用PAM120权重残表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分测定两条核苷酸序列的同一性百分比，所述算法已被整合进ALIGN程序(2.0版)中(可得自http：／／vega.igh.cnrs.fr／bin／align-guess.cgi)。 [0096] 实施例中给出了构建本发明微生物(即在涉及核黄素生产的基因的5’非翻译区中引入经修饰的rib前导区)的一种有用方法，其中本文公开的经修饰的rib前导区的引入导致来自各个rib基因的更多完整、全长mRNA转录本，这进一步导致提高的核黄素产率和／或生产力。重组微生物的选择可以通过引入抗生素抗性基因(例如氯霉素、新霉素、链霉素、壮观霉素等等)来进行。 [0097] 本发明涉及使用带有经修饰的rib前导区的微生物发酵生产核黄素。在本 文中使用时，术语“核黄素”包括但不限于核黄素、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，以及核黄素、FMN或FAD的前体、衍生物和盐，例如5-磷酸核黄素 或5-磷酸核黄素钠。核黄素、FMN和FAD的前体和／或衍生物可选自例如DRAPP； 5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5′-磷酸；2,5-二氨基-6-核糖醇氨 基-4(3H)-嘧 啶 酮-5 ′-磷 酸 (2,5-diamino-6-ribitylamino-4(3H)-pyrimidinone-5′-phosphate)；5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5′-磷酸；5-氨 基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮；6,7-二甲基-8-核糖醇2,4-二氧蝶啶 (6,7-dimethyl-8-ribityllumazine，DMRL)；和黄素蛋白。术语“核黄素”和“维生素B2”在本文中可互换使用。涉及核黄素生物合成的基因以及用于发酵生产核黄素的方法，特别是使用Bacillus菌株的发酵生产是已知的(见例如EP405370或Ullman′s Encyclopedia th of Industrial Chemistry，7 Edition，2007，Chapter Vitamins)。这些方法也可以用于使用包含本文所述经修饰的rib前导序列的突变体菌株来生产核黄素。 [0098] 在本发明的方法(即如上文所述生产核黄素的方法)中可以使用若干底物作为碳源。特别合适的案源可选自包含3、5或6个碳原子的化合物，例如D-葡萄糖、甘油、稠果汁、右旋糖、淀粉、蔗糖或核糖。优选地，碳源是D-葡萄糖。与上述方法关联时术语“碳源”、“底物”和“生产底物”可在本文中互换使用。 [0099] 在本文中使用经修饰的微生物的上述方法中使用的培养基可以是生产核黄素的任何合适的培养基。典型地，培养基是包含例如盐、底物和某pH的水性培养基。其中底物被转化成核黄素的培养基也被称作生产培养基。 [0100] 在本文中使用时，“发酵”或“生产”或“发酵方法”可以是在合适底物转化成核黄素的适当条件下，使用技术人员已知的培养基、条件和流程使用生长中的细胞，或者通过使用技术人员已知的培养基、条件和流程培养后使用非生长中的所谓的静息细胞。 [0101] 可以通过任何合适的手段从细胞中回收所生产的核黄素。回收表示例如所生产的核黄素可与生产培养基分离。任选地，由此生产的发酵产物可以被进一步加工，例如纯化。 [0102] 与使用微生物的上述方法有关时，在一个方面中，生长步骤可以在需氧条件下，在补充有适当生长用营养物的水性培养基(即生长培养基)中进行。培养可以例如以分批、补料分批、半连续或连续模式进行，其中补料分批或半连续模式是优选的。 [0103] 培养周期可取决于例如使用的宿主、pH、温度和营养培养基而变化，并可以是例如约10小时到约10天，优选地约4天到约7天，更优选地约2天到约8天，取决于微生物。技术人员应当知道合适微生物的最佳培养条件。 [0104] 培养可例如在约7.0的pH下进行，优选地在约6到约8范围内，更优选地约6.5 到7.5的pH下进行。进行培养的合适温度范围可以例如是从约13℃到约70℃，优选地从约35℃到约39℃，更优选地从约30℃到约39℃，最优选地从约36℃到约39℃。生长培养基通常可含有此类营养物，如可同化的碳源，例如D-葡萄糖、甘油、稠果汁、右旋糖、淀粉、蔗糖或核糖；和可消化的氮源，例如有机物质，例如胨、酵母提取物和氨基酸。培养基可以含有或不含尿素和／或玉米浸出液和／或烘焙酵母。多种无机物质也可以被用作氮源，例如硝酸盐和铵盐。另外，生长培养基通常可含有无机盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。使用上述流程获得的细胞可在与上文所述基本相同的模式、温度和pH条件下，在存在上述底物时，以下述方式被进一步孵育，所述方式使得它们将这些底物转化成想要的目标发酵产物。孵育可在富含氮的培养基中进行，所述培养基含有例如有机氮源，例如胨、酵母提取物、烘焙酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液，或无机氮源，例如硝酸盐和铵盐，在这种情况下细胞应当能够进一步生长同时生产想要的发酵产物。或者，孵育可以在缺乏氮的培养基(nitrogen-poor medium)中进行，在这种情况下细胞基本上不生长，并且会处于静息细胞的模式或生物转化的模式。在所有情况下，孵育培养基也可以含有无机盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和氯化钙。用于生产核黄素的合适培养基的一个例子描述于WO04／113510中(VF-培养基)，所述培养基对Bacillus特别有用。 [0105] 术语“生产”或“生产力”是本领域公知的，并且包括在给定时间和给定发酵体积内形成的核黄素的浓度(例如每小时每升的kg产物)。术语“生产效率”包括达到具体生产水平所需的时间(例如，细胞达到具体的发酵产物输出速率花费的时间)。术语“产率”是本领域公知的，并且包括将碳源转化成产物(即核黄素)的效率。这通常被描述成例如每kg碳源的kg产物。“提高化合物的产率和／或生产／生产力”表示在给定量的时间期间给定量的培养物中，回收的分子或所述化合物的有用的回收分子的量。 [0106] 测定核黄素产率／生产力的分析方法是本领域已知的。此类方法可包括但不限于HPLC或指示器菌株的使用(见例如Bretzel et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.22， 19-26，1999)。 [0107] 附图 [0108] 图1展示了Bacillus subtilis的rib前导区，包括其5’和3’侧翼序列。Rib前导区位于核苷酸位置562到857之间。(A)野生型rib操纵子，其中以粗体标明5′调节元件(分别为"ttgcgt"和"tataat")以及对应于SEQ ID NO：42中所示rib前导区第一个核 苷酸的转录起点("A″)。(B)rib前导区，其中ribO突变如三重ribO、RK41和RK1a的位 置以粗体标明。(C)到(I)rib前导区，其中侧翼-右、终止子、茎环-右、茎环-左、SWITCH缺失、del mro175和整个rib前导区的位置分别通过下划线标明。更多解释见文本，特别是实施例。 [0109] 图2展示了通过LFH-PCR构建在强组成型Pspo15启动子下游带有mRNA稳定化元件(St)的经遗传改变的微生物的不同步骤，所述mRNA稳定化元件位于包含基因ribD、ribE、ribA的rib操纵子的5’端。为了选择重组微生物，使用氯霉素(Cm)抗生素抗性盒。(A)使用LFH-PCR，用强启动子代替天然启动子。(B)引入mRNA稳定化元件。更多解释见实施例。 [0110] 以下实施例仅用于阐述而不旨在以任何方式限制本发明的范围。本申请通篇 中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请通过引用并入本文，特别是EP405370、WO04／106557、WO07／051552和EP1186664。 实施例 [0111] 实施例中涉及的下述培养基描述于WO04／106557中：胰蛋白胨血琼脂培养液 (Tryptone Blood Agar Broth，TBAB，Difco)培养基，Veal Infusion-酵母提取物培养液(VY)培养基，10X Spizizen盐和最小培养基(Minimal Medium，MM)。另外，使用以下培养基： [0112] 100X微量元素溶液A：12.5g MgCl2·6H2O；0.55g CaCl2；1.35g FeCl2·6H2O； 0.1g MnCl2·4H2O；0.17g ／ l ZnCl2；0.043g CuCl2·2H2O；0.06g CoCl2·6H2O；0.06g Na2MoO4·2H2O；加H2O至11，经高压灭菌。 [0113] 5X最小盐溶液：0.057M K2SO4；0.31M K2HPO4·5H2O；0.22M KH2PO4；0.017M柠檬酸钠·7H2O；0.004M MgSO4.H2O，pH7.0，经高压灭菌。 [0114] 100X 微 量 元 素 溶 液 B：0.55g CaCl2；0.17g ZnCl2；0.043g CuCl2·2H2O； 0.06CoCl2·6H2O；0.06g Na2MoO4·2H2O；加H2O至11，经高压灭菌。 [0115] 核黄素筛选培养基(RSM)：200ml10X Spizizen盐；10ml100X微量元素溶液A； 2ml50％葡萄糖；36ml25％棉子糖；10ml10％酵母提取物；加H2O至11。 [0116] Spizizen最小培养基(SMM)：100ml10X Spizizen盐；10ml50％葡萄糖；1ml40％谷氨酸钠；10ml微量元素溶液A；加H2O至11。 [0117] 摇瓶中的核黄素生产如下进行：从冷冻甘油菌种中将菌株接种于5mL富含VY的培养基中，以280rpm的转动，于37℃下生长过夜。通过离心收集细胞，并重悬于1ml RSM(见上文)中。使用250ul细胞悬浮液接种250ml带挡板摇瓶中的25ml RSM。在39℃和220rpm摇动下孵育48小时后，采取500μl培养物，并在室温下将35μl4N NaOH与样品混合1分钟，允许溶解核黄素晶体。通过添加465μl1 M磷酸钾缓冲液(pH6.8)中和样品，并通过离心沉淀(5分钟，13200rpm)。使用上清液进行核黄素和两种副产物浓度的HPLC测定，所述两种副产物是6,7-二甲基-8-核糖醇2,4-二氧四氢蝶啶(DMRL)和奥索马嗪(oxolumazine)。 另外，采取第二培养物样品，并在离心(5分钟，13200rpm)后使用上清液测定培养基中残余的葡萄糖和棉子糖浓度，来计算相对于碳源的核黄素产率。 [0118] 通过HPLC分析来自摇瓶培养物的样品。在装有恒温自动采样器、二极管阵列和荧光检测器的Agilent1100HPLC系统上进行色谱。在装有4mm LC-8DB保护柱的Supelcosil LC-8DB-5μ柱(150mm x4.6mm)上进行分离。使用0.1M乙酸和甲醇的混合物作为移动相。 通过从2％甲醇(持续5分钟)开始并在15分钟内达到50％甲醇，应用梯度洗脱。将柱保 持在20℃下。通过280nm下的UV记录信号。核黄素与杂质(例如副产物：DMRL和奥索马 嗪)充分分离并在15.2min被洗脱。计算以得自Fluka的参考材料为基础。方法从10μg／ml到1mg／ml校准。 [0119] 另外，使用四元泵、自动采样器、UV-和折射指数检测器，通过Agilent1100系列HPLC系统分析培养液中葡萄糖和棉子糖的浓度。分离在CAPCELL PAK NH2UG80柱(4.6mm x250mm，5μ)(Shiseido)上进行。最佳柱温度为35℃。移动相是乙腈DI水以65／35比 例的混合物。流速为1.0ml／min，注射体积被设置为5μl。检测折射指数信号并用于检测。每种化合物的校准范围是从0.5mg／ml到30mg／ml。 [0120] 实施例1 [0121] 生产核黄素营养缺陷型菌株 [0122] 为了改造B.subtilis的核黄素操纵子的原始前导序列和启动子序列，用得自质粒pUB110(Itaya et al.，1989，Nucleic Acid Res.17：4410)的新霉素抗性(neo)盒代替编码RibD脱氨酶结构域的ribD(ribG)的5′部分、5′前导序列和核黄素启动子，得到核黄c 素-营养缺陷型菌株B.subtilis BS3813。源自B.subtilis菌株1A747(SPβ，原养型)的基因组DNA得自Bacillus Genetic Stock Center，The Ohio State University，Columbus，Ohio43210USA，所述B.subtilis菌株1A747是B.subtilis168(trpC2)的衍生物。 [0123] 为了构建菌株，使用长侧翼同源性聚合酶链式反应(Long Flanking Homology Polymerase Chain Reaction，LFH-PCR)产生含有1236bp neo抗性盒的DNA片段，所述neo抗性盒侧翼是天然Prid启动子上游区526bp(侧翼5′)和ribD基因的502bp3′端(侧翼 3′)。因此，首先通过PCR扩增3个DNA片段：侧翼5’、neo抗性盒和侧翼3’。如下产生DNA片段侧翼5’和侧翼3’：对含1μl10mM dNTP′s、5μl10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Stratagene)的50μl反应体积中0.1μgB.subtilis1A747的染色体DNA添加1μl引物 p50(SEQ ID NO：6)与p51(SEQ ID NO：7)一起或引物p44(SEQ ID NO：4)与p45(SEQ ID NO： 5)一起的100μM溶液。为了产生含有neo抗性盒的DNA片段，对含有1μl10mM dNTP′s、 5μl10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Stratagene)的0.05μg pUB110DNA添加1μl引物 p9(SEQ ID NO：2)与p10(SEQ ID NO：3)一起的100μM溶液。在35个循环的三个相继步骤中进行PCR反应：(i)94℃下30秒的变性步骤；(ii)52℃下30秒的退火步骤；(iii)72℃下 1分钟的延伸步骤。PCR循环之前是95℃下3分钟的变性步骤。三种PCR产物通过琼脂糖 凝胶电泳分离，并使用MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen)从凝胶中提取。在最终的LFH-PCR反应中，组合了三种经纯化的PCR产物(侧翼5’、neo抗性盒和侧翼3’)：对含有 1μl10mM dNTP′s、5μl10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Stratagene)的50μl的最终反应体积添加1μl引物p45与p51一起的100μM溶液，1μl侧翼5′PCR产物(50ng)，1μl 侧翼3′PCR产物(50ng)和1μl neo抗性盒(100ng)。在35个循环的三个相继步骤中进 行LFH-PCR反应：(i)94℃下30秒的变性步骤；(ii)52℃下30秒的退火步骤；(iii)72℃下 2.5分钟的延伸步骤。PCR循环之前是95℃下3分钟的变性步骤。使用QiaQuick PCR纯 化试剂盒(Qiagen)纯化组合的LFH-PCR产物。使用经纯化的LFH-PCR产物(2μg)转化感 受态B.subtilis1A747细胞。在含有2mg／l新霉素和100mg／l核黄素的TBAB平板上 r 选择新霉素抗性(Nm)转化体。使用引物p45与p10，和引物p51与p9，和转化体的染色体r DNA作为模板DNA，通过两个PCR实验证实得到的核黄素-营养缺陷型和Nm BS3813菌株 的正确基因型。使用上文所述用于产生DNA片段侧翼5′和侧翼3′的标准反应条件进行PCR反应。另外，通过测序证实来自BS3813的ribD的序列。 [0124] 根据WO07／051552中所述方法(见实施例6)用PBS-1噬菌体进行缺失构建体 的转导，其中使用BS3813的溶解产物转导在转酮酶基因中带有突变的过量生产核黄素的菌株B.subtilis BS3534(BS3534的构建见WO07／051552)。BS3534以过量生产核黄素的菌株B.subtilis RB50为基础，所述菌株B.subtilis RB50详细描述于EP405370并可以保藏号NRRL B-18502获得。在含有2mg／l新霉素和100mg／l核黄素的TBAB琼脂平板 r 上选择Nm 转导体。如上文所述通过PCR证实经分离的转导体的基因型。得到的菌株称作BS3798。 [0125] 实施例2 [0126] 生产带有经修饰的rib前导序列的菌株 [0127] 将两种突变引入rib前导区中，以脱调节rib基因的转录，其中I型是指ribO突变，II型是指rib前导区的(部分)缺失(见图1)。 [0128] 产生三种ribO突变，即称作″RK41″的C85T，称作″RK1a′′的G121A，和称作“三重ribO”的三重组合G39A-G40A-G41A。对II型突变体而言，从rib前导区中缺失以下部分，其中核苷酸的编号是指分离自B.subtilis的SEQ ID NO：42中所示的rib前导序列： 称作“del茎环-右”的核苷酸250到257(SEQ ID NO：36)的缺失，称作“del茎环-左”的核苷酸231到238(SEQ ID NO：37)的缺失，称作“del侧翼-右”的核苷酸239到263(SEQ ID NO：38)的缺失，称作“del终止子”的核苷酸231到263(SEQ ID NO：39)的缺失，称作“SWITCH缺失”的核苷酸166到263(SEQ ID NO：40)的缺失，称作“del mro175”的核苷酸 135到263(SEQ ID NO：41)的缺失，称作“前导区缺失的”整个前导区即核苷酸1到263(SEQ ID NO：42)的缺失。在mro175缺失的情况下，也发生四个核苷酸的插入(5′-ATGG-3′)。 [0129] 带有经修饰的rib前导序列以及rib启动子(SEQ ID NOs：45-54)的菌株的构建基本上通过根据实施例1中列出的流程／条件的两个PCR反应进行，其中在第一个PCR反应中，使用来自B.subtilis1A747的染色体DNA产生称作侧翼5’和侧翼3’的两条DNA片段。在根据实施例1中所述流程／条件的第二个PCR反应中，使用引物p45和p51组合这两条PCR-片段。第一PCR反应的各个引物对(即用于产生侧翼5’的引物和用于产生侧翼3’的引物，所述侧翼5’和侧翼3’导致想要的突变／缺失，见上文)分别列于表1第2列和第 3列中。使用QiaQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化后，使用2μg经纯化的全长PCR产 物转化感受态B.subtilis BS3813细胞(见实施例1)。将细胞涂布在SMM平板上。将核黄素-原养型转化体悬浮于1ml0.9％NaCl溶液中。将原始细胞悬浮液的100μl500-倍稀释液涂布在TBAB琼脂平板上。将单个菌落转移至新鲜的TBAB琼脂平板上和补充有2mg／l Nm和100mg／l核黄素的TBAB琼脂平板上。正确的转化体对新霉素敏感，因此仅在TBAB 琼脂平板上生长，不在补充有新霉素的平板上生长。另外，通过对新引入的rib启动子和ribD测序证实基因型。如表1第4列中所示为在rib前导区中含有各个突变／缺失的新产生的B.subtilis菌株命名。 [0130] 制备来自新产生的菌株的PBS-1溶解产物，并用于转导(在实施例1中产生的) BS3798。在SMM平板上选择经转导的细胞。将核黄素-原养型B.subtilis转导体悬浮于 1ml0.9％NaCl溶液中。将原始细胞悬浮液的100μl500-倍稀释液涂布在TBAB琼脂平板 上。将单个菌落转移至新鲜的TBAB琼脂平板上和补充有2mg／l Nm和100mg／l核黄素 的TBAB琼脂平板上。正确的转化体仅在TBAB琼脂平板上生长，因此是新霉素敏感的。如表1第5列中所示为新产生的菌株命名。 [0131] 表1：分别用于构建侧翼5′和侧翼3′片段导致经修饰的rib前导序列的引物 对，和用所述PCR片段转化或用各个溶解产物转导得到的菌株的命名(更多解释见文本)。 [0132] [0133] 经转化的菌株：用各个PCR片段转化B.subtilis BS3813后B.subtilis菌株的命名(neo-抗性；基于wt-菌株B.subtilis1A747的B2-营养缺陷型)；经转导的菌株：用根据第4列的各个菌株的溶解产物转导B.subtilis BS3798后B.subtilis菌株的命名(neo-抗性，基于B.subtilis RB50的B2-营养缺陷型)。更多解释见文本。 [0134] 如上文所述在摇瓶筛选中针对核黄素生产检验新产生的菌株。48小时后，通过添加4N NaOH溶解500μl样品的核黄素，中和并离心后，通过HPLC测定经加工的样品的核黄素浓度以及DMRL和奥索马嗪(DMRL的降解产物)浓度。为了计算相对于碳源的核黄素产 率，通过HPLC测定所有碳源的起始和残余浓度。 [0135] 结果展示于表2中。尽管野生型菌株(1A747)背景中天然的rib操纵子基本上不向培养基内分泌任何核黄素，但是针对核黄素过量生产选择的菌株背景(RB50)中相同的rib操纵子分泌可测出量的核黄素。用ribO突变体RK41分别在wt(BS3958)和RB50背景 (BS3987)二者中获得了最好的结果。终止子的缺失未导致出人意料的结果，特别是在wt背景(BS3815)中。尽管在wt背景中用RK1a ribO突变体(BS3833)获得了第二好的结果，但是用SWITCH缺失(BS3900和BS3916)实现了RB50背景中的第二好的结果，这显示比前导 区缺失菌株甚至更高的核黄素产率。 [0136] 表2A：以带有天然rib前导区的wt菌株B.subtilis1A747为基础的如所示经转 化的B.subtilis菌株的核黄素生产。产率作为每g碳源的g核黄素给出(更多解释见文 本)。 [0137] 菌株 Rib前导区突变 产率[％] 1A747 野生型 0.0004 BS3833 RK1a 0.0570 BS3958 RK41 0.1100 BS3814 del侧翼-右 0.0090 BS3815 del终止子 0.0103 BS3867 SWITCH缺失 0.0139 [0138] 表2B：以带有天然rib前导区的过量生产核黄素的菌株B.subtilis RB50为基础如所示经转导的B.subtilis菌株的核黄素生产。产率作为每g碳源的g核黄素给出(更 多解释见文本)。 [0139] [0140] 实施例3 [0141] 用强组成型启动子代替天然rib启动子 [0142] 为了评估rib前导区突变与强启动子组合的可能的协同效应，用强组成型启动子Pveg或用PSpo15代替新产生的构建体(见实施例2)的原始rib启动子。构建方式与实施例2的途径密切相似。为了产生DNA片段侧翼3′和侧翼5′，对含1μl10mM dNTP′s、5μl10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Stratagene)的50μl反应体积中0.1μg1A747的染色体 DNA添加1μl引物p60(SEQ ID NO：12)与p51(用于构建Pveg)一起或引物p62(SEQ ID NO：14)与p51(用于构建PSpo15)一起和引物对p45与p61(SEQ ID NO：13)(用于构建Pveg)或引物p45与p63(SEQ ID NO：15)一起(用于构建PSpo15)的100μM溶液。在35个循环 的三个相继步骤中进行PCR反应：(i)94℃下30秒的变性步骤；(ii)52℃下30秒的退火步骤；(iii)72℃下1分钟的延伸步骤。PCR循环之前是95℃下3分钟的变性步骤。两种PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，并使用MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen)从凝胶中提取。在最终的PCR反应中，组合了两种经纯化的PCR产物(侧翼5’和侧翼3’)：在含有 1μl10mM dNTP′s、5μl10X缓冲液和0.5μl Pfu聚合酶(Stratagene)的50μl的最终 反应体积中混合1μl引物p45与p51的100μM溶液，1.0μl侧翼5′PCR产物(50ng)和 1.0μl侧翼3′PCR产物(50ng)。在35个循环的三个相继步骤中进行PCR反应：(i)94℃ 下30秒的变性步骤；(ii)52℃下30秒的退火步骤；(iii)72℃下2.5分钟的延伸步骤。PCR循环之前是95℃下3分钟的变性步骤。使用QiaQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化组 合的PCR产物。使用经纯化的全长PCR产物(2μg)转化感受态B.subtilis BS3813细胞。 将细胞涂布在SMM平板上。将核黄素-原养型Bacillus转化体悬浮于1ml0.9％NaCl溶 液中。将原始细胞悬浮液的100μl500-倍稀释液涂布在TBAB琼脂平板上。将单个菌落转移至新鲜的TBAB琼脂平板上和补充有2mg／l Nm和100mg／l核黄素的TBAB琼脂平板 上。正确的转化体仅在TBAB琼脂平板上生长，因此是新霉素敏感的。另外，通过对新整合的启动子、rib前导区和ribD测序证实基因型。带有Pveg驱动的rib操纵子的菌株被称作BS3811，带有PSpo15驱动的rib操纵子的菌株被称作BS3817。 [0143] 为了将强启动子与前导区修饰组合，在实施例2中描述的所有PCR反应中，分别用菌株BS3811(Pveg启动子)和BS3817(PSpo15启动子)代替菌株1A747的gDNA。每个PCR 反应的所有其他条件(包括使用的引物对)保持不变。将最终的PCR产物转化进BS3813 中，并如所述验证获得的转化体(实施例2)。在构建体PSpo15_前导区缺失的情况下，如表 4中所示使用针对侧翼5′PCR产物的引物对p45／p9和针对侧翼3′PCR产物的p96／ p51。所述其他步骤如上文所述进行。制造以下构建体，括号中是用所述构建体转化得到的B.subtilis菌株的命名：Pveg_del侧翼-右(BS3840)，PSPo15_del侧翼-右(BS3831)，Pveg_del终止子(BS3844)，PSpo15_del终止子(BS3871)，PSpo15_SWITCH缺失(BS3874)，PSpo15_leader缺失(BS3944)，Pveg_RK41(BS3887)，Pveg_RK1a(BS3953)，PSpo15_RK1a(BS3884)，Pveg_三重ribO(BS3912)。 [0144] 由上述菌株制备PBS-1溶解产物，并转导进BS3798中。在SMM平板上选择经转导的细胞。将核黄素营养缺陷型B.subtilis转化体悬浮于1ml0.9％NaCl溶液中。将原始 细胞悬浮液的100μl500-倍稀释液涂布在TBAB琼脂平板上。将单个菌落转移至新鲜的 TBAB琼脂平板上和补充有2mg／l Nm和100mg／l核黄素的TBAB琼脂平板上。正确的 转化体仅在TBAB琼脂平板上生长，因此是新霉素敏感的。产生以下菌株：用来自BS3953的PBS-1溶解产物转导的BS3970和BS3971；用来自BS3884的PBS-1溶解产物转导的BS3905 和BS3907；用来自BS3887的PBS-1溶解产物转导的BS3903和BS3914；用来自BS3912的 PBS-1溶解产物转导的BS3981-83；用来自BS3840的PBS-1溶解产物转导的BS3890；用来自BS3844的PBS-1溶解产物转导的BS3880和BS2882；用来自BS3817的PBS-1溶解产物转 导的BS3850和BS3851；用来自BS3944的PBS-1溶解产物转导的BS5026和BS5041；用来自BS3831的PBS-1溶解产物转导的BS3853；用来自BS3874的PBS-1溶解产物转导的BS3897 和BS3956。 [0145] 如上文所述在摇瓶中检验大部分菌株的核黄素生产。48小时后，通过添加4N NaOH溶解500μl样品的核黄素，中和并离心后，通过HPLC测定经加工的样品的核黄素浓度以及DMRL和奥索马嗪浓度。为了计算相对于碳源的核黄素产率，通过HPLC测定所有碳源的起始和残余浓度。结果展示于表3中。 [0146] 表3A：以带有天然rib前导区的wt菌株B.subtilis1A747为基础的如所示经转 化的B.subtilis菌株的核黄素生产。产率作为每g碳源的g核黄素给出(更多解释见文 本)。 [0147] 菌株 Rib前导区突变 产率[％] 1A747 野生型 0.0004 BS3811 Pveg 0.0120 BS3817 PSpo15 0.0163 BS3953 Pveg_RK1a 0.1600 BS3884 PSpo15_RK1a 0.7706 BS3887 Pveg_RK41 0.3757 BS3912 Pveg_三重ribO 1.0900 BS3840 Pveg_del侧翼-右 0.0748 BS3831 PSpo15_del侧翼-右 0.0702 BS3844 Pveg_del终止子 0.0666 BS3871 PSpo15_del终止子 0.0359 BS3874 PSpo15_SWITCH缺失 0.2823 BS3944 PSpo15_前导区缺失 0.1150 [0148] 表3B：以带有天然rid前导区的过量生产核黄素的菌株B.subtilis RB50为基础的如所示经转导的B.subtilis菌株的核黄素生产。产率作为每g碳源的g核黄素给出(更多解释见文本)。 [0149] [0150] 对rib前导区或rib启动子进行的所有操作导致提高的核黄素生产。根据实施 例2中所述结果(见表2)，用强的组成型启动子代替天然启动子时，ribO突变RK41也是最有效的突变。通过使用强启动子，用Pveg与RK41的组合达到了高达4.2％的产率。PSpol5与SWITCH缺失的组合令人惊讶地显示3.8％的第二最佳产率，这比导致2.4％产率的PSpo15与del终止子的组合好得多。 [0151] 对rib前导区或rib启动子进行的所有操作导致提高的核黄素生产。根据实施 例2中所述结果(见表2)，用强的组成型启动子代替天然启动子时，ribO突变RK41也是最有效的突变。通过使用强启动子，用Pveg与RK41的组合达到了高达4.2％的产率。PSpol5与SWITCH缺失的组合令人惊讶地显示3.8％的第二最佳产率，这比导致2.4％产率的PSpo15与del终止子的组合好得多。 [0152] 实施例4 [0153] ribO突变与前导区缺失和用强组成型启动子代替天然rib启动子的组合 [0154] 为观察典型脱调节性ribO突变与前导区缺失的组合是否能够提高核黄素恒产，组合了实施例2和3中产生的一些突变。构建按照上文所列流程进行。用于侧翼5′和 3′PCR的模板和引物展示于表4中(更多信息也见实施例1)。组合性PCR和进入BS3813 的转化如实施例2和3中所述进行。测序揭露了构建体PSpo15_三重ribO_del mro175和 Pveg_三重ribO_del mro175中存在两种额外的突变，即T25G和C101T，其中编号对应于SEQ ID NO：42。带有新产生的构建体的新菌株的命名展示于表4第4列中。 [0155] 制备来自新产生的菌株的PBS-1溶解产物并用于转导(实施例1中产生的) BS3798。经转导的细胞在SMM平板上的选择如实施例2中所述进行。新转导的菌株如表4第5列中所示命名。 [0156] 表4：分别用于构建侧翼5和侧翼3′片段导致经修饰的rib前导区序列与各自组成型启动子组合的引物对，和用所述PCR-片段转化或用各自溶解产物转导得到的菌株的命名(更多解释见文本)。 [0157] [0158] 如上文所述通过摇瓶筛选进行新产生的菌株的核黄素生产的检验。结果展示于表5中，显示与实施例3中所示结果(见表4)相比核黄素生产的进一步提高。ribO突变 RK41和三重ribO分别与强启动子和rib前导区缺失的组合导致摇瓶筛选中大于7.6％的 核黄素产率，与之相比，无前导区缺失的最佳组合——Pveg启动子与ribO突变RK41的组合实现了4.2％的核黄素产率(见表4)。本文所述的特异性前导区缺失几乎使脱调节的 (ribO突变，组成型启动子)rib前导区-启动子组合的产率翻番。除“SWITCH缺失”之外，“del mro175”也出人意料地能够改进RB50背景中的核黄素产率，超过无缺失的构建体。终止子的缺失(“del终止子”)也具有积极但是较不显著的效果。PSpo15被直接置于ribD的Shine-Dalgamo序列之前的前导区缺失构建体显示比最好的三重构建体(BS5026，见表4和 6)小3.6-倍的产率。这些结果指出，rib前导区不仅是调节必需的，而且也是全长转录本稳定化所必需的。 [0159] 表5：以带有天然rib前导区的过量生产核黄素的菌株B.subtilis RB50为基础的如所示经转导的B.subtilis菌株的核黄素生产。产率作为每g碳源的g核黄素给出(更 多解释见文本)。 [0160] 菌株 Rib前导区突变 产率[％] RB50 野生型rib操纵子 0.46 BS3908 Pveg_三重ribO_del mro175 6.79 BS3922 PSpo15_三重ribO_del mro175 6.47 BS3984 PSpo15_RK41_del终止子 5.24 BS3964 PSpo15_RK41_SWITCH缺失 7.80 BS3899 Pveg_RK41_SWITCH缺失 7.67 BS5026 PSpo15_前导区缺失 2.16 [0161] 实施例5 [0162] 用mRNA稳定化元件代替天然rib前导区 [0163] aprE mRNA稳定化元件的DNA序列分布于两种PCR产物上。为了扩增在aprE mRNA稳定化元件5’端含有rib操纵子5’区域的PCR产物1，在标准PCR条件下使用引物p45与p143′(SEQ ID NO：33)和来自菌株BS3817的染色体DNA作为模板。为了扩增在aprE mRNA稳定化元件3’端含有ribD的PCR产物2，在标准PCR条件下使用引物p51和p142(SEQ ID NO：32)和来自菌株BS3817的染色体DNA作为模板。在标准LFH-PCR反应中，如上文所述将经凝胶纯化的PCR产物1和2组合进一条DNA片段中。相同方法适用于grpE mRNA稳定 化元件，使用来自菌株BS3817的染色体DNA作为模板，在如上文所述的条件下使用引物对p45／p145’(SEQ ID NO：35)和引物对p51／p144(SEQ ID NO：34)用于最先两次PCR，之后使用引物对p45／p51组合PCR。再次将经纯化的LFH-PCR产物转化进核黄素营养缺陷 型B.subtilis BS3813的感受态细胞中，其中核黄素启动子区和ribD的5’部分被新霉素抗性盒代替。在SMM平板上选择核黄素原养型转化体。将经分离的转化体悬浮于1ml0.9％NaCl溶液中，并将原始细胞悬浮液的100μl500-倍稀释液涂布在TBAB琼脂平板上。将单个菌落转移至新鲜的TBAB琼脂平板上和补充有2mg／l Nm和100mg／l核黄素的TBAB琼 脂平板上。正确的转化体仅在TBAB琼脂平板上生长，因此是新霉素敏感的。另外，通过测序新引入的DNA段证实基因型。得到的菌株分别被称作BS5193(带有构建体P15ΩaprEribDEAHT)和BS5196(带有构建体P15ΩgrpEribDEAHT)。 [0164] 制备来自菌株BS5193和BS5196的PBS-1溶解产物，并用于转导(在实施例1中 产生的)BS3798。如实施例2中所述在SMM平板上选择经转导的细胞。基于菌株BS5193 的新转导的菌株分别被称作BS5260和BS5262，基于菌株BS5196的新转导的菌株被称作 BS5244。 [0165] 如上文所述在摇瓶实验中检验核黄素生产。结果展示于表6中。 [0166] 表6A：与带有天然rib前导区的wt B.subtilis菌株1A747相比，如所示经转化的B.subtilis菌株的核黄素生产。产率作为每g碳源的g核黄素给出(更多解释见文本)。 [0167] 菌株 Rib前导区突变 产率[％] 1A747 野生型 0.0004 BS3817 PSpo15 0.0163 BS3944 PSpo15_前导区缺失 0.1150 BS5193 PSpo15_aprE 0.1000 BS5196 PSpo15_grpE 0.3700 [0168] 表6B：与带有天然rib前导区的过量生产核黄素的菌株B.subtilis RB50相比，如所示经转导的B.subtilis菌株的核黄素生产。产率作为每g碳源的g核黄素给出(更 多解释见文本)。 [0169] 菌株 Rib前导区突变 产率[％] RB50 野生型rib操纵子 0.46 BS3850 PSpo15 1.57 BS5026 PSpo15_前导区缺失 2.16 BS5260 PSpo15_aprE 2.07 BS5244 PSpo15_grpE 2.99 [0170] 与被调节的野生型rib操纵子相比，用未经调节的(non-regulated)组成型启动子例如PSpo15代替rib启动子将摇瓶筛选中的核黄素产率提高了41倍(在野生型背景中)和3.4倍(在RB50背景中)。去除rib前导区并将PSpo15启动子直接置于ribD前时，核黄 素产率再被提高7倍(在野生型宿主菌株中)和1.4倍(在RB50背景中)。用aprE mRNA 稳定化元件代替rib前导区显示在上文使用的两种菌株背景中均对产率无影响。然而，用grpE mRNA稳定化元件代替rib前导区时，核黄素产率提高3.7倍(在野生型宿主中)和 1.44倍(在RB50背景中)。 [0171] 为了检验经修饰的rib操纵子的表现对宿主菌株的影响，还将来自B.subtilis 1A747(野生型rib操纵子)、BS5193、BS5196和BS3944的溶解产物转导进称作 - mut BS5178(spoOA，rib：：neo，ribC1，bpr：：cam，tkt )的另一RB50变体中。如上文所述进行摇瓶筛选。结果(包括新构建的菌株的名称)展示于表7中。 [0172] 表7：如上文所示经转导的B.subtilis菌株的核黄素生产。产率作为每g碳源的g核黄素给出，并与BS5240的产率比较。 [0173] 菌株 Rib前导区突变 产率[％] BS5240 PSpo15_前导区缺失 100 BS5191 野生型rib操纵子 40 BS5237 PSpo15_aprE 140 BS5238 PSpo15_grpE 270 [0174] 以摇瓶模式检验时，新菌株背景中稳定化元件的积极影响更为显著。与带有无前导区的rib操纵子的菌株相比，目前aprE mRNA稳定化元件也将核黄素产率提高了40％。 与无rib前导区的构建体相比，grpE mRNA稳定化元件甚至显示提高至2.7倍的产率。 [0175] 以摇瓶模式检验时，新菌株背景中稳定化元件的积极影响更为显著。与带有无前导区的rib操纵子的菌株相比，目前aprE mRNA稳定化元件也将核黄素产率提高了40％。 与无rib前导区的构建体相比，grpE mRNA稳定化元件甚至显示提高至2.7倍的产率。 [0176] 实施例6 [0177] 额外的ribO突变与前导区缺失和强组成型启动子的组合 [0178] 以与ribO突变RK41(=RK61a)，RK1a和组合了Kil et al.，1992的ribO突变RK4、RK8、RK5(=RK2)的“三重ribO”被引入rib前导区中相同的方式，可以将Kil et al.，1992中描述的额外的ribO突变用于产生替代性的经优化的rib前导区。突变的编号涉及SEQ ID NO：42中所示的rib前导序列。所述突变RK111a(G59A)、RK116a(G56A)、RK62a(G60A；与RK82a相同)、RK93a(C87T)和RK27a(C128T)与del终止子、SWITCH缺失和del mro175(见上文)以及强组成型启动子PSpo15或Pveg组合在一起，取决于用于产生侧翼5′和侧翼3′的模板。作为ribO突变有效的任何突变可以通过这种方式与所述启动子和前导区缺失组合。 [0179] 使用以下引物对构建ribO突变：用于构建RK111a的引物对p111a_f／p111a_ r(SEQ ID NO：83和84)；用于构建RK116a的引物对p116a_f／p116a_r(SEQ ID NO：85和 86)；用于构建RK62a的引物对p62a_f／p62a_r(SEQ ID NO：87和88)；用于构建RK93a的引物对p93a_f／p93a_r(SEQ ID NO：89和90)；用于构建RK27a的引物对p27a_f／p27a_r(SEQ ID NO：91和92。这些引物在如实施例2中所述的PCR反应中使用。为了产生侧翼 5′，引物p45与反义引物一起应用。为了产生侧翼3′，有义引物与引物p51一起应用。使用引物p45和p51在第三PCR中组合侧翼5′和3′(见实施例2)。如实施例2中所述进 行菌株的转化和转导。为了代替天然启动子，遵照根据权利要求3的指示，为了将ribO突变与前导区突变组合，遵照根据权利要求4的指示。 [0180] 表9：通过先前实施例中上述基于PCR的方法产生ribO构建体所需的模板(更多解释见文本)。 [0181] rib前导区突变的命名 侧翼5′的模板 侧翼3′的模板 PSpo15_RK111a BS3817 BS3817 Pveg_RK111a BS3811 BS3811 PSpo15_RK111a_SWITCH缺失 BS3874 BS3874 Pveg_RK111a_SWITCH缺失 BS3811 BS3867 PSpo15_RK111a_del终止子 BS3871 BS3871 Pveg_RK111a_del终止子 BS3844 BS3844 PSpo15_RK111a_del mro175 BS3817 BSmro175 Pveg_RK111a_del mro175 BS3811 BSmro175 [0182] 将针对表9中所列所有构建体产生的PCR产物转化进BS3813中。如实施例2中 所述进行选择，并使用经证实的菌株的溶解产物转导BS3798。如上文所述在摇瓶实验中获得的核黄素产率在构建体RK41_SWITCH缺失或三重ribO_del mro175的范围内(见表5)。 使用另一菌株背景(例如实施例5中所述)时，这些量被进一步提高。 [0183] 实施例7 [0184] 生产除带有经修饰的rib前导序列的B.subtilis之外的其他菌株 [0185] 可以使用上文实施例中所述的构建体在来自其他菌株的rib前导序列中鉴定／产生相应的修饰，所述其他菌株已知具有到位的核糖开关，并且是核黄素生产的合适宿主菌株。 [0186] 在根据Vitreschak et al.，Nucleic Acid Res30，3141-3151，2002图2中所示的比对中，鉴定了其他生物中未经修饰的rib前导区的相应部分。如上文所述产生缺失突变并任选地与ribO突变(与在B.subtilis中鉴定突变的同源)组合。构建体可进一步与上 述宿主菌株的其他已知修饰或强启动子组合，从而在本领域技术人员已知的合适培养条件下提高核黄素生产。