[0001] 本发明涉及一种启动子及其应用，特别涉及一种来源于巴西橡胶树的启动子及其应用。

[0002] 在高等植物中，蔗糖是光合作用的主要产物。在由源到库的长距离运输过程中，蔗糖是作为植物体内碳水化合物运输的主要甚至是唯一的形式(Williams,L.E.,et al.,Sugar transporters in higher plants-a diversity of roles and complex regulation.Trends Plant Sci,2000，5,283-290；Sylvie L.,et al.The dual function of sugar carriers:transport and sugar sensing.Plant Cell,1999,11:707-726)。蔗糖分子进出韧皮部筛分子通过两种不同的途径进行，即共质体途径和质外体途径（Buchanan B.B.,et al.,Biochemistry and Molecular Biology of Plants.Rockville:American Society of Plant Physiologists,2000,748-776）。由于在很多种类的作物中，质外体途径占有极其重要的地位，蔗糖的跨膜运输及其在植物中的分配需要依赖于膜上的蔗糖转运蛋白进行介导，蔗糖转运蛋白作为植物所特有的一类载体蛋白，在蔗糖的分配中具有重要的生理作用，主要是在蔗糖进出韧皮部，库组织的蔗糖供给，蔗糖的贮藏，蔗糖转运调控以及其它小分子物质转运等多种生理过程中发挥重要作用（Gahrtz M.,et al.,A phloem-specific sucrose-H+symporter from Plantago major L.supports the model of apoplastic phloem loading Plant J,1994,6(5),697-706;Truernit E.,et al.,The promoter of the Arabidopsis thaliana SUC2 sucrose-H+symporter gene directs expression of β-glucuronidase to the phloem:evidence for phloem loading and unloading by SUC2.Planta,1995,196:564-570;Kühn C.,Companion cell-specific inhibition of the potato sucrose transporter SUT1.Plant Cell Environ,1996,19,1115-1123;Bürkle L.,et al.,The H+-sucrose cotransporter NtSUT1 is essential for sugar expurt from tobacco leaves.Plant Physiol,1988,118,59-68;Hackel A,et al.,Sucrose transporter LeSUT1 and LeSUT2 inhibition affects tomato fruit development in different ways.The Plant Journal,2006,45,180–192;Gabriel-Neumann E,et al.,Constitutive overexpression of the sucrose transporter SoSUT1 in potato plants increases arbuscular mycorrhiza fungal root colonization under high,but not under low,soil phosphorus availability.J Plant Physiol,2011,168(9):911-9;Siahpoosha M.R.,et al.,Modification of OsSUT1 gene expression modulates the salt response of rice Oryza sativa cv.Taipei
309.Plant Science 2011）。一些实验结果表明蔗糖转运蛋白还参与了对非生物胁迫和生物胁迫的响应（Sakr S.,et al.,Cutting,ageing and expression of plant membrane transporters.Biochim.Biophys.Acta,1997,1330:207-216;Meyer S.,AtSUC3,a gene encoding a new Arabidopsis sucrose transporter,is expressed in cells adjacent to the vascular tissue and in a carpel cell layer.Plant J,2000,24:869-882），以及蔗糖信号感应与转运效率的调控(Barker L.,et al.,SUT2,a putative sucrose sensor in sieve elements.Plant Cell,2000,12,1153-1164;Schulze W.,et al.,Function of the cytosolic N-terminus of sucrose transporter AtSUT2 in substrate affinity.FEBS Lett,2000,485:189-194;Reinders,A.,Schulze,W.,et al.,Protein–protein interactions between sucrose transporters of different affinities colocalized in the same enucleate sieve element.Plant Cell，2002,14,1567–1577)。

[0003] 巴西橡胶树是一种在世界经济和军事发展中均扮演重要角色的热带树种，其生产的天然橡胶是一种重要的工业原料和战略物资。天然橡胶的生物合成是以蔗糖为原料，以乳管为加工场所进行，乳管中蔗糖的供给能力与橡胶产量密切相关。早期，Bouteau等人通过同位素标记和电生理试验首次证明在乳管的原生质体膜上存在参与乳管糖吸收的糖-质子共转运系统（sugar-H+symport system）(Bouteau F.,Evidence of multiple sugar uptake across the plasma membrane of lacticifer protoplasts from Hevea.Bioelectrochem Bioenerg,1999,48(1):135-139)。

[0033] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0034] 实施例1、橡胶树启动子获得

[0035] 一.构建橡胶树启动子克隆文库

[0036] 为了更好的构建橡胶树启动子克隆文库，对Clontech的Genome WalkerTM Universal Kit中的接头长链进行了修改，短链未做修改，接头的短链与长链分别溶解于TE溶液，浓度为100μmol/l，长链和短链1:1混合，变性退火（95℃5min，37℃10min，室温放置30min）形成接头，接头浓度为50μmol/l。以橡胶树品系热研7-33-97的叶片为材料提取基因组DNA，方法采用安泽伟等人改进的CTAB法。选取25种限制性内切酶对橡胶树热研7-33-97（中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售）基因组基因进行完全酶切，其中酶切产物为粘性末端的限制性内切酶包括BamH I、Bcl I、Bcu I、Bgl II、BspT I、EcoR I、Hind III、Kpn I、Nco I、Nde I、Sty I和Xba I；产物为平末端的包括BseJ I、Bst1107I、Dra I、Eco105I、Eco147I、Eco72I、EcoR V、HincII、KspA I、Pvu II、Sca I、Ssp I和Xap I。酶切体系如下，5.0μl 10x酶切buffer，5.0μg 基因组DNA，37℃或者对应内切酶的最佳酶切温度，酶切16h；对酶切产物进行酚氯仿抽提，乙醇-醋酸钠沉淀回收酶切后的基因组DNA。利用T4DNA Polymerase对酶切产物进行末端平端化处理，反应结束后，酚氯仿抽提，乙醇-醋酸钠沉淀回收平端化酶切产物，分别与接头连接。连接体系如下：1.0μl 10x ligase buffer，1.0μl 50%PEG4000，1.0μg酶切产物，1.0μl 50μmol/l接头，2.5U T4DNA ligase，加灭菌水至10.0μl，16℃连接24h；
65℃，10min灭活连接酶，稀释10倍后即可作为启动子克隆的模板。橡胶树启动子克隆文库包括由25种限制性内切酶的基因组DNA酶切产物加上接头而形成的启动子克隆模板。

[0037] 二.橡胶树胶乳蔗糖转运蛋白启动子序列的获得

[0038] 根据本实验室获得的橡胶树蔗糖转运蛋白的cDNA序列设计巢式PCR引物两条：

[0039] PrHb5-GSP1 5’-TTGAAGTCACACGTAGTAGTTGACGCAACC-3’

[0040] PrHb5-GSP2 5’-AACCGGACTCTGCGGACCACCGGTGGTCT-3’

[0041] 利用设计的两条基因特异性引物（GSP1和GSP2），结合接头引物（ADP1和ADP2），以步骤一获得的文库为模板，进行巢式PCR扩增，以获得基因的启动子序列。第一轮PCR扩增使用高保真的热启动DNA聚合酶 HS DNA Ploymerase进行Touch Down PCR，反应体系如下：5.0μl 5×PrimeSTAR buffer（Mg2+plus），2.0μl 2.5mM dNTP Mixture，1.0μl 稀释10倍的文库(取25个模板之一)，0.5μl ADP1(10μM)，0.5μl GSP1(10μM)，
0.25μl PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)，加灭菌水至25.0μl.反应程序如下：
94℃3分钟；98℃10秒，72℃5分钟，7个循环；98℃10秒，68℃5分钟，32个循环；68℃7分钟。第二轮PCR扩增采用LA Taq DNA Polymerase进行两步法PCR，并以第一轮扩增产物为模板，反应体系如下：2.5μl5×LA PCR buffer（Mg2+plus），2.0μl 2.5mM dNTP Mixture，
1.0μl 稀释100倍的第一轮PCR扩增产物，0.5μl ADP2(10μM)，0.5μll GSP2(10μM)，
0.2μl PrimeSTAR HS DNA Polymerase(5.0U/μl)，加灭菌水至25.0μl.反应程序如下：
94℃3分钟；94℃30秒，68℃5分钟30个循环；68℃7分钟。PCR获得大小1500bp左右的核苷酸序列片段，并将其克隆到pMD18-T载体进行测序,对其序列进行分析确定该序列为蔗糖转运蛋白基因的启动子，启动子长度为1440bp命名为PrHb5。

[0042] 实施例2、橡胶树胶乳蔗糖转运蛋白启动子序列分析

[0043] 一.橡胶树胶乳蔗糖转运蛋白核心启动子位点预测

[0044] 利 用 promoter Prediction 软 件（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）对蔗糖转运蛋白（PrHb5）启动子的基础启动子进行预测，结果显示自序列表中序列1的5′端第201~251位核苷酸，序列1的5′端第626~676位核苷酸，序列1的5′端第1057~1107位核苷酸处存在可能的基础启动子区域（表1），特别是1057-1107基础启动子区域的得分值接近1.0，表明是核心启动子区的可靠性很高。同时序列中阴影处为预测的转录起始位点。

[0045] 表1BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）数据库启动子预测结果[0046]

[0047] 二.橡胶树启动子顺式元件预测

[0048] 利 用 Plantcare 软 件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）软件在线分析启动子的顺式作用元件。分析结果表明，该启动子除存在启动子的基础转录元件TATA-Box和CAAT-Box外，同时存在着大量的可能与激素应答相关、胁迫应答相关（生物胁迫与非生物胁迫）、光应答相关、发育相关的顺式作用元件（表2）。其中与光应答作用元件最多，其次为胁迫应答、激素应答及发育相关的顺式作用元件（图1）。

[0049] 甲基茉莉酸应答顺式作用元件（CGTCA-motif、TGACG-motif），乙烯应答顺式作用元件（ERE），生长素应答顺式作用元件（TGA-motif），赤霉素应答顺式作用元件（P-box）及水杨酸应答顺式作用元件（TCA-element），这些激素分别或相互协调地调控植物的生长、发育与分化。在胁迫应答相关的顺式作用元件中，主要包括了厌氧胁迫应答顺式作用元件（ARE），高低温胁迫应答相关的顺式作用元件（HSE，LTR）及干旱胁迫作用元件（MBS）。在发育相关的顺式作用元件中主要包括了分生组织（CAT-box），栅栏叶肉细胞（HD-Zip
1,HD-Zip 2）及胚乳发育相关的顺式作用元件。光应答的相关顺式作用元件广泛分布于PrHb5启动子（GA-motif，BoxI，Sp1，GT1-motif等）。

[0050] 表2.PrHb5启动子区域顺势作用元件预测

[0051]

[0052]

[0053]

[0054] 实施例3、PrHb5启动子的植物表达载体构建及转基因拟南芥阳性植物的筛选[0055] 根据测序得到的启动子序列，设计PrHb5启动子扩增的特异性引物并对橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)进行基因组扩增。扩增引物为：PrHb5-F：5’-CCGAGAAAAGCTTATTCCAAC-3’，PrHb5-R：5’-TCCCTTCTCCTCGAAAGAAACAC -3’。扩增得到1440bp左右的片段，将该片段回收测序表明该片段的序列为序列表中序列1的核苷酸序列，该片段即为本发明的启动子片段。将回收片段与经Xcm I酶切的pCXGUS-P (Chen S.B.,et al.,A versatile zero background T-vector system for gene cloning and functional genomics.Plant Physiol.2009,150:1111-1121)（购自Arabidopsis Biological ResourceCenter )回收后的植物表达载体的连接，得到重组表达载体，经测序表明含有上述启动子片段的重组载体命名为pPPrHb5-GUS。pPPrHb5-GUS上GUS基因的上游只有本发明的启动子序列，无其他启动子，该载体GUS基因只有在本发明启动子启动下才能够表达。

[0056] 将上述pPPrHb5-GUS采用电击方法将表达载体转入农杆菌（EHA105，北京天恩泽基因科技有限公司），同时植物表达载体pCXGUS-P经BamH I单酶切后自连作为阴性对照，将该阴性对照质粒命名为pCK。pCK中含有GUS基因，但是GUS基因上游没有任何启动子序列。参照卢张森的方法对拟南芥进行农杆菌侵染试验，利用喷雾器将上述转入质粒pPPrHb5-GUS的农杆菌或对照质粒pCK的农杆菌悬浮液分别喷洒至拟南芥花絮上，保鲜膜将侵染过的拟南芥（T0代）罩起来以保持湿度，置入培养室中黑暗培养24h，之后正常培养，至植物成熟后收集种子放在干燥环境中一周左右，将T0代种子播种到含有50μg/ml的潮霉素B的固体MS培养基平板上，筛选转化子，两周后选择长势正常的拟南芥移至土中继续生长，成熟后收集T1代种子干燥环境中保持备用。

[0057] 对转pPPrHb5-GUS拟南芥和转对照质粒pCK拟南芥T 1代种子进行PCR扩增检测：提取T1拟南芥阳性植株的DNA，以T1拟南芥阳性植株的DNA为模板，用植物表达载体中GUS基因特异性引物G1和G2扩增（G1：5’-TCACCATTGGCCACCACCTGCC-3’，G2:5’-CCTGTAGAAACCCCAACCCGTG-3’），均扩增出了目的条带600bp左右，即获得阳性的转基因拟南芥T 1代种子（pPPrHb5-GUS和pCK中都有GUS基因所以可以同时检测）。

[0058] 为进一步确认转pPPrHb5-GUS拟南芥T1代拟南芥阳性植株中所含的启动子片段，用载体插入位点两侧的特异性引物GUS-V和PV（GUS-V:5’-CCGCATCGAAACGCAGCACG-3’，PV:5’-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’）进行了扩增，扩增出目的条带大小为1700bp左右，筛选到转pPPrHb5-GUS拟南芥阳性植株。G1和G2扩增得到目的条带，但GUS-V和PV扩增得到300bp左右条带的是转pCK拟南芥阳性植株。

[0059] 实施例4、转基因拟南芥中PrHb5启动子的组织特异性分析

[0060] a.转基因拟南芥中GUS组织染色分析

[0061] 按 照 Jefferson（Jefferson R.A.,Gus Fusion:β-Glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plant.EMBO J,1987,6:3901-3907）经典GUS组织染色分析的方法，分析PrHb5启动子在转基因拟南芥中的组织特异性。具体方法如下所述：

[0062] 分别取转pPPrHb5-GUS拟南芥阳性植株幼苗期和成熟期植株，浸泡在GUS染液中，37℃保温数小时或过夜（根据GUS表达强度而定），同时取转化阴性对照（上述转对照质粒pCK拟南芥）的两个时期拟南芥作为对照（CK）。转入70％（体积百分含量）乙醇中脱色2-3次，至脱色完全，肉眼或电子显微技术镜下观察，白色背景上的蓝色的部分即为GUS基因表达的结果。如图2所示，PrHb5启动子具有较强的启动报告基因gus转录的活性。幼苗期几乎整个植株都被染色，通过叶片放大后可以看出，叶脉染色更深。成熟期主要染色集中在根部和莲座叶中，花萼和蒴果果夹中也有比较明显的着色。而转对照质粒pCK拟南芥无论在幼苗期还是成熟期的各个组织均无着色。

[0063] b.转基因拟南芥不同组织中GUS荧光定量分析

[0064] 利用GUS能够降解4-MUG生成荧光底物4-MU，4-MU在365nm波长激发光的作用下，发射出447nm波长的荧光，且发射荧光强度与4-MU量成线性关系，测定GUS酶活。主要参照Cervera（Cervera M.,Histochemical and Fluorometric Assays for uidA (GUS)Gene Detection.Plant Sci.,2004,286:203-213）方法，具体步骤如下所述：

[0065] 分别取PrHb5启动子转基因拟南芥阳性植株成熟期各组织100mg左右，加入800ml GUS 提取缓冲液，放置于冰上充分研磨，离心沉淀细胞碎片，取上清，采用Bradford法对其蛋白进行定量，-80℃保存。将底物4-MUG溶解于适量GUS提取缓冲液（磷酸鈉缓冲液(pH7.0)，50mM；β-巯基乙醇，10mM；Na2EDTA (pH8.0)，10Mm；Triton X-100，0.1%）中配置GUS检测液（2mM）。取蛋白抽提物跟GUS检测液等体混匀至总体积为300ul，37°C温育适当时间，在不同时间取100μl样品直接加到900μl Na2CO3溶液（0.2mol/L，pH9.5）终止反应，取200μl终止反应后的反应液加到比色杯中，在激发波长365nm和发射波长447nm下测量荧光，计算酶活。各组织中GUS的酶活性检测结果显示，PrHb5启动子转基因拟南芥阳性植株根中GUS酶活性最高，远远高于其他组织，其次为莲座叶、茎生叶及花，在茎及种子中GUS酶活性最低（图3），由此可以证明本发明的启动子在植物成熟期中是根特异性表达启动子。阴性对照转基因植株中没有GUS酶活性。

[0066] 实施例5、转基因拟南芥中不同处理PrHb5启动子表达的影响

[0067] a.植物激素对转基因拟南芥中PrHb5启动子驱动的GUS表达活性的影响[0068] 取MS（50ug/ml Hyg）平板上生长两周，长势基本一致的转基因（pPPrHb5-GUS、或对照pCK）拟南芥幼苗分别进行植物激素处理。下述每个处理选择4个独立的转基因拟南芥株系做重复。将转基因（pPPrHb5-GUS、或对照pCK）拟南芥幼苗生长的固体MS培养基分别浸泡在含100μmol/L脱落酸（ABA）、100μmol/L水杨酸（SA）、100μmol/L赤霉素（GA）、100μmol/L乙烯利前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）、100μmol/L生长素（IAA）或100μmol/L细胞分裂素（6-BA）的溶液中，22℃0、3、6、9小时后，分别取材检测。阴性对照（pCK）转基因拟南芥同步进行以上操作。将上述材料按照不同组织酶活测定的方法测定酶活（Cervera M.,Histochemical and Fluorometric Assays for uidA (GUS)Gene Detection.Plant Sci.,2004,286:203-213），分析不同处理下报告基因表达的蛋白（GUS）活性变化。检测结果表明乙烯利前体ACC及生长素IAA对启动子转基因拟南芥刺激后，GUS比活呈现先上升后下降的趋势，且在9h后降低到处理前水平（图4，图5）。细胞分裂素6-BA处理后，GUS比活在9小时内出现了先升高后下降的趋势，且在6小时表达活性最高，在9小时表达活性高于处理前（图6）。赤霉素GA，水杨酸SA及脱落酸ABA处理后GUS比活出现下降的趋势（图7，图8，图9）。而阴性对照（pCK）转基因拟南芥植株中没有GUS酶活性。

[0069] a.非生物胁迫对转基因拟南芥中PrHb5启动子驱动的GUS表达活性的影响[0070] 取MS（50ug/ml Hyg）平板上生长两周，长势基本一致的转基因（pPPrHb5-GUS、或对照pCK）拟南芥幼苗分别进行非生物胁迫处理。

[0071] 干旱处理，将转基因拟南芥转移至干燥的滤纸上面，22℃0、1、2、3小时后，分别取材检测；

[0072] 高温（37℃）处理，将转基因拟南芥置于高温环境中继续光照培养，37℃0、3、6、9小时后，分别取材检测；

[0073] 低温（4℃）处理，将转基因拟南芥置于低温环境中继续光照培养，4℃0、3、6、9小时后，分别取材检测；

[0074] 伤害处理，用镊子将转基因拟南芥的叶片夹伤，22℃0、3、6、9小时后，分别取材检测；

[0075] 上述每个处理选择4个独立的转基因拟南芥株系做重复。空白对照：阴性对照（pCK）转基因拟南芥同步进行以上操作。

[0076] 将上述材料按照酶活测定方法测定GUS酶活（Cervera M.,Histochemical and Fluorometric Assays for uidA (GUS)Gene Detection.Plant Sci.,2004,286:203-213），分析不同处理下报告基因表达的蛋白（GUS）活性变化。GUS活性分析结果显示，低温处理PrHb5启动子转基因拟南芥，短时间内GUS活性上升，随处理时间延长，GUS表达活性恢复到处理前水平（图10）。在高温，伤害及干旱处理HbSUT5启动子转基因拟南芥后，9小时内GUS表达活性呈现下降趋势，且伤害干旱处理时，GUS活性下降更为明显（图11，图12，图13）。而阴性对照（pCK）转基因拟南芥植株中没有GUS酶活性。

[0077] 结论

[0078] 本发明的启动子存在着大量的可能与激素应答相关、胁迫应答相关（生物胁迫与非生物胁迫）、光应答相关、发育相关、糖应答相关的顺式作用元件，其中激素应答及根特异表达调控相关的作用元件最为广泛。构建该启动子的GUS融合表达载体，通过转基因拟南芥对其进行功能验证，发现该启动子在根中活性最高，同时发现该启动子活性受多种激素及胁迫调节，且大部分属于诱导下调。因此，该启动子在橡胶树以外的其他植物及微生物工程中得到广泛的应用。