[0001] 本发明涉及植物基因工程技术和马铃薯育种技术领域，具体涉及钙周期素结合蛋白基因StCacyBP/SIP增强马铃薯抗旱性的用途及应用。

[0002] 干旱胁迫是目前危害植物生长最大且最普遍的非生物胁迫。植物受到干旱胁迫时叶片失水萎蔫，光合作用速率减小，影响细胞内的正常合成和代谢过程，导致生长发育迟缓，进而导致产量下降。长期过程中，植物已经进化出一套复杂的生理机制来应对干旱胁迫，其中，涉及到多种编码受体蛋白、功能蛋白、转录因子以及一些激酶和磷酸化酶的基因。近年来，在植物体内已经报道发现多种转录因子参与干旱胁迫，包括MYB、WRKY、NAC、MYC、DREB和bZIP等。月季RcMYB8能够激活脯氨酸合酶基因RcP5CS1的表达，通过RcMYB8‑RcP5CS1调控模块影响脯氨酸的积累，清除ROS，以增强对干旱胁迫的耐性。大豆GmWRKY17能激活GmDREB1D和GmABA2提高植株的耐旱性。水稻OsNAC120能通过调节GA和ABA信号来平衡植株的生长和抗旱能力。番茄SlMYC2调控ABA合成信号通路基因NCED1、PP2C1和细胞分裂素信号转导基因RR26，从而调控气孔的关闭，影响植株的抗旱性。干旱响应元件DREB转录因子StDREB1可以通过增加P5CS‑RNA(δ(1)‑吡啶‑5‑羧酸合成酶)表达和脯氨酸渗透保护剂的积累以及激活编码钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)的基因，参与调控马铃薯抗旱。除转录因子外，众多功能蛋白基因也参与调控干旱胁迫，如抗氧化酶和渗透调节物质的合成酶、水通道蛋白和LEA蛋白等多种保护蛋白。钙周期素结合蛋白(Calcyclin binding protein,CacyBP/SIP)作为一种磷酸酶，在人与动物多个器官组织均有表达。近年来，通过对CacyBP/SIP的研究，部分结合配体已经被报道，包括钙结合蛋白S100家族蛋白，E3泛素连接酶的组分Siah‑1和Skp1，微管蛋白，肌动蛋白和原肌球蛋白以及细胞外调节蛋白激酶ERK1/2，参与细胞衰老、细胞增殖、细胞分化、信号转导等生物学过程。CacyBP/SIP不仅存在于动物中，也存在于植物体内。但是目前很多研究都集中在动物上，在植物中的报道很少。2006年，Kim等人从拟南芥中克隆出一种CacyBP/SIP蛋白并命名为AtSIP(At1g30070)，蛋白长度为222aa，通过与人类CacyBP/SIP氨基酸序列进行比对的相似性为32％，为人类CacyBP/SIP的同源蛋白。亚细胞定位显示AtSIP蛋白定位在细胞质或细胞核。设计过表达和敲除株系发现在正常条件下的表型未出现明显的改变，且在光响应或信号转导中没有作用。但是实验发现AtSIP能够提高植株对Pseudomonas syringae病原体抗性。苹果中的MdFPK2被证明能够与CacyBP/SIP蛋白互作，并通过由26S蛋白酶体介导的泛素化途径促进MdFPK2降解调控苹果糖稳态。然而，CacyBP/SIP在胁迫响应特别是干旱胁迫方面的功能目前还未有报道，因此，解析马铃薯StCacyBP/SIP基因的功能对揭示马铃薯耐旱分子机制具有重要意义。

[0024] 下面将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。需要说明的是，本发明实施例中未注明实验材料来源的实验材料均能商业获得，本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验方法或按照实验材料厂商建议方法进行。另外，需要说明的是本发明中所述的马铃薯E3为鄂马铃薯3号。

[0025] 实施例1

[0026] 一、StCacyBP/SIP的序列特征分析

[0027] 从干旱处理转录组数据中筛选到马铃薯钙周期素结合蛋白基因StCacyBP/SIP。马铃薯StCacyBP/SIP基因序列号为PGSC0003DMG400012093，位于马铃薯基因组第8号染色体上，该基因的CDS和gDNA序列分别长660bp和3764bp，含有5个外显子和4个内含子，编码蛋白长度为219aa。与拟南芥、番茄、大豆、油菜、水稻和玉米等物种的系统进化分析，结果表明StCacyBP/SIP同番茄和大豆中同源蛋白的亲缘关系最近。氨基酸序列比对分析结果表明，StCacyBP/SIP蛋白序列在其N端含有一个Siah‑Interact_N保守结构域、中心位置含有一个CS结构域以及C端含有一个SGS结构域(图1)。

[0028] 二、StCacyBP/SIP的表达模式分析

[0029] 通过不同组织表达分析，StCacyBP/SIP在匍匐茎形成弯钩时期表达量最高，在根、源叶、匍匐茎膨大时期和块茎中表达量较高，其它组织中表达量较少(图2A)。通过对栽培品种“E3”苗期干旱处理，对处理前后的叶片取样进行RT‑qPCR检测，结果显示，在干旱处理20d后StCacyBP/SIP基因的表达显著被诱导(图2B)。使用20％PEG6000对生长14d的“E3”组培苗进行处理，对处理前后的叶片取样进行RT‑qPCR检测，结果显示StCacyBP/SIP基因的表达水平随着处理时间延长不断升高，并且在24h显著被诱导，表明StCacyBP/SIP能够参与马铃薯的干旱胁迫响应(图2C)。为了进一步探究StCacyBP/SIP是否能够通过ABA信号途径参与马铃薯干旱胁迫响应，使用20μM ABA对“E3”马铃薯进行处理，对处理前后的叶片取样进行RT‑qPCR检测，结果显示随着ABA处理时间延长，StCacyBP/SIP的转录水平不断升高，于24h出现显著差异(图2D)。以上结果表明StCacyBP/SIP基因可能通过ABA信号途径参与马铃薯干旱胁迫响应。

[0030] 为了探究StCacyBP/SIP蛋白在细胞中的定位，利用带有绿色荧光标记(eGFP)的pCAMBIA1300‑StCacyBP/SIP‑eGFP载体转入农杆菌后侵染烟草进行瞬时表达，结果显示StCacyBP/SIP定位于细胞核(图3)。

[0031] 三、StCacyBP/SIP转基因株系筛选与鉴定

[0032] 通过构建超量和干涉载体，采用农杆菌侵染法转化“E3”马铃薯。经过抗性筛选和PCR鉴定后共获得4个阳性超量株系和7个阳性干涉株系(图4A和C)。采用RT‑qPCR对其转化效率进行鉴定，结果显示4个阳性超量株系均表达上调，其中StCacyBP/SIP‑OE‑7株系上调最高，是WT的110倍(图4B)；6个阳性干涉株系均表达下调，最高可达93％左右(图4D)。

[0033] 四、表型鉴定

[0034] (1)StCacyBP/SIP增强马铃薯幼苗抗旱性

[0035] 为了研究该基因对马铃薯幼苗响应干旱的影响，对其超量和干涉转基因株系进行移栽，干旱处理20d后，超量转基因植株的萎蔫程度显著低于WT和干涉转基因植株，且干涉转基因植株的萎蔫程度显著高于WT。复水后，超量转基因植株能够恢复程度显著高于WT和干涉转基因植株，且干涉转基因植株未能恢复。综上所述，StCacyBP/SIP提高了马铃薯幼苗的抗旱性(图5)。

[0036] (2)StCacyBP/SIP通过响应ABA调节气孔开闭增强抗旱性

[0037] 对其气孔孔径和气孔面积进行观察和统计，结果显示，使用ABA和甘露醇处理后，超量转基因株系的气孔孔径和气孔面积显著小于WT和干涉转基因株系，且干涉转基因株系的气孔孔径和气孔面积显著高于WT(图6)。通过测量其光合参数，结果显示在干旱处理后，超量株系的净光合速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度和蒸腾速率的下降程度大于WT和干涉株系(图7)。以上结果表明，超量株系可能通过响应ABA促进气孔关闭，降低水分损失，进而表现出一定的抗旱性。

[0038] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。