技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种响应盐胁迫的诱导型启动子CDM1启动子。
相关背景技术
[0002] 启动子是基因的一个组成部分，启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。诱导型启动子不同于组成型的启动子，其只在某些信号的刺激下才启动外源基因的转录，能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性。一定程度上解决转基因应用中食品安全性问题，是应用植物转基因技术进行基因工程育种的理想启动子。
[0003] 在自然界中，存在着多种逆境，严重影响植物生长，如干旱，盐害，高温等。高浓度的盐引起植物生理性干旱，危害植物组织，影响植物对养分的吸收和代谢，从而影响植株正常营养，导致植物产量下降甚至死亡。
[0004] 启动子是基因工程表达载体的重要元件，研究启动子对于基因表达调控机制，改善作物的生产性状，如抗虫、抗病、抗逆等性状具有十分重要的意义。目前已知诱导性启动子一般包括：光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子等。获得植物来源的新的启动子，可以为研究植物基因的表达、调控和利用基因工程方法改良作物提供有用的核心元件。
具体实施方式
[0015] 1.启动子克隆
[0016] 从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)数据库中下载CDM1基因DNA序列，选择ATG上游约1.6kb长度作为CDM1启动子区域，设计引物，酶切位点选择KpnⅠ,SalⅠ。
[0017] 启动子扩增体系如下(共20ul)
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[0019] 表1 CDM1启动子扩增所用的引物序列
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[0021] 下划线所标注的序列为引入的限制性内切酶识别位点。
[0022] 实验结果：
[0023] 经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为1639bp的片段，见图2所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0024] 2.启动子序列分析
[0025] 利用PLACE数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)进行启动子调控元件分析。
[0026] 实验结果：
[0027] 表2 CDM1启动子所含有的启动子必需元件及响应环境胁迫的元件汇总表[0028]
[0029] N＝A/G/C/T,W＝A/T,R＝A/G，V＝A/C/G
[0030] 3.转基因拟南芥植株
[0031] 将构建成功的含AtCDM1-GUS的二元载体转入农杆菌中，通过花絮浸染法转入野性型拟南芥(Col-0)。待种子成熟后，在含潮霉素的平板上进行筛选，因二元载体含有潮霉素抗性基因，故成功转入二元载体的植株能够正常生长，将筛选出来的植株进行移板至1/2MS平板上，生长3-5天，进行移栽，然后进一步用GUS染液进行鉴定。鉴定方法为：将待染色植物，加入适量GUS染色液，使GUS染色液完全浸没组织，37℃孵育过夜，随着孵育时间的延长，蓝色渐渐出现，当表达量较高时，GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，用70％乙醇脱去样本的叶绿素，一般样本浸没于乙醇1-3h，可用50℃水浴加速叶绿素脱色，用肉眼或着光学显微镜观察。
[0032] 结果分析：得到的转基因植株在表型上与野生型基本一致(见图3)，在进行GUS染色后可看到叶片明显呈现蓝色，说明CDM1启动子序列是具有启动子功能的，可以启动外源基因的表达。
[0033] 4.盐诱导实验
[0034] 将野生型种子和转基因T3代种子进行种子表面消毒，然后放置在4℃进行春化三天，将种子点在1/2MS平板上，在10000Lux光照下，16h光照/8h不光照交替生长5天，为了减少变量以及不可控因数，将同时点在同一平板上的野生型植株和转基因植株分别移至同一个1/2MS以及150mM NaCl平板上进行生长48h。
[0035] 收取上述平板上生长48h后的幼苗，进行GUS染色，结果见图4所示。当用含盐(150mM NaCl)的培养基对转基因植株进行处理后，发现CDM1启动子可以增强外源基因GUS的表达，致使转基因植株染色加深，证明CDM1的启动子明显受到盐的诱导。
[0036] 以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
