技术领域 本发明是有关于启动子及其应用。 背景技术 在亚洲国家，红曲霉(Monascus)长期被用作为食品添加物。 经红曲霉发酵的谷物呈现鲜红至紫色，且保有稻米原来形状。此 外，红曲霉发酵产物也被认为具有促进健康的功效。将红曲霉应 用于米酒制造是由于其具有高量的α-淀粉酶，可促使淀粉转化成 葡萄糖。目前研究已确认红曲霉发酵产物如Monacolin K等的医 疗效果。且红曲霉发酵产物所具有的保存效果也经实验证明。 本领域的主要研究焦点为红曲霉的基因产物或培养、生产的 方法，然而，对于红曲霉序列标签(EST)基因库的研究正方兴未艾， 红曲霉的序列标签可能提供重组DNA技术更多的信息。 发明内容 本发明人等对于由财团法人食品工业发展研究所所收集的红 曲霉Monascus BCRC 38072的EST基因库进行搜寻研究，发现 两个高表达量的基因，经比对为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因 (phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF基因) 以及热休克蛋白基因(heat shock protein gene，简称Hsp基因)， 并检测与确认此二基因上游区域的启动子区域。由此而完成本发 明。 (I)acuF启动子 因此，本发明的一型态为一种分离的DNA分子，其包括序列 识别号：1的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号：1的 核苷酸序列杂交的序列。上述DNA分子具有启动子活性。上述具 有启动子活性的DNA分子亦可包括序列识别号：1中第117至 1116个连续核苷酸序列，或序列识别号：1中约第117至约1116 个连续核苷酸序列，较佳地为序列识别号：1中第367至1116个 连续核苷酸序列，或序列识别号：1中约第367至约1116个连续 核苷酸序列，更佳地为序列识别号：1中第517至1116个连续核 苷酸序列，或序列识别号：1中约第517至约1116个连续核苷酸 序列；或于严苛条件下可与上述序列杂交的核苷酸序列。此外， 上述DNA分子可由细菌或真菌取得，特别是由红曲霉属 (Monascus sp.)，更特别是由红曲霉属Monascus pilosus， Monascus ruber，或Monascus purpureus。上述DNA分子可 经基因工程方式， 由财团法人食品工业发展研究所所收集的 BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF)的起始子上游序列克隆而得。 上述基因工程包含基因库建构、菌落杂交(colony hybridization)、 引物步行(primer walking)、或聚合酶链式反应(PCR)。此外，熟 悉此技艺人士亦可依据本发明所揭示的DNA序列，经由已知的 PCR、杂交反应、或人工合成等获得本发明所述序列。上述严苛 杂交条件可参考欧洲专利EP 1325959 A1 P7[0036]节。 本发明亦提供一种重组DNA，其包括一启动子区域与一编码 区域。上述启动子区域包括序列识别号：1的核苷酸序列或在严苛 条件下可与该序列识别号：1的核苷酸序列杂交的序列。特别是， 上述启动子区域可包括序列识别号：1中第117至1116个连续核 苷酸序列，或序列识别号：1中约第117至约1116个连续核苷酸 序列，较佳地为序列识别号：1中第367至1116个连续核苷酸序 列，或序列识别号：1中约第367至约1116个连续核苷酸序列， 更佳地为序列识别号：1中第517至1116个连续核苷酸序列，序 列识别号：1中约第517至约1116个连续核苷酸序列；或于严苛 条件下可与上述序列杂交的核苷酸序列。且上述启动子区域可由 红曲霉属(Monascus sp.)取得，特别是由红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，并且可经 基因工程方式，由财团法人食品工业发展研究所所收集的BCRC 38072中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF)的起始子上游序列克隆而得。 而上述编码区域包括编码一所需蛋白质的核苷酸序列。所需蛋白 质包括酶，如蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或 脂酶(lipase)；转录因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶； 或荷尔蒙，如胰岛素或生长因子。 本发明的另一型态是提供一种表达载体，其包括一启动子， 上述启动子包括序列识别号：1的核苷酸序列或在严苛条件下可与 该序列识别号：1的核苷酸序列杂交的序列。上述启动子是如以上 重组DNA的启动子区域所定义。用于建构本发明载体的工具是指 在适当的宿主细胞中可自行复制或可整合入宿主细胞的染色体的 分子序列，例如质粒，噬菌体，或病毒。上述表达载体可任择地 包括编码所需蛋白质的核苷酸序列。上述所需蛋白质包括酶，如 蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)； 转录因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷尔蒙，如胰 岛素或生长因子。 本发明的另一型态是有关于一种表达系统，包括上述定义的 表达载体，以及一适于表达所需蛋白质的宿主细胞。上述载体是 经由一转化方法被转化入上述宿主细胞。上述宿主细胞意指任何 可用于表达所需蛋白质的细胞。适当的宿主细胞包括细菌、酵母 菌、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、或丝状真菌。上述丝状真 菌可为红曲霉属(Monascus sp.)，特别是红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，更特别是 BCRC38072。转化方法可采用目前已知的宿主-载体系统，对于 属于曲菌属(Aspergillus)的丝状真菌施予一转化步骤。可参考欧 洲专利EP 1325959 A1 P5[0022]节所述的方法。 本发明亦有关于一种转化株，包括a)序列识别号：1，或b) 序列识别号：1的第117至第1116个连续核苷酸，或序列识别号： 1的约第117至约第1116个连续核苷酸，或c)序列识别号：1的 第367至第1116个连续核苷酸，或序列识别号：1的约第367至 约第1116个连续核苷酸，或d)序列识别号：1的第517至第1116 个连续核苷酸的核苷酸序列，或序列识别号：1的约第517至约 第1116个连续核苷酸的核苷酸序列，或在严苛条件下可与上述任 一序列杂交的核苷酸序列。上述转化株更包括一编码所需蛋白质 的核苷酸序列。 本发明亦有关于一种表达一蛋白质的方法。上述方法包括于 一培养基培养上述含有编码所欲蛋白质的转化株，由转化株所在 的培养基生产与累积所需蛋白质，以及由培养基收集所需蛋白质。 因此，本发明的一型态是提供一种分离的DNA分子，其包括 序列识别号：18的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号： 18的核苷酸序列杂交的序列。上述DNA分子具有启动子活性。 本发明亦提供一种重组DNA，其包括一启动子区域与一编码 区域。上述启动子区域包括序列识别号：18的核苷酸序列或在严 苛条件下可与该核苷酸序列杂交的序列，而上述编码区域包括编 码一所需蛋白质的核苷酸序列。 本发明的另一型态是提供一种表达载体，其包括一启动子。 上述启动子包括序列识别号：18的核苷酸序列或在严苛条件下可 与该核苷酸序列杂交的序列。 本发明的又一型态提供一种分离的DNA分子，其包括序列识 别号：24的核苷酸序列或在严苛条件下可与该核苷酸序列杂交的 序列。上述DNA分子具有启动子活性。 (II)Hsp启动子 本发明的一型态提供一种分离的DNA分子，其包括序列识别 号：2的核苷酸序列或在严苛条件下可与该序列识别号：2的核苷 酸序列杂交的序列。上述DNA分子具有启动子活性。上述具有启 动子活性的DNA分子亦可包括序列识别号：2中第443至1478 个连续核苷酸序列，或序列识别号：2中约第443至约1478个连 续核苷酸序列，较佳地为序列识别号：2中第759至1478个连续 核苷酸序列，或序列识别号：2中约第759至约1478个连续核苷 酸序列，更佳地为序列识别号：2中第982至1478个连续核苷酸 序列，或序列识别号：2中约第982至约1478个连续核苷酸序列； 或于严苛条件下可与上述序列杂交的核苷酸序列。此外，上述DNA 分子可由细菌或真菌取得，特别是由红曲霉属(Monascus sp.)， 更特别是由红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或 Monascus purpureus。上述DNA分子可经基因工程方式，由财 团法人食品工业发展研究所所收集的BCRC 38072中热休克蛋白 (heat shock protein，简称Hsp)的起始子上游序列克隆而得。上 述基因工程包含基因库建构、菌落杂交(colony hybridization)、 引物步行(primer walking)、或聚合酶链式反应(PCR)。此外，熟 悉此技艺人士亦可依据本发明所揭示的DNA序列，经由已知的 PCR、杂交反应、或人工合成等获得本发明所请序列。上述严苛 杂交条件可参考欧洲专利EP 1325959 A1 P7[0036]节。 本发明亦提供一种重组DNA，其包括一启动子区域与一编码 区域。上述启动子区域包括序列识别号：2的核苷酸序列或在严苛 条件下可与该序列识别号：2的核苷酸序列杂交的序列。特别是， 上述启动子区域可包括序列识别号：2中第443至1478个连续核 苷酸序列，或序列识别号：2中约第443至约1478个连续核苷酸 序列，较佳地为序列识别号：2中第759至1478个连续核苷酸序 列，或序列识别号：2中约第759至约1478个连续核苷酸序列， 更佳地为序列识别号：2中第982至1478个连续核苷酸序列，或 序列识别号：2中约第982至约1478个连续核苷酸序列；或于严 苛条件下可与上述序列杂交的核苷酸序列。且上述启动子区域可 由细菌或真菌取得，例如由红曲霉属(Monascus sp.)取得，特别 是由红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或 Monascus purpureus，并且可经基因工程方式，由财团法人食品 工业发展研究所所收集的BCRC 38072中热休克蛋白(heat shock protein，简称Hsp)的起始子上游序列克隆而得。而上述编码区域 包括编码一所需蛋白质的核苷酸序列。所需蛋白质包括酶，如蛋 白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)；转 录因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷尔蒙，如胰岛 素或生长因子。 本发明的另一型态是提供一种表达载体，其包括一启动子， 上述启动子包括序列识别号：2的核苷酸序列或在严苛条件下可与 该序列识别号：2的核苷酸序列杂交的序列。上述启动子是如以上 重组DNA的启动子区域所定义。用于建构本发明载体的工具是指 在适当的宿主细胞中可自行复制或可整合入宿主细胞的染色体的 分子序列，例如质粒，噬菌体，或病毒。上述表达载体可任择地 包括编码所需蛋白质的核苷酸序列。上述所需蛋白质包括酶，如 蛋白酶，聚乙酰合成酶(polyketide synthase)，或脂酶(lipase)； 转录因子，如活化子(activator)或RNA聚合酶；或荷尔蒙，如胰 岛素或生长因子。 本发明的另一型态是有关于一种表达系统，包括上述定义的 表达载体，以及一适于表达所需蛋白质的宿主细胞。上述载体是 经由一转化方法被转化入上述宿主细胞。上述宿主细胞意指任何 可用于表达所需蛋白质的细胞。适当的宿主细胞包括细菌、酵母 菌、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、或丝状真菌。上述丝状真 菌可为红曲霉属(Monascus sp.)，特别是红曲霉属Monascus pilosus，Monascus rubber，或Monascus purpureus，更特别是 BCRC38072。转化方法可采用目前已知的宿主-载体系统，对于 属于曲菌属(Aspergillus)的丝状真菌施予一转化步骤。可参考欧 洲专利EP 1325959 A1 P5[0022]节所述的方法。 本发明亦有关于一种转化株，包括a)序列识别号：2，或b) 序列识别号：2的第443至第1478个连续核苷酸，或序列识别号： 2的约第443至约第1478个连续核苷酸，或c)序列识别号：2的 第759至第1478个连续核苷酸，或序列识别号：2的约第759 至约第1478个连续核苷酸，或d)序列识别号：2的第982至第 1478个连续核苷酸的核苷酸序列，或序列识别号：2的约第982 至约第1478个连续核苷酸的核苷酸序列，或在严苛条件下可与上 述任一序列杂交的核苷酸序列。上述转化株更包括一编码所需蛋 白质的核苷酸序列。 本发明亦有关于一种表达一蛋白质的方法。上述方法包括于 一培养基培养上述含有编码所欲蛋白质的转化株，由转化株所在 的培养基生产与累积所需蛋白质，以及由培养基收集所需蛋白质。 本发明亦提供一种重组DNA，其包括一启动子区域与一编码 区域。上述启动子区域包括序列识别号：24的核苷酸序列或在严 苛条件下可与该序列识别号：24的核苷酸序列杂交的序列，而上 述编码区域包括编码一所需蛋白质的核苷酸序列。 此外，本发明亦提供一种表达载体，其包括一启动子。上述 启动子包括序列识别号：24的核苷酸序列或在严苛条件下可与该 核苷酸序列杂交的序列。 含有本发明启动子序列的表达载体的实施例可经由PCR方式 增殖本发明的启动子序列，并于其下游接上具有标示功能的基因 而得。所得表达载体可建构为筛选细胞转化的标志(marker)，例 如，用于评估基因克隆的效率。此外，本发明的载体亦可作为红 曲酶基因敲除(knockout)的工具，进行菌种改良，产生更安全及 更具产业利用性的红曲霉种。 本发明的启动子序列尚可在其下游接上具有标示功能的基因 及欲侦测的目标蛋白质基因，用于活体内(in vivo)或原位(in situ) 侦测蛋白质间的交互作用及目标蛋白质的作用位置。 本发明的表达系统，转化株及表达蛋白质方法的应用，可通 过在启动子序列下游接上要表达的酶基因，采用本发明的表达系 统，可缩短酶生产时间，亦可大为增加产量。例如，增加红曲霉 蛋白酶的产量，可增进红曲霉以大豆粉作为培养基质的效率，降 低生产成本，另增加红曲霉淀粉酶的产量，则可以增进红曲在酿 酒时的糖化力，藉以改变制酒的制程及产生新风味。 本发明的表达系统，转化株及表达蛋白质的方法的应用，亦 可以在启动子的下游接上二次代谢产物基因，此表达系统可提前 二次代谢产物的生产时间，增加产量，而大量减低生产成本。 此外，本发明的表达载体亦可以在启动子下游接上转录活化 子(transcriptional activator)基因，通过大量表达此活化子，同 时也活化其所调控的基因，而大为增加产量。 附图说明 图1显示本发明实施例中的acuF启动子区域的克隆流程。 图2显示本发明实施例中的acuF启动子区域的重组载体。本 发明的acuF启动子区域经转化进入载体pHygEGFP后形成重组 载体pMS-acuF。 图3A与3B显示pMS-acuF转化后的绿色荧光蛋白表达情 形。图3A为明视野下；图3B为荧光滤镜下。 图4显示本发明实施例中的Hsp启动子区域的克隆流程。 图5显示本发明实施例中的Hsp启动子区域的重组载体。本 发明的Hsp启动子区域经转化进入载体pHygEGFP后形成重组 载体pMS-hsp。 图6A与6B显示pMS-hsp转行后的绿色荧光蛋白表达情形。 图6A为明视野；图6B为荧光滤镜之下。 图7显示PCR产物的电泳图。第1栏为1kb标记 (Bio-1kbTM DNA ladder)；第2-5栏为编号1-4的转化株；第6 栏为BCRC 38072野生型，(-)对照组；以及第7栏为pHygEGFP， (+)对照组。 大肠杆菌EP1300：pMPF 001、大肠杆菌EP1300：pMPF 002 、大肠杆菌DH5α：pMS-acuF、大肠杆菌DH5α：pMS-Hsp已 于公元2003年12月5日被寄存于美国典型培养物保藏中心(ATCC， P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110-2209，USA)，寄存编号分 别为PTA-5685、PTA-5686、PTA-5687、PTA-5688。 具体实施方式 由财团法人食品工业发展研究所所收集的红曲霉BCRC 38072的EST基因库中搜寻得到高表达量的基因，经比对为磷酸 烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF基因)以及热休克蛋白基因(heat shock protein gene，简称Hsp基因)，推测此二基因的上游应分别由一强大的启 动子所调控，其可用于大量表达蛋白质。 将红曲霉BCRC 38072依照Hawksworth & Pitt(1983)的分 类系统进行观察及鉴定，其型态特征如下： 宏观特征： CYA，25℃，7天。菌落直径25-26mm，菌丝体开始为白 色，渐渐变成淡红橘色，复转为深红橘色。 MEA，25℃，7天。菌落直径48mm，亮红橘色，复转为鲜 红橘色。 G25N，25℃，7天。菌落直径28-29mm，深红橘色，中央 为深黄橘色。 微观特征： 分生粉孢子(aleuriocondia)通常为单生或成短链，为倒梨状 (obpyriform)至球状(globose)，大小为10-13×8-10μm。其有性 世代闭囊壳(Cleistothecia)为球状(globose)，直径37-72μm。子 囊孢子(ascospore)为透明，椭圆形，大小为 4.6-6.3(-6.6)×3.3-4.2μm。 根据以上观察，BCRC 38072的特征分析如下： 形态特征：BCRC 38072介于M.pilosus与M.ruber之间。 1.依据菌落颜色与生长速度以及分生粉孢子的着生方式， BCRC 38072与M.pilosus较接近。 2.依据子囊孢子形态大小，BCRC 38072与M.ruber较接 近。 序列分析：BCRC 38072、M.pilosus与M.ruber的rDNA ITS片段及β-微管蛋白(6-tubulin)基因部分序列100％相同。 综合形态特征与序列分析：B CRC 380 72的学名暂定为 Monascus pilosus K.Sato ex D Hawksw.& Pitt。 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF)是在动物淀粉新生 (gluconeogenesis)中重要的淀粉，此酶在细胞中能持续且强烈的 表达。 在动物淀粉新生的过程中，丙酮酸(pyruvate)经由丙酮酸羧基 酶(pyruvate carboxylase)生成草酰乙酸(oxaloacetate)，再通过 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 生成磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)。其反应如下所示。 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 草酰乙酸+GTP―――――――――――→磷酸烯醇丙酮酸+GDP+CO2 丙酮酸+ATP+GTP+H2O―――――――→磷酸烯醇丙酮酸+ADP+GDP+Pi+CO2 热休克蛋白(heat shock protein，简称Hsp)是一类高度保守 的蛋白质，属于一蛋白质家族(protein family)，广泛存在于原核 生物与真核生物中，依其分子量分为四大类：Hsp 90 (83-90KDa)，Hsp 70(66-78 KDa)，Hsp 60，以及小Hsp家族。 在生物体受到环境刺激时，此类蛋白质会大量表达。 将acuF与Hsp的启动子以BLAST方式比对目前公开数据库， 发现并无与本发明红曲霉的acuF与Hsp启动子序列相似的序列。 于是将acuF与Hsp启动子序列重组到一pHygEGFP载体上，其具 有HPH(潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin B phosphotransferase))与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，简称EGFP)的融合蛋白。通过观察荧光蛋 白的表达，证实上述两个启动子的确具有开启下游基因的活性。 以下将以实施例说明本发明。 实施例1：acuF启动子 1.材料 (1)宿主：红曲霉Monascus BCRC 38072、Monascus pilosus， BCRC 31527、Neurospora crassa BCRC 32685(财团法人食品 工业发展研究所)。 (2)感受态细胞：ECOSTM E.coli competent cells DH5α(益 生生技公司)。 (3)质粒：pHygEGFP(BD Biosciences)，pGEM-T Easy Vector(PROMEGA)。 (4)培养基： a.大肠杆菌的培养基：LB肉汁(USB)，琼脂(USB)。 b.红曲霉及粉红面包霉(Neurospora crassa)的培养基：PDA (DIFICO)，PDB(DIFICO)，Vogel氏培养基(参见*)，以及top agar。 (5)抗生素：青霉素(Ampicillin)，潮霉素(Hygromycin B) (SIGMA)。 *Vogel氏培养基 1.微量元素溶液：将5g柠檬酸·H2O、5g ZnSO4·7H2O、1g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O、250mg CuSO4·5H2O、50mg MnSO4·H2O、50mg H3BO3、50mg Na2MoO4·2H2O溶于95ml 的灭菌去离子水。最终总量：100ml。 2.生物素溶液：5mg生物素(Sigma)溶于199ml的5％乙醇。 3.50X Vogel氏盐浓缩液：150g柠檬酸钠·5H2O、250g KH2PO4、100g NH4NO3、10g MgSO4·7H2O、5g CaCl2·2H2O(事 先缓缓溶于20ml的水中)于750ml的灭菌去离子水，加入5ml 微量元素溶液以及5ml生物素溶液。最终总量：1升。过滤、灭 菌后，将溶液保存于室温。 4.修饰过的Vogel氏培养基：将1％葡萄糖溶于1X的Vogel 氏盐液。 2.流程 acuF启动子的制备流程是如图1所示。由财团法人食品工业 发展研究所所收集的红曲霉Monascus B CRC 38072的EST基因 库寻找到cDNA表达量最高的基因Contig ID：MPTC00008457， 经比对为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene，简称acuF)，推测该基因由一强大启动子 所调控。于是利用acuF基因5’端基因序列设计一段465bp的探 针，以PCR方式由红曲霉染色体放大该段探针。之后，将PCR 产物接到pGEM-T Easy Vector上，再以DIG(Digoxigenin)标 示制成探针。利用此探针对红曲BCRC 38072的原生质体数据库 (fosmid library)进行菌落杂交，找到含有acuF基因的原生质体， 编号为mpf01014A4。利用引物步行方式对编号为mpf01014A4 的原生质体进行定序，找出acuF基因前端的启动子序列。成功定 序出1116bp的预定启动子序列，并将之以BLAST进行比对，并 无比对相似序列。将此1116bp的acuF启动子序列以限制酶BglII 与KpnI切位接到载体pHygEGFP上，并命名为pMS-acuF(又 标记为pMS-a1)，如图2所示(右方的图谱)。将pMA-acuF转化 至红曲霉中，成功观察到荧光蛋白的表达，如图3A与3B所示。 图3A为明视野下，图3B为荧光滤镜下。此结果证明所推测的 acuF启动子序列具有启动子活性。详细步骤说明如下。 A.acuF的探针基因片段的取得 利用PCR克隆出BCRC 38072的acuF探针序列。 由红曲霉EST基因库设计引子如下： 正向引物：5`-TGTTAATAGGACCGCCCTGC-3`(序列识别 号：3) 反向引物：5`-AGTATGCGGTCAGAGCACC-3`(序列识别 号：4) 反应条件如下： 100μl的PCR反应中含有DNA模板20ng，正向引物 (10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM) 8μl，10×缓冲液10μl。 第一回合94℃7分钟，第二回合94℃1分钟，53℃30秒， 72℃30秒，30次循环，第三回合72℃15分钟，4℃保存。 反应结束后，以同样体积的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10 体积的3M醋酸钠溶液及两倍体积的100％酒精沉淀DNA。续以 70％酒精洗涤，经离心干燥后，溶于灭菌去离子水，保存于-20℃ 冰箱。 B.重组质粒TA-acuF 将PCR产物acuF探针片段纯化回收，将回收的DNA与 pGEM-T Easy Vector以浓度3∶1的比例混匀，加入1μl的T4 DNA接合与10×接合缓冲液，以灭菌去离子水调制总体积10μl， 于室温进行接合1小时。待接合完成后，取出5μl接合反应产物 加入100μl的ECOSTM E.coli competent cells DH5α，进行转化 作用，所得转化株已于93年12月7日寄存于财团法人食品工业 发展研究所，寄存编号BCRC 940474。筛选出3483bp的质粒， 并以PCR确认，得到重组质粒TA-acuF。 C.acuF启动子片段的取得 利用PCR克隆出原生质体mpf01014A4的acuF启动子序列。 所采用的引子与反应条件如下： 正向引物： 5`-GAAGATCTCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3` (序列识别号：6) 反向引物： 5`-ATGGTAC CTGTTTCTGAGTGAGGTC GAGTG-3`(序列 识别号：7) 100μl的PCR反应中含有DNA模板20ng，正向引物 (10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM) 8μl，10×缓冲液10μl。 第一回合94℃7分钟，第二回合94℃1分钟，59℃30秒， 72℃1分钟，30次循环，第三回合72℃15分钟，4℃保存。 反应结束后，以同样体积的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10 体积的3M醋酸钠溶液及两倍体积的100％酒精沉淀DNA。续以 70％酒精洗涤，经离心干燥后，溶于灭菌去离子水，保存于-20℃ 冰箱。 D.重组质粒pMS-acuF的制备 以限制酶BglII与KpnI分别和PCR产物acuF启动子片段 与克隆载体pHygEGFP进行剪切作用4小时，再以DNA电泳鉴 定分离，以QIAquickGEL EXTRACTION KIT回收DNA。将 回收的载体与acuF启动子片段以1∶3比列混匀，并以灭菌去离子 水调制总体积10μl。于16℃进行接合反应4小时。待接合反应 完成后，取出5μl加入100μl的ECOSTME.coli感受态细胞 DH5α，进行转化作用。经大肠杆菌质粒筛选出6.1kb的质粒，并 以PCR确认，即得到重组质粒pMS-acuF。 E.Monascus原生质体(protoplast)的制备 将Monascus孢子液接在PDA斜面培养基上，30℃静置培 养5-7天。用无菌水刮下孢子，以两层灭菌的miracloth滤膜过 滤孢子液，除去菌丝及琼脂块。于光学显微镜下，以血球计数盘 计算滤液中的孢子数。接种孢子107个/ml至50ml的修饰过的 Vogel氏培养基中，于30℃，200rpm震荡培养16-18小时。以 两层灭菌的miracloth滤膜过滤萌芽的红曲孢子，以无菌水清洗 后，接着以酶消化缓冲液润湿菌丝。 以10ml酶消化缓冲液洗下miracloth滤膜上的菌丝，加入5 ml酶混合液，置于震荡器上，于室温快速摇晃反应半小时，每隔 十分钟，于光学显微镜下观察细胞壁分解情形，直到约90％菌丝 均释出原生质体。用两层miracloth滤膜过滤，滤液于4℃， 1500rpm离心15分钟，收集原生质体。倒去上清液，以酶消化 缓冲液清洗沉淀物两次，再以STC清洗两次。加入1.5ml的STC、 20μl的DMSO、以及0.4ml的PTC，于显微镜下计算原生质体 数目，分装107个/管，并置于-80℃保存。 F.转化作用 采用STC清洗原生质体两次，于4℃、1500rpm离心15分 钟。倒去上清液，以50μl的STC回溶原生质体沉淀。加入1-10μg 的质粒DNA，于200Ohms，25μF，0.7KV的条件下进行电转。 加入1ml的再生缓冲液(regeneration buffer)，于30℃下静置 隔夜。加入10ml、50℃、含有30μg/ml的潮霉素(hygromycin B) 的top agar培养基，铺于含有30μg/ml的潮霉素的top agar培 养基上，于30℃静置培养，约3-5天可观察到转化株。 G.转化株的筛选与确认 (1)用尖头镊子挑取少许转化株上的菌丝与孢子置于载玻片 上，滴一滴无菌水后盖上盖玻片，于光学显微镜下观察。在观察 绿色荧光蛋白所使用的滤镜下(Ex.430-510nm；Em.475-575 nm)可观察到绿色荧光蛋白的表达。 (2)将转化株接到PDB(potato dextrose broth)培养基中，于 30℃，200rpm震荡培养5-10天。之后将菌体磨碎，抽取染色 体DNA，以HPH-EGFP专一性引子进行PCR，可得到1740bp 的产物。 H.确认具有启动子活性的最小片段 为更进一步确认acuF启动子片段(1116bp)中具有功能活性 的最小片段，利用PCR方式分别得到包含活性序列片段的 1000bp，750bp，600bp，及500bp的PCR产物。所采用的模板 为pMS-a1。获得上述PCR产物所使用的引子列示如下。 1000bp： 正向引物： acuF-B2 gaagatctTGTCGATGCAATCGGGCAATCC(序列 识别号：13) 反向引物： acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序 列识别号：14) 750bp： 正向引物： acuF-B3 gaagatctTGATGATTGGGATCGGACTCGG(序列 识别号：15) 反向引物： acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序 列识别号：14) 600bp： 正向引物： acuF-B4 gaagatctTGCGGATCCGAGGATAAAAC(序列识 别号：16) 反向引物： acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序 列识别号：14) 500bp： 正向引物： acuF-B5 gaagatctCCCGGTATTGTCCGAGGCTC(序列识 别号：17) 反向引物： acuF-KpnI atggtacctGTTTCTGAGTGAGGTCGAGTG(序 列识别号：14) 将1000bp，750bp，600bp，及500bp的acuF启动子序列 接到pMS载体，并命名为pMS-a2，pMS-a3，pMS-a4，及 pMS-a5。将载体转化至Monascus BCRC 38072，并以含有Hygr 30ug/ml的PDA培养基做筛选。结果如下所示。 Monascus BCRC 38072 启动子序列长度 Hyg 30ug/ml1 荧光2 pMS-a1 1116bp R + pMS-a2 1000bp R + pMS-a3 750bp R + pMS-a4 600bp R + pMS-a5 500bp N.R. N.D. 1：R：抗性；N.R.：无抗性。 2：+：阳性；-：阴性。 N.D.：未侦测。 具有功能活性的最小片段为600bp。且含有600bp片段的转 化株亦可侦测到荧光反应。 将这些质粒亦转化到Monascus pilosus BCRC 31527，以含 有Hygr 50ug/ml的PDA培养基进行筛选。结果如下表。 Monascus pilosus BCRC 31527 启动子序列长度 Hyg 50ug/ml1 荧光2 pMS-a3 750bp R + pMS-a4 600bp R + pMS-a5 500bp N.R. N.D. 1：R：抗性；N.R.：无抗性。 2：+：阳性；-：阴性。 N.D.：未侦测。 具有功能活性的最小片段亦为600bp。且含有600bp片段的 转化株亦可侦测到荧光反应。 将这些质粒亦转化到Neurospora crassa BCRC 32685，并 以含Hygr 50ug/ml的PDA培养基筛选之。结果如下表。 Neurospora crassa BCRC32685 启动子序列长度 Hyg 200ug/ml1 pMS-a3 750bp R pMS-a4 600bp R pMS-a5 500bp N.R 1：R：抗性；N.R.：无抗性。 N.D.：未侦测。 具有功能活性的最小片段亦为600bp。 由上述结果证明，acuF启动子序列中具有功能活性的最小片 段为600bp(序列识别号：18)，且其可表达于Monascus BCRC 38072，Monascus pilosus BCRC 31527，以及Neurospora crassa BCRC 32685。 实施例2：Hsp启动子 1.材料： (1)宿主：红曲霉Monascus BCRC 38072，Monascus pilosus BCRC 31527，以及Neurospora crassa BCRC 32685(财团法人 食品工业发展研究所)。 (2)感受态细胞：ECOSTM E.coli competent cells DH5α(益 生生技公司)。 (3)质粒：pHygEGFP(BD Biosciences)，pGEM-T Easy Vector(PROMEGA)。 (4)培养基： a.大肠杆菌的培养基：LB肉汁(USB)，琼脂(USB)。 b.红曲霉及粉红面包霉(Neurospora crassa)的培养基：PDA (DIFICO)，PDB(DIFICO)，Vogel氏培养基(参见*)，以及top agar。 (5)抗生素：青霉素(Ampicillin)，潮霉素(Hygromycin B) (SIGMA)。 *Vogel氏培养基 ①.微量元素溶液：将5g柠檬酸·H2O、5g ZnSO4·7H2O、1 g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O、250mg CuSO4·5H2O、50mg MnSO4·H2O、50mg H3BO3、50mg Na2MoO4·2H2O溶于95ml 的灭菌去离子水。最终总量：100ml。 ②.生物素溶液：5mg生物素(Sigma)溶于199ml的5％乙醇。 ③.50X Vogel氏盐浓缩液：150g柠檬酸钠·5H2O、250g KH2PO4、100g NH4NO3、10g MgSO4·7H2O、5g CaCl2·2H2O(事 先缓缓溶于20ml的水中)于750ml的灭菌去离子水，加入5ml 微量元素溶液以及5ml生物素溶液。最终总量：1升。过滤、灭 菌后，将溶液保存于室温。 ④.修饰过的Vogel氏培养基：将1％葡萄糖溶于1X的Vogel 氏盐液。 2.流程 Hsp启动子的制备流程是如图4所示。由财团法人食品工业 发展研究所所收集的红曲霉Monascus BCRC 38072的EST基因 库寻找到25℃ 培养三天时表达量最高的基因，经比对为热休克蛋 白(Heat shock protein，简称Hsp)，推测该基因由一强大启动子 所调控。于是利用其5’端基因序列设计一段探针，以PCR方式由 红曲霉染色体放大该段探针。之后，将PCR产物接到pGEM-T Easy Vector上，命名为TA-Hsp，再以DIG(Digoxigenin)标示 制成探针。利用此探针对红曲BCRC 38072的fosmid基因库进 行菌落杂交，找到含有Hsp基因的原生质体。利用基因枪(shotgun) 的方式对此克隆株进行定序，找出Hsp基因序列及其5’端的启动 子区域。针对Hsp基因5’启动子区域设计引子，利用PCR方法， 自红曲染色体放大一段1478bp长的启动子区域。将此1478bp的 Hsp启动子序列以限制酶BglII与XhoI切位接到载体pHygEGFP 上，并命名为pMS-Hsp，如图5所示(右方的图谱)。将pMS-Hsp 转化至红曲霉中，以潮霉素进行筛选，得到的转化株在荧光显微 镜下可成功观察到绿色荧光蛋白的表达，如图6A与6B所示。图 6A为明视野下，图6B为荧光滤镜下。此结果证明此段启动子区 域具有活性。再以QIAGEN DNasePlant kit抽取红曲霉BCRC 38072荧光转化株的染色体DNA，以HPH-EGFP专一性引子进 行PCR反应，转化株得到1740的产物，如图7所示。第1栏代 表1kb标记(Bio-1KbTM DNA Ladder)，第2-5栏为标号1-4的 转化株，第6栏为BCRC 38072野生型，(-)对照组，以及第7栏 为pMS-Hsp，(+)对照组。详细步骤说明如下。 A.Hsp的探针基因片段的取得 利用PCR克隆出BCRC 38072的Hsp探针序列。 由红曲霉EST基因库设计引子如下： 正向引物： mptc3161-A：5`-GCTTATCTCCAATGCCTCCG-3`(序列 识别号：8) 反向引物： mptc3161-B：5`-CAAGGTCTCGCTCGTTAC-3`(序列识别 号：9) 反应条件如下所示。 100μl的PCR反应中含有DNA模板20ng，正向引物 (10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM) 8μl，10×缓冲液10μl。 第一回合94℃7分钟，第二回合94℃1分钟，55℃30秒， 72℃30秒，30次循环，第三回合72℃15分钟，4℃保存。 反应结束后，以同样体积的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10 体积的3M醋酸钠溶液及两倍体积的100％酒精沉淀DNA。续以 70％酒精洗涤，经离心干燥后，溶于灭菌去离子水，保存于-20℃ 冰箱。 B.重组质粒TA-Hsp 将PCR产物Hsp探针片段纯化回收，将回收的DNA与 pGEM-T Easy Vector以浓度3∶1的比例混匀，加入1μl的T4 DNA接合 与10×接合缓冲液，以灭菌去离子水调制总体积10μl， 于室温进行接合1小时。待接合完成后，取出5μl接合反应产物 加入100μl的ECOSTME.coli competent cells DH5α，进行转化 作用。筛选出3482bp的质粒，并以PCR确认，得到重组质粒 TA-Hsp。 C.Hsp启动子片段的取得 由Monascus EST基因库设计出Hsp启动子的引子，利用 PCR克隆出Hsp启动子序列。 所采用的引子与反应条件如下： 正向引物： Mps17-9259-F：5`-AGTGGCAGCCAACCCTCACC-3`(序 列识别号：11) 反向引物： Mps17-7782-R： 5`-CGGGCTGATAGAGCAGATAGATAGATG-3`(序列识别号： 12) 100μl的PCR反应中含有DNA模板20ng，正向引物 (10μM)2μl，反向引物(10μM)2μl，聚合酶taq 2.5U，dNTP(2.5mM) 8μl，10×缓冲液10μl。 第一回合94℃7分钟，第二回合94℃1分钟，60℃30秒， 72℃1分钟，30次循环，第三回合72℃15分钟，4℃保存。 反应结束后，以同样体积的酚/氯仿(24/25)萃取，再加入1/10 体积的3M醋酸钠溶液及两倍体积的100％酒精沉淀DNA。续以 70％酒精洗涤，经离心干燥后，溶于灭菌去离子水，保存于-20℃ 冰箱。 D.重组pMS-hsp的制备 以限制酶BglII与XhoI分别和PCR产物Hsp启动子片段与 克隆载体pHygEGFP进行剪切作用16小时，再以DNA电泳鉴 定分离，以QIAquickGEL EXTRACTION KIT回收DNA。将 回收的载体与Hsp启动子片段以1∶3比列混匀，并以灭菌去离子 水调制总体积10μl。于16℃进行接合反应16小时。待接合反应 完成后，取出5μl加入100μl的ECOSTM E.coli感受态细胞 DH5α，进行转化作用，所得转化株已于93年12月7日寄存于 财团法人食品工业发展研究所，寄存编号BCRC 940473。经大肠 杆菌质粒筛选出6215bp的质粒，并以PCR确认，即得到重组质 粒pMS-hsp。 E.Monascus原生质体(protoplast)的制备 将Monascus孢子液接在PDA斜面培养基上，30℃静置培 养5-7天。用无菌水刮下孢子，以两层灭菌的miracloth滤膜过 滤孢子液，除去菌丝及琼脂块。于光学显微镜下，以血球计数盘 计算滤液中的孢子数。接种孢子107个/ml至50ml的修饰过的 Vogel氏培养基中，于30℃，200rpm震荡培养16-18小时。以 两层灭菌的miracloth滤膜过滤萌芽的红曲孢子，以无菌水清洗 后，接着以酶消化缓冲液润湿菌丝。 以10ml酶消化缓冲液洗下miracloth滤膜上的菌丝，加入5 ml酶混合液，置于震荡器上，于室温快速摇晃反应半小时，每隔 十分钟，于光学显微镜下观察细胞壁分解情形，直到约90％菌丝 均释出原生质体。用两层miracloth滤膜过滤，滤液于4℃， 1500rpm离心15分钟，收集原生质体。倒去上清液，以酶消化 缓冲液清洗沉淀物两次，再以STC清洗两次。加入1.5ml的STC、 20μl的DMSO、以及0.4ml的PTC，于显微镜下计算原生质体 数目，分装107个/管，并置于-80℃保存。 F.转化作用 采用STC清洗原生质体两次，于4℃、1500rpm离心15分 钟。倒去上清液，以50μl的STC回溶原生质体沉淀。加入1-10μg 的质粒DNA，于200 Ohms，25μF，0.7KV的条件下进行电转。 加入1ml的再生缓冲液(regeneration buffer)，于30℃下静置 隔夜。加入10ml、50℃、含有30μg/ml的潮霉素(hygromycin B) 的top agar培养基，铺于含有30μg/ml的潮霉素的top agar培 养基上，于30℃静置培养，约3-5天可观察到转化株。 G.转化株的筛选与确认 (1)用尖头镊子挑取少许转化株上的菌丝与孢子置于载玻片 上，滴一滴无菌水后盖上盖玻片，于光学显微镜下观察。在观察 绿色荧光蛋白所使用的滤镜下(Ex.430-510nm；Em.475-575 nm)可观察到绿色荧光蛋白的表达。 (2)将转化株接到PDB(potato dextrose broth)培养基中，于 30℃，200rpm震荡培养5-10天。之后将菌体磨碎，抽取染色 体DNA，以HPH-EGFP专一性引子进行PCR，可得到1740bp 的产物。 H.确认具有启动子活性的最小片段 为更进一步确认Hsp启动子片段(1478bp)中具有功能活性的 最小片段，利用PCR方式分别得到包含活性序列片段的1036bp， 720bp，及497bp的PCR产物。所采用的模板为pMS-hsp。获 得上述PCR产物所使用的引子列示如下。 497bp： 正向引物：CCGAGAGCGCGTATATGTAACG(序列识别号：19) 反向引物：CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列识别号：20) 720bp： 正向引物：TGAATTGTGTGGGTGCGTGG(序列识别号：21) 反向引物：CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列识别号：20) 1036bp： 正向引物：CAGTGCATCTTAGCGGTTGG(序列识别号：22) 反向引物：CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列识别号：20) 1478bp： 正向引物：AGTGGCAGCCAACCCTCACC(序列识别号：23) 反向引物：CTGATAGAGCAGATAGATAGATG(序列识别号：20) 将1478bp，1036bp，720bp，及497bp的Hsp启动子序列 接到表达载体，并将载体转化至Monascus BCRC 38072，以含 有Hygr 30ug/ml的PDA培养基做筛选。结果如下所示。 启动子序列长度 Hyg抗性1 荧光2 1478bp R + 1036bp R + 720bp R + 497bp R + 1：R：抗性；N.R.：无抗性。 2：+：阳性；-：阴性。 具有功能活性的最小片段为497bp。且含有497bp片段的转 化株亦可侦测到荧光反应。 将这些质粒亦转化到Monascus pilosus BCRC 31527与 Neurospora crassa BCRC 32685，以含有Hygr 50ug/ml或200 ug/ml的PDA培养基进行筛选。结果如下表。 菌种 Hyg抗性1 荧光2 M.sp.BCRC 38072 R + M.pilosus R + N.crassa R 1：R：抗性；N.R.：无抗性。 2：+：阳性；-：阴性。 具有功能活性的最小片段为497bp(序列识别号：24)。且证实 可于Monascus BCRC 38072，Monascus pilosus BCRC 31527 与Neurospora crassa BCRC 32685表达。 其它实施型态 含有本发明启动子序列的表达载体的实施例可经由P CR方式 增殖本发明的启动子序列，并于其下游接上具有标示功能的基因 而得。具有标示功能的基因为，例如，潮霉素抗性基因或Hyg-GFP 基因。所得表达载体可建构为筛选细胞转化的标志(marker)，例 如，用于评估基因克隆的效率。此外，本发明的载体亦可作为红 曲基因敲除(knockout)的工具，进行菌种改良，如破坏橘霉素 (citrinin)的生合成基因、抑制子(repressor)基因等有害基因，产 生更安全及更具产业利用性的红曲霉种。 本发明的启动子序列尚可在其下游接上具有标示功能的基因 及欲侦测的目标蛋白质基因，用于活体内(in vivo)或原位(in situ) 侦测蛋白质间的交互作用及目标蛋白质的作用位置。 本发明的表达系统，转化株及表达蛋白质方法的应用，可通 过在启动子序列下游接上要表达的酶基因，例如蛋白酶，淀粉酶 (amylase)，几丁质酶(chitinase)，植酸酶(phytase)，葡萄糖淀粉 酶(glucoamylase)。采用本发明的表达系统，可缩短酶生产时间， 亦可大为增加产量。例如，增加红曲霉蛋白酶的产量，可增进红 曲霉以大豆粉作为培养基质的效率，降低生产成本，另增加红曲 霉淀粉酶的产量，则可以增进红曲在酿酒时的糖化力，藉以改变 制酒的制程及产生新风味。 本发明的表达系统，转化株及表达蛋白质的方法的应用，亦 可以在启动子的下游接上二次代谢产物基因，例如，聚缩酮类合 成酶(polyketide synthase)，或非核糖体羧氨酸合成酶 (nonribosomal peptide synthase)基因。此表达系统可提前二次 代谢产物的生产时间，增加产量，而大量减低生产成本。 此外，本发明的表达载体亦可以在启动子下游接上转录活化 子(transcriptional activator)基因，通过大量表达此活化子，同 时也活化其所调控的基因，而大为增加产量。 虽然本发明已以一较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定 本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内， 当可作各种的更动与润饰，故本发明的保护范围当视后附的权利 要求书所界定的范围为准。 序列表 <110>财团法人食品工业发展研究所 <120>启动子与其应用 <140> <141> <160>24 <210>1 <211>1116 <212>DNA <213>Monascus BCRC 38072 <220> <221>启动子 <222> <223>acuF启动子 <400>1 ACTATTAGCG AAAGACCGGC AAGTAGATGG AAGAGCCGGA ATTATTCTTG 50 TTCTTCGATA GTATTCCGTC CATGCCTAGG CACAGATAGT AAGATACACA 100 TCGTAATAGG ACCGCCTGTC GATGCAATCG GGCAATCCAG GAACCCACGC 150 AGCCCAAACA CGAGGCTAGA CTCGCGTCTG CTGCACATGG AAGCTGATGG 200 ATACATATAC CCCCAGCAGC ATGCGGTTCC CCCTGCAGAG ACCAGAGGCT 250 AGAAGTCTCT GGGCGCATGT ATGTATCTAT TATTACCTAT CAATCGGTTT 300 CGGGTACTCC TTGCCGGAGT CGCTGAAGCG CAGACGTGCC GACCCGGAAC 350 ATTTAGGAAG AAACCGTGAT GATTGGGATC GGACTCGGGC ACACATGGCA 400 CCGAATTGCC AAAAAATGGC GCATTCTGGG GAATCAAGCA TGCAGCACAT 450 CTTACTAGAT TCAATAGATT AAGGCACAGG CCATGTAGAG GGCAGTGGCA 500 ATACAATATG GGGCCGTGCG GATCCGAGGA TAAAACTTGC CCGTTAGTCC 550 GGCTGGGGGT TACGGCAGTC ATAACCATCT ACAGCCACGG CCGGGCCAGG 600 TGGTGCACAC GGCCGTCCCG GTATTGTCCG AGGCTCAGCC GAGAAGCCCT 650 AACCCCTAGC CGACCAGGGC TCCGCGTCTC CCCGCAAACT CGTTTTAAAC 700 TTGCAGCTTC CCGTGCTCCG TCGTGCCCTA GCCCGCGCTG ATTCGCCGCT 750 CGGGCGAATT CGGGCGTGTT TATGCCTCGT CCTGCTCTGA CTTCATCGTC 800 CGGAGCCCAA TTCCTGGCCG TCAATCGCTC TCCTTCGCTG CCCTGACGCA 850 AACCGCGCTG TCCACAGCGC TCCCCATCTC GCAACGACCC CGACATCTCC 900 CGTTATACGG TGGAGACGGA CGAGAAATCT TCTGCGGATG GGAGGCATAT 950 TCGACACTTT ACGACTTATC GTCGCCCTCA TGGTTTCCCC CGCTGCAAAC 1000 ATTCCATATA CCCCCCCTTC GGCCCTGCTT CTCCTGCTCC TGCAAACTCG 1050 GATTTTGTTC GACAGCAAGT CGCGAGACAG CAGAAGAACG ACTACCACTC 1100 GACCTCACTC AGAAAC 1116 <210>2 <211>1478 <212>DNA <213>Monascus BCRC 38072 <220> <221>启动子 <222> <223>Hsp启动子 <400>2 AGTGGCAGCC AACCCTCACC AAATCGGAAC TGAACAGATT TACGTTGAAG 50 AACGCCGTAC TCGTACCAAT ACCTACGGTG GAAATGCCAA CTTTGGAGCT 100 GGCAGGGGTG GCGCTGGCCG TGGTCGTGCT GGACAAGGCC GGGGCGGCTT 150 CCAACGAGAT GGCGGCCGTG GAGGGTTTGC TCCCCGTGGC CGTGGCGGAA 200 ACGTCACGCC CAAGGGCCGC AACCAGCCTC AAACTGCATA AAGTAAGGAT 250 GCCAATGAGA ATTCGAATGC GTGATGCTTT CTTTGTTTCT CCGGCTGACG 300 ATACCTCTTT TTCTTTTTTT CTACCAATCC CGCTGGTTGG TGCAGCGCTG 350 ATCTTTGTTA TATTGCTTAC GGAATTTCCA GGTTATGTAT TACTTTCCCA 400 TTTACCCATA ATGATATGTG TTATGTGGCT CTCATTTTGT CACAGTGCAT 450 CTTAGCGGTT GGAAAAAAGT TTTCATTTTT CCCAGCTCAG CACTTTTATT 500 TTCCATGGCC TCTTTGGTTT GTGTTTTATG AGCTCGTTTC TTTTGTTACT 550 TTCTGCCTTT GTATTGTCCG CATCCGTGTG ATCCTAGCAT AGCGCGCAGA 600 AAGCCTATAT TCTTCTCCCC TATTATTCCA CATATCCTTT TCTTTCTCCT 650 TGATGCTGTG TTTCAGATCT CAACCTAACA ACACTTAGTG TTCTCTTCTT 700 TCTATTTCTT ATTTTTATTT TTATTTATTT ATATTTTTTC ACATTGGTAT 750 TGGCACCCTG AATTGTGTGG GTGCGTGGAA TACTGTACAA TCAATCCACT 800 CAGGCGCAGT GAATTGGTTT GCAGGAAGGG 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