[0001] 本发明属于植物基因工程技术和分子生物学领域，具体涉及一种马铃薯高温诱导型启动子pStHSFA2的分离、鉴定和应用。

[0002] 植物在生长发育过程中会受到许多环境因子的胁迫，其中温度对植物生长发育的影响尤其严重。随着全球温度的持续上升，高温胁迫已经成为影响植物生长发育的重要因素之一。高温胁迫对植物的生长发育影响广泛，宏观上会造成植株缺水、种子发芽受抑制、畸形生长、雄性不育和谷物类作物产量降低等问题；在生理层面上高温胁迫则会导致植物气孔关闭，光合作用下降，体内水分关系、干物质生产、呼吸作用、矿物质代谢、激素平衡以及抗氧化系统等重要信号与代谢过程发生变化；而在分子层面上，高温胁迫会引起蛋白质错误折叠、RNA/DNA结构改变等危害。

[0003] 高温被认为是影响马铃薯植株生长和块茎产量最重要的环境因素之一。高温胁迫下马铃薯幼苗生长缓慢，叶片萎蔫甚至枯黄损伤，叶片长度变短，且叶片、叶柄会发生明显的卷曲。在结薯期遭遇高温胁迫，会造成马铃薯块茎发育延缓，畸形薯增加，单株匍匐茎数减少，商品薯率、结薯数显著降低，病毒病染病率上升，产量下降。高温胁迫在降低马铃薯产量的同时还会造成块茎品质的下降。结薯期高温使得马铃薯块茎中淀粉合成关键酶活性下降，淀粉合成速率降低，从而导致块茎中淀粉积累量变少，还原糖、干物质等营养成分含量也显著下降。与此同时，高温胁迫还会引起块茎中的甾醇糖基生物碱含量上升，严重影响块茎的口感。因此，解析马铃薯耐高温的分子机制，培育马铃薯耐高温品种十分重要。

[0004] 在目前的马铃薯抗逆性品种培育领域，常常通过使用组成型启动子来超量表达逆境应答相关基因进而提高植物的抗逆性。尽管组成型启动子具有超量表达效应高的优势，但通常外源基因的组成型表达往往会造成资源的非必要浪费，同时大量异源蛋白的积累也会打破植物原有的代谢平衡，阻碍植物的正常生长。因此，能够驱动外源基因在特定环境中表达的诱导型启动子逐渐成为研究的重点。在马铃薯耐高温的分子机理研究中，需要高温诱导型启动子来上调目标基因的表达，进而分析目标基因在马铃薯响应高温胁迫中的功能，最大限度地减少目标基因对其他组织和器官的不良影响。目前，高温诱导型启动子已有相关报道。紫花苜蓿MsMBF1c启动子能显著受高温诱导激活，可以作为高温诱导型启动子用于科研与生产实践；魔芋AaHSFB1启动子含有热胁迫响应元件HSE及多种与植物发育及逆境应答相关的顺式作用元件，热胁迫处理后，AaHSFB1启动子的活性显著增强；大豆GmGolSP经高温处理后，其启动子的启动活性增强，使下游报告基因GUS的表达量增高，说明pGmGolSP为高温诱导型启动子。但总体来说，马铃薯中应用的高温诱导型启动子仍然较少。因此，分离、鉴定出更多的高温诱导型启动子并研究其对高温胁迫的表达响应，不仅有助于解析植物抵抗高温胁迫的分子机制，也能为植物抵抗高温胁迫的研究提供可应用的启动子参考序列，为创建耐高温新材料提供理论依据。

[0005] HSF(HEAT SHOCK FACTOR)转录因子作为植物热胁迫响应的关键组分之一，在植物响应高温胁迫中发挥重要作用。植物HSFs根据DNA结合结构域与寡聚化结构域之间氨基酸残基的长度及疏水的重复序列A和B之间插入的氨基酸残基数，可分为A、B、C三大类，其中，HSFA1、HSFA2和HSFA3作为A类成员发挥着关键作用。在拟南芥中的研究表明，热胁迫下HSFA1可以激活包括许多热休克蛋白在内的一系列靶基因；此外，HSFA2可以被HSFA1蛋白诱导并特异性地在热胁迫记忆中起作用。发明人通过研究还发现，马铃薯StHSFA2基因受高温显著诱导，在马铃薯响应高温胁迫方面有重要作用。而在基因表达的过程中，启动子是决定基因是否被转录以及转录效率如何的关键因素之一。因此，对StHSFA2启动子进行克隆和功能分析，对解析植株抵抗高温胁迫的分子机理和育种改良具有重要的理论意义和应用价值。

[0029] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。下述实施例仅用于阐明本发明，不应理解为对本发明的限制；下述实施例中的实验方法，如未特别说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂和仪器等，如未特别说明，均为市售产品；下述实施例中，如未特别说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。在不背离本发明精神和实质的情况下，本领域技术人员对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0030] 本发明实施例中使用的主要菌株为大肠杆菌Trelief TM 5α、农杆菌株GV3101，使用的表达载体为pRC18(卡那抗性)，载体来自于薯类生物学与遗传育种重庆市重点实验室。由生工生物工程股份有限公司完成引物合成、测序。

[0031] 实施例1：马铃薯高温诱导型启动子pStHSFA2的获得

[0032] 1)马铃薯DM总基因组DNA的提取

[0033] 取约0.1g左右的马铃薯幼嫩叶片置于带有2颗钢珠的2mL无菌离心管内；于液氮中速冻约5min，经研磨仪40Hz 20s快速研磨成粉末；加入600μL经65℃预热的2×CTAB提取液(按照500:1体积比混合提取液和还原剂)；将离心管置于65℃水浴0.5h，每隔10min左右轻轻晃动离心管；取出样品室温冷却待用，加入500μL氯仿‑异戊醇混合液(24:1)，剧烈震荡混匀，12000rmp离心10min，取上清至新的离心管中；在上清中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于‑20℃沉淀30min以上，12000rmp，离心10min，弃上清；沉淀用75％乙醇洗涤1次，12000rmp离心5min，弃上清；沉淀自然干燥后溶于50μL去离子水；置于‑20℃保存。

[0034] 2)马铃薯高温诱导型启动子pStHSFA2的克隆及表达载体的构建

[0035] 从http://spuddb.uga.edu/index.shtml获取StHSFA2转录起始位点上游2Kb的启动子参考序列，进一步使用snap gene软件设计克隆pStHSFA2所需引物(正向引物和反向引物序列分别为GCCAGTGCCAAGCTTATGAGCAAAAGTATTTAATTATG,SEQ ID No.2和TCCGGTACCTCTAGATGCTTGTTCAGTTTGCTAATTAG,SEQ ID No.3，其中正向引物中，序列GCCAGTGCC为载体pRC18融合位点的上游序列，序列AAGCTT为HindIII酶切位点；反向引物中，序列TCCGGTACC为载体pRC18融合位点的下游序列，序列TCTAGA为XbaI酶切位点)，以上述所获马铃薯DM基因组DNA为模板，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的高保真聚合酶2×KeyPo Master Mix(Dye Plus)进行PCR扩增。

[0036] a)PCR反应体系(50μL)：

[0037]

[0038] b)PCR反应程序：

[0039]

[0040] 待扩增完成后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带(图2)。使用TIANGEN公司通用型DNA纯化回收试剂盒对序列长度约2000bp的目的片段进行纯化回收。

[0041] 用HindIII和XbaI双酶切pRC18载体，胶回收获得酶切后的线性载体。

[0042] c)酶切反应体系：

[0043]

[0044]

[0045] 使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit将上述纯化的PCR目的片段与酶切线性载体进行重组。

[0046] d)同源重组反应体系：

[0047]

[0048] 接下来使用TreliefTM 5α大肠杆菌感受态细胞进行大肠杆菌转化实验，挑取单克隆进行菌落PCR阳性克隆检测，筛选得到的阳性克隆进行测序验证，将测序正确的载体命名为pStHSFA2‑GUS(图1)，进一步使用北京庄盟国际生物基因科技有限公司质粒小量提取试剂盒Plasmid Miniprep Kit(ZP101)提取质粒。

[0049] 实施例2：将重组表达载体pStHSFA2‑GUS转化拟南芥

[0050] 1)将重组表达载体pStHSFA2‑GUS转化农杆菌

[0051] 使用农杆菌感受态细胞GV3101进行农杆菌转化实验，具体步骤如下：GV3101感受态细胞迅速插入冰中，融化后，加入1μg质粒；冰浴5min，液氮冷激5min，37℃金属浴热激5min，冰浴5min；在超净台中向离心管中加入200μL不含抗生素的YEB培养基，吹打混匀后，
28℃，200rpm复苏2‑3h；吸取200μL菌液涂于含有利福平(25μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的YEB固体培养基，28℃恒温培养箱倒置培养2d后，筛选阳性克隆。

[0052] 2)农杆菌介导的拟南芥遗传转化

[0053] 采用花序浸染法转化野生型拟南芥，具体为：将含有pStHSFA2‑GUS质粒的农杆菌菌液在YEB液体培养基中进行活化，28℃，200‑220rpm过夜培养；取上述菌液于50mL含有相应抗生素的YEB液体培养基中至OD600＝0.1，28℃，200‑220rpm培养至OD600＝0.7左右；5000rpm，6min离心收集菌体，弃上清液后用浸染液(含5g/100mL蔗糖和50μL/100mL Silwet L‑77)按比例重悬农杆菌；将修剪过的野生型拟南芥花序完全浸于上述农杆菌悬浮液中10‑
20s，侵染完成后避光培养2d，转入正常光照继续培养直至收种。

[0054] 实施例3：pStHSFA2‑GUS转基因拟南芥的筛选及鉴定

[0055] 取实施例2中获得的经低温干燥保存的转基因种子，于无菌环境下，将适量种子置于无菌1.5mL离心管中，加入适量体积的75％酒精消毒8min，倒掉酒精，用无菌水洗3遍。将消毒后的种子均匀的点播到含潮霉素(25μg/mL)的1/2MS培养基上，并置于4℃黑暗春化2d，然后于温度22℃、湿度60％、光照和黑暗交替(光照时间16h、黑暗时间8h)条件下培养10‑15d，此时可见深绿色、下胚轴伸长、真叶生长正常的抗性幼苗，而黄色或白色幼苗为无抗性野生型幼苗。将筛选到的抗性幼苗移栽至营养基质(蛭石：营养土＝1：2，V/V)中继续培养。
取筛选的T1代阳性转基因植株幼嫩组织，提取基因组DNA进行PCR检测，检测所用的正向引物序列和反向引物分别为TGTAACTTGAAAGTCATCGC,SEQ ID No.4和CGCGATCCAGACTGAATG,SEQ ID No.5，结果为阳性转基因植株中均含有目的条带，经重复筛选获得T2代植株和种子，将T2代种子继续筛选，最终获得T3代纯合植株用于后续实验。

[0056] 实施例4：pStHSFA2高温诱导活性的鉴定

[0057] 1)高温胁迫处理

[0058] 为了验证pStHSFA2对高温胁迫的响应，从获得的阳性植株中挑选出2个株系pStHSFA2‑GUS#1和pStHSFA2‑GUS#5进行高温胁迫诱导活性分析。采用实施例3中的拟南芥消毒方法将消毒好的T3代纯合转基因拟南芥以及野生型拟南芥种子分别播种到1/2MS培养基上，4℃黑暗春化2d后，正常培养10d。然后将处理组在38℃高温下处理3h，对照组一直置于22℃培养箱中生长。

[0059] 2)GUS组织化学染色分析

[0060] 将处理组和对照组的拟南芥幼苗浸泡于底物X‑Gluc染色反应液中，抽真空5min后于37℃黑暗孵育12h，去除染液，再用75％的乙醇脱色2‑3次，在体视镜下观察拍照，结果如图所示，在正常和高温诱导条件下，野生型拟南芥均不能被染色(无GUS基因表达)，在正常条件下，pStHSFA2‑GUS转基因拟南芥只有茎尖部分有少量着色，其余组织部位并未染色，在38℃高温下处理3h后，pStHSFA2‑GUS转基因拟南芥呈现深蓝色，说明启动子pStHSFA2显著受高温诱导(图3)。

[0061] 3)GUS基因表达水平分析

[0062] 使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司植物总RNA提取试剂盒FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit RC411‑01对上述处理组和对照组的拟南芥幼苗RNA进行提取，随后使用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的反转录试剂盒 Ⅲ1St Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)进行反转录。以上述反转录合成的cDNA为模板，对GUS基因进行特异的PCR扩增，正向引物序列和反向引物分别为CGGTCAGTGGCAGTGAAGGG,SEQ ID No.6和CGAGGTACGGTACGGTAGGAGTTGG,SEQ ID ‑ΔΔCT
No.7。每个样品设置三个重复，统计样品的Ct值，利用2 公式对数据进行计算并分析目的基因相对表达量。结果显示在高温胁迫下，启动子pStHSFA2调控的GUS基因表达水平显著上调，说明启动子pStHSFA2显著受高温诱导(图4)。

[0063] 4)GUS酶活性定量分析

[0064] 将待测样品用液氮在预冷的研钵中研磨成粉状，精确称取其重量；每100mg粉末加入1mL提取液，涡旋振荡使其充分混匀；12,000×g,4℃离心10min，吸取上清至新的离心管中，置于冰上待用；根据Bradford蛋白测定法确定各上清的蛋白浓度；并取150μL上清，加入150μL预热的4‑MUG底物液混匀，37℃温浴反应；分别在10min和20min时，取100μL反应液加入900μL反应终止液；利用荧光酶标仪，在激发波长365nm、发射波长456nm条件下测定荧光强度，通过4‑MU标准曲线获得各样本反应产生4‑MU的浓度，折算出GUS酶活性；每个样品3次重复。结果显示38℃高温处理3h后，GUS活性显著提高，表明pStHSFA2的活性受高温胁迫处理显著诱导(图5)。

[0065] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。