[0001] 本发明涉及一种猪TRIM72因子的应用，属于生物技术领域。

[0002] 肌内脂肪性状是提升猪肉品质的核心要素之一，具有较高的经济价值，然而常规选育效果有限，分子改良潜力巨大。众所周知，肌内脂肪与猪肉嫩度和适口性显著相关，其含量高低已成为衡量猪肉品质的主要因素之一。然而，由于猪肌内脂肪与皮下脂肪沉积之间存在一定的正相关，在提高肌内脂肪含量的同时也会增加背膘厚度，如何在不影响皮下或其它部位脂肪沉积的同时对猪肌内脂肪性状进行改良成为了一大难题。

[0003] 肌内脂肪位于肌肉内的特殊微环境，其形成有着自身独特的规律，肌肉组织对其影响巨大。与机体其它部位脂肪组织相比，肌内脂肪在沉积过程中与肌肉组织间存在相互作用，由于肌肉组织是体内最大的内分泌器官，在生长发育过程中可以分泌各类因子调控包括肌内脂肪等周边组织的代谢。尽管在人和动物中已经发现数十种肌肉因子，但绝大多数因子都在多种不同组织中表达和分泌，其作用往往是全身性的，难以单独解释对肌内脂肪沉积的特异性调控作用，而育种中我们更希望单独对肌内脂肪性状进行改良。因此，寻找能够在肌肉中特异表达的分泌因子，并解释这些因子对肌内脂肪的特异性调控作用，成为了解锁肌内脂肪形成规律的一大核心问题。目前已有数十种肌肉分泌因子被鉴定出来，其中绝大多数因子可以作用于多个组织，比如鸢尾素(iris in)作用于肾脏、胰腺和脂肪组织，白细胞介素6(interleukin 6，IL6)作用于胰腺和脂肪组织，mynect in作用于肝脏和心脏组织等。对于肌内脂肪组织来说，已经发现肌肉特异性分泌因子肌肉生长抑制素(myostat in)的突变可以增加小鼠肌肉组织发育水平并降低肌内脂肪含量，而且myostatin可以抑制猪肌内前体脂肪细胞分化和调控糖皮质激素受体(GR)相关通路抑制3T3‑L1脂肪细胞的脂质生成，肌肉因子白细胞介素15能够抑制猪的脂肪细胞分化，肌肉特异性下调糖皮质激素受体的水平则抑制了猪肌内脂肪细胞的脂质生成等。虽然已发现的肌肉因子数量不少，但至今仅发现myostat in和TRIM72两个因子在肌肉组织中特异性表达和分泌，其它肌肉因子均在多种不同组织中表达，因此解析肌肉特异性分泌因子TRIM72对周围组织的作用具有非常重要的应用价值。

[0004] TRIM72(tripart ite mot if containing 72，三结构域包含蛋白72)是三重基序家族的E3泛素连接酶成员之一，因最初在骨骼肌细胞中发现，所以又称为mitsugumin 53(MG53)，主要在骨骼肌和心肌中特异性分泌和表达，由N端的TRIM结构域、PRY结构域和C端的SPRY结构域组成，其中TRIM结构域又由RING结构域、B‑box结构域和Coi led‑coi l结构域构成。在人和小鼠中，TRIM72一是能够参与膜损伤信号响应、膜修复因子招募、修复囊泡转运等过程调控细胞膜修复，二是能够通过泛素化底物蛋白和调节胰岛素样生长因子，抑制骨骼肌分化和肌肉生成，三是在肌肉细胞内能够通过泛素化底物蛋白和调控过氧化物酶体增殖物激活受体α，还可以与胰岛素受体结合发挥阻断剂的功能，影响小鼠肌肉的胰岛素信号。然而，作为2009年发现的新肌肉分泌因子，TRIM72除了应用于肌肉萎缩或心脏增强剂等，其他用途仍属未知。

[0019] 实施例1

[0020] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

[0021] 1.试验动物

[0022] 试验动物来自江苏康乐农牧有限公司提供的7日龄的大白×长白(Yorkshire×Landrace)二元杂仔猪、济南市莱芜猪种猪繁育有限公司提供的成年莱芜猪、南通嘉仑食品厂提供的成年杜洛克×长白×大白三元杂交猪(Duroc×Landrace×Yorkshire)，常州市焦溪二花脸猪专业合作社提供的成年二花脸猪。选取7日龄二元杂仔猪的心、肝、脾、肺、肾、皮下脂肪、背最长肌组织以及成年莱芜猪的肝脏、皮下脂肪、背最长肌组织用来提RNA；杜长大猪和二花脸猪的背最长肌组织用来提取蛋白和进行肌内脂肪含量测定。

[0023] 2.试验步骤

[0024] 2.1肌内脂肪含量测定

[0025] (1)将定量滤纸分摊在洁净的搪瓷盘中，105℃烘干2h以上，直至其重量没有变化为止。用精密天平(感量：0.0001g)准确称量烘干后滤纸的重量(W1)。

[0026] (2)将2‑3g肌肉样剪碎后用烘干滤纸包裹，称量纸包重量(W2)。将纸包分摊在洁净的搪瓷盘中，放入烘箱中，65℃烘干15h以上，直至其重量没有变化为止。称量烘干后纸包的重量(W3)。

[0027] (3)将烘好的滤纸包放入索氏抽提器中，倒入无水乙醚浸泡过夜(乙醚全部淹没滤纸包)，第二天早上打开乙醚回流装置，75℃回流9h以上。

[0028] (4)抽提完毕后取出滤纸包分摊在洁净的搪瓷盘中，在通风处发挥完乙醚30min，使乙醚充分挥发，105℃烘干2h以上，直至其重量没有变化为止，称量烘干后纸包的重量(W4)。

[0029] (5)为消除样品前处理过程中各样品水分损失不等所造成的误差，肌内脂肪相对含量用抽提总脂重量占烘干后样品重(105℃烘干15h)的百分比值表示。计算公式如下：

[0030] 肌内脂肪含量(％)＝(W3‑W4)/(W3‑W1)×100％

[0031] 2.2组织和细胞总RNA的提取

[0032] (1)取组织样品置于2mL离心管内，加入1mL Trizol和两粒磁珠，置于匀浆机中震动研磨，直至管中无块状组织，管内液体呈白色浑浊状即可。对于细胞样品，需吸去细胞板内的培养基，小心清洗3遍，加入1mL Trizol，充分裂解细胞后吸取细胞裂解液于2mL离心管中。所有操作均在冰上进行。

[0033] (2)每管加入0.2mL氯仿，混匀后冰上静置5min，4℃，12000rpm，离心15min。

[0034] (3)转移上清至新1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后冰上静置10min，4℃，12000rpm，离心10min。

[0035] (4)小心倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，混匀，4℃，12000rpm，离心5min。

[0036] (5)重复步骤(4)。

[0037] (6)小心倒掉上清，4℃，12000rpm，空离1min，然后用10μL移液枪尽量吸去多余的有机溶剂。

[0038] (7)将离心管置于超净台下吹15‑20min，直至没有多余液体。

[0039] (8)加入20μL DEPC水，吹打混匀，直至沉淀完全溶解。

[0040] (9)用Nanodrop分光光度计测总RNA浓度，提取好的RNA用于反转录实验或置于‑80℃超低温冰箱中保存。

[0041] 2.3RNA反转录

[0042] (1)将提取的RNA用Evo M‑MLV RT Premix试剂盒对其进行反转录。体系如表1：

[0043] 表1反转录反应体系

[0044]

[0045] (2)将混合液置于PCR仪内，反转录程序如表2：

[0046] 表2反转录反应程序

[0047]

[0048] (3)反转录后的cDNA，加入30μL ddH2O进行稀释，用于后续的荧光定量PCR或置于‑20℃冰箱中保存。

[0049] 2.4实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)

[0050] 根据NCBI上GenBank数据库中猪TRIM72、G1/S‑特异性周期蛋白D1(Cycl in D1，CCND1)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(Cyclin‑dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A/P21)、过氧化物酶体增生激活受体γ (peroxisome prol iferator activated receptor gamma，PPARG)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer‑binding protein alpha，CEBPA)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4)和猪甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(glyceraldehyde‑3‑phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因的mRNA序列设计引物，引物序列如表3。运用实时荧光定量PCR检测各基因的表达量，反应体系和程序如表4和表5。以GAPDH作为定量的内参基因，每个样本重复三次，基因相对表达量的分析采用2‑ΔΔCT法。

[0051] 表3荧光定量PCR引物信息表

[0052]

[0053]

[0054] 表4RT‑qPCR反应体系

[0055]

[0056] 表5RT‑qPCR反应程序

[0057]

[0058] 2.5猪肌内前体脂肪细胞的分离和培养

[0059] 2.5.1试验试剂的配制

[0060] (1)1％ PBS的配制：50mL PBS+1％双抗(青链霉素混合液)。

[0061] (2)I型胶原酶(1mg/mL)：1mg I型胶原酶+100mL DMEM高糖培养基，尽量现配现用，若提前配置需放于‑20℃保存。

[0062] (3)基础培养基(10％ FBS的DMEM)：5mL FBS+44.5mL DMEM高糖培养基+0.5mL双抗。

[0063] (4)CEE：添加10mL ddH2O，粉末充分溶解后，分装并放于4℃或‑20℃进行短期或长期储存。

[0064] (5)bFGF(100ng/mL)：将bFGF干粉先离心到管底，10μg干粉中加入100μL ddH2O充分溶解，分装并放于‑20℃进行储存。

[0065] (6)生长培养基：10mL FBS+0.5mL NEAA+0.5mL GlutaMax+0.5mL双抗+38.5mL RPMI 1640Medium培养基，每50mL生长培养基中加1.25μL bFGF。

[0066] (7)基础生长培养基：7.5mL FBS+42mL DMEM高糖培养基+0.5mL双抗。

[0067] (8)75％酒精：37.5mL无水乙醇+12.5mL PBS。

[0068] 2.5.2猪肌内前体脂肪细胞分离的具体操作步骤

[0069] (1)7日龄的仔猪屠宰后先用流水冲洗干净，再用75％酒精清洗全身2‑3遍。

[0070] (2)将仔猪转移到细胞间的无菌台子上，用刀片沿仔猪的腹部中线划开，换新的刀片，取两侧背最长肌，放置在装有预热的1％ PBS的10cm培养皿中，并立即将培养皿转移到超净工作台中。

[0071] (3)取好的背最长肌先用75％酒精漂洗1次，再用预热的1％ PBS漂洗3次，用剪刀去除背最长肌表面的筋膜和多余的脂肪，并剪成黄豆粒大小的小肉块，便于进行后续的操作。

[0072] (4)将部分小肉块转移到5mL离心管中，加200μL预热的I型胶原酶，用剪刀将肉块剪碎成肉糜状，剪肉的时间尽量控制在1h以内。

[0073] (5)将全部剪碎的肉样转移到50mL离心管中，加入预热的I型胶原酶，加入量为肉样体积的2倍。

[0074] (6)50mL离心管用封口膜封口，并用保鲜膜将其全部包裹住，放入37℃水浴锅中消化2‑2.5h，震荡速度为50rpm。

[0075] (7)往消化好的肉样中，加入等体积的基础培养基终止消化，并依次用100、200和400目的过滤筛进行过滤，在过滤过程中用1mL蓝枪头的底部轻柔地搅动，以加快过滤速度。

[0076] (8)将过滤好的混合液吹打混匀并转移至15mL离心管，室温，2000rpm，离心12min。

[0077] (9)弃掉离心后的上清，每管加入5mL RPMI 1640培养基，重悬细胞，室温，1800rpm，离心10min。

[0078] (10)再次弃掉离心后的上清，按照每管中沉淀的体积，加入适量生长培养基，重悬细胞，将悬液转移至T25培养瓶，于37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0079] (11)细胞培养12h时，用预热的1％ PBS清洗细胞两遍，换新的生长培养基，于37℃，5％ CO2培养箱中继续培养。

[0080] 2.5.3猪肌内前体脂肪细胞的传代培养和冻存

[0081] (1)待细胞长到85％左右的密度时，弃掉生长培养基，用预热的1％ PBS清洗细胞2遍，加入提前预热的胰酶消化细胞。待细胞充分消化后，加入与胰酶等体积的基础培养基终止消化，重悬细胞，室温，1000rpm，离心5min。

[0082] (2)等待离心期间，准备两个新的T25培养瓶，各加入3mL基础生长培养基。

[0083] (3)弃掉离心后的上清，加入2mL基础生长培养基重悬细胞，向两个T25培养中各加1mL细胞悬液，水平摇晃混匀，于37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0084] (4)若需要进行细胞冻存试验，在步骤(3)弃掉上清液后，加入1mL细胞冻存液，重悬细胞后转移至细胞冻存管，做好标记，再转移至细胞冻存盒中并放于‑80℃冰箱中进行程序性降温。第二天，取出冻存盒中的细胞，转移至液氮罐中进行长期保存。

[0085] 2.5.4猪肌内前体脂肪细胞的复苏

[0086] (1)从液氮罐中取出需要复苏的细胞，放入一次性密封袋中，在37℃水浴锅中进行快速解冻，整个解冻时间不宜超过5min，防止持续的冰晶状态对细胞造成损伤。

[0087] (2)向解冻好的细胞悬液中加入3‑4mL基础培养基，重悬细胞并转移至15mL离心管，室温，1000rpm，离心5min。

[0088] (3)等待离心期间，向T25培养瓶中加入3mL基础生长培养基。离心完成后，弃掉上清液，向离心管中加入1mL基础生长培养基，重悬细胞后转移悬液至T25培养瓶，水平摇晃混匀，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。

[0089] 2.5.5猪肌内前体脂肪细胞的分化诱导

[0090] (1)诱导培养基的配制：5mL FBS+500μL双抗+14.5μL胰岛素+10μL DEX+5μL Rogs+5μL IBMX+5μL IDM，加高糖培养基补至50mL。

[0091] (2)待6孔板/12孔板的细胞生长到密度为85％左右时，即可添加诱导培养基，进入肌内前脂肪细胞的诱导分化阶段。

[0092] (3)从培养箱中取出细胞板，先用预热的1％ PBS清洗细胞1遍，再加入2mL(6孔板)/1mL(12孔板)预热的诱导培养基。每2d换一次新的诱导培养基，连续诱导8d。

[0093] (4)在显微镜下每2d观察一次细胞内脂滴的生成的情况。本试验中，在诱导分化的第3‑4d时，可以明显观察到小脂滴的出现；在诱导的第6d时，可以观察到密密麻麻的小脂滴；在诱导的第8d时，可以观察到很多小脂滴汇聚而成的大脂滴，此时可以根据试验目的收取细胞样品，进行后续操作。

[0094] 2.5.6TRIM72蛋白添加

[0095] 人TRIM72重组蛋白购买于美国NOVUS公司。TRIM72蛋白溶解于PBS中，之后立即分装重组蛋白溶液，并将样品存储在‑80℃下。当使用TRIM72蛋白处理猪肌内前脂肪细胞时，将TRIM72添加至诱导培养基中，按照猪肌内前体脂肪细胞的分化诱导程序处理猪肌内前脂肪细胞8d。

[0096] 2.6CCK8细胞活力检测

[0097] 使用Cel l Counting Kit‑8(CCK‑8)细胞增殖试剂盒检测添加TRIM72重组蛋白后，猪肌内前脂肪细胞的增殖情况，具体操作步骤如下：

[0098] (1)将12孔板1个孔的猪肌内前脂肪细胞接种至96孔板的8个孔内，于37℃，5％ CO2培养箱中培养12h；换新的基础生长培养基并加入不同浓度的TRIM72重组蛋白，继续放入培养箱中培养48h。

[0099] (2)在避光条件下，换新的培养基并向每孔中加10μL CCK8溶液，于37℃，5％ CO2培养箱中避光孵育2h。

[0100] (3)使用酶标仪测定450nm的吸光度值。

[0101] (4)根据：细胞活力(％)＝(处理组OD‑空白组OD)/(对照组OD‑空白组OD)×100％，计算细胞活力。

[0102] 2.7猪肌内前体脂肪细胞培养基提取

[0103] 移取分化8天的猪肌内前体脂肪细胞培养基至离心管中，4℃下以1500rpm的速度离心10分钟。之后立即分装上清液，并将样品储存在‑80℃下。尽量减少冻融循环。

[0104] 2.8猪骨骼肌卫星细胞培养和培养基提取

[0105] 猪骨骼肌卫星细胞购买于武汉赛奥斯生物科技有限公司。猪骨骼肌卫星细胞在生长培养基(5mL FBS+44.5mL DMEM/F12培养基+0.5mL双抗)中于37℃，5％ CO2培养箱中培养。

[0106] (1)待6孔板/12孔板的细胞生长到密度为85％左右时，即可添加诱导培养基(1mL马血清+48.5mL DMEM/F12培养基+0.5mL双抗)，进入骨骼肌卫星细胞的诱导分化阶段。

[0107] (2)从培养箱中取出细胞板，先用预热的1％ PBS清洗细胞1遍，再加入2mL(6孔板)/1mL(12孔板)预热的诱导培养基。每2d换一次新的诱导培养基，连续诱导8d。

[0108] (3)在显微镜下每2d观察一次肌管生成的情况。在诱导的第8d时，可以观察到有较为明显的肌管生成，此时可以收取细胞培养基，进行后续操作。

[0109] (4)移取分化8天的猪骨骼肌卫星细胞培养基至离心管中，4℃下以1500rpm的速度离心10分钟。之后立即分装上清液，并将样品储存在‑80℃下。尽量减少冻融循环。

[0110] 2.9油红O染色及甘油三酯含量测定

[0111] 2.9.1油红O浓储液和工作液的配制

[0112] (1)浓储液的配制：100mL 100％异丙醇+0.5g油红O干粉，上下颠倒混匀，使其充分溶解，若暂时不用需放在4℃避光保存。

[0113] (2)油红O工作液的配制：按照油红O浓储：ddH2O＝3:2的比例配制油红O工作液，配好的工作液用滤纸过滤2‑3次，直到工作液变得清澈且没有油红O粉末残渣即可用于后续染色。

[0114] 2.9.2油红O染色的具体步骤

[0115] (1)弃掉细胞板内的培养基，用PBS轻轻洗涤3遍，以洗净残留的培养基，加入没过细胞量的4％多聚甲醛溶液，室温，固定细胞30min。

[0116] (2)弃掉多聚甲醛固定液，用PBS轻轻洗涤细胞3遍，加入没过细胞量的油红O工作液，室温，避光染色30min。

[0117] (3)弃掉油红O工作液，用PBS轻轻洗涤细胞3遍，每次10min。

[0118] (4)细胞板的每个孔中加入1mL PBS，保持细胞湿润，置于显微镜下观察并拍照。

[0119] 2.9.3甘油三酯含量的测定

[0120] 拍照结束后，弃掉细胞板中PBS，每孔中加入400μL异丙醇，室温，避光静置10min，进行脱色处理。吹打混匀后，每孔取100μL脱色处理后的异丙醇于96孔板中，重复3次，使用全波长酶标仪测定样品在510nm的吸光度值。

[0121] 2.10Western blot具体步骤

[0122] 2.10.1总蛋白的提取

[0123] (1)组织总蛋白的提取：取组织样品置于2mL EP管中，加入500μL含1mM PMSF的RIPA裂解液和两粒磁珠，直至管中无块状组织，管内液体呈白色浑浊状即可。转移至离心机离心10min，条件为4℃，12000rpm。为防止样品降解，蛋白提取的所有操作均在冰上进行。

[0124] (2)细胞总蛋白的提取：弃掉细胞板中的培养基上清，小心清洗3遍，以洗净残留的培养基，6孔板每孔中加入200μL含1mM PMSF的RIPA裂解液，置于冰上，充分裂解15‑20min。吸取细胞裂解液于1.5mL EP管中，放于离心机离心10min，条件为4℃，12000rpm。

[0125] (3)提取后的总蛋白置于‑80℃冰箱中保存或立马测浓度并变性。

[0126] 2.10.2Wes tern blot具体步骤

[0127] (1)用RIPA稀释已知浓度的蛋白样品，使对照组和处理组的蛋白浓度相同，根据蛋白溶液体积与5×loading buffer体积为1:4比例充分混合，放入PCR仪中，99℃变性10min。

[0128] (2)等待变性的同时，配置电泳缓冲液和转印缓冲液，所用具体试剂及用量如表6和表7所示：

[0129] 表6电泳缓冲液

[0130]

[0131] 表7转印缓冲液

[0132]

[0133] (3)将预制胶安装在电泳槽上，取下预制胶的梳子并向电泳槽中倒入配置好的Running buffer。在预制胶的最左侧和最右侧孔中加入3‑5μL蛋白Marker，根据蛋白浓度，每孔加5‑15μL已变性的蛋白样品。盖上盖子，连接电源，120V恒压电泳60‑70min，直至蛋白Marker的条带明显分开即可停止电泳。

[0134] (4)按照已加样的预制胶的大小剪裁PVDF膜，并浸没在甲醇中5‑8min进行膜的激活。取下电泳好的预制胶，将预制胶和转印所需要的海绵和滤纸板提前浸泡在转印液中，按照转印板(白色)→海绵→滤纸板→纸VDF膜→预制胶→滤纸板→海绵→转印板(黑色)的顺序，将预制胶和PVDF膜紧密贴合，注意整个过程中不能有气泡。

[0135] (5)将转印板安装在置于冰水中的转印槽内，黑色转印板朝向负极，盖上盖子，90V恒压转印90min。

[0136] (6)转印完成后，从转印槽内取出PVDF膜，加入5％ BSA(由1×TBST配置)，置于40rpm的摇床上，室温封闭2h。

[0137] (7)封闭的同时，按照抗体说明书中WB建议的稀释比例，用1％BSA(由1×TBST配置)稀释一抗、二抗。

[0138] (8)将封闭好的PVDF膜放入干净的盒子中，按照目的蛋白的片段大小进行裁剪，加入配置好的一抗稀释液，置于40rpm的摇床上，4℃孵育过夜。

[0139] (9)第二天，取出PVDF膜，置于66rpm的摇床上，用1×TBST洗涤3次，每次10‑15min。向洗涤好的PVDF膜中加入配置好的二抗稀释液，置于40rpm的摇床上，室温孵育2h。

[0140] (10)将孵育好的PVDF膜，按照步骤(9)再次进行洗涤。

[0141] (11)将ECL试剂盒中的A液和B液按1:1的比例配制发光液，混匀后将膜放入其中孵育30‑60s，在GEL EQ凝胶成像系统中曝光并拍照。

[0142] 2.11数据处理与分析

[0143] 本试验的数据使用SPSS20.0软件进行统计分析，两组数据之间运用配对Student's t‑test分析。使用Image J.JS软件对图像的结果进行定量分析，运用GraphPad Prism vers ion 6.0软件绘图。数据均用平均数±标准误(SEM)表示。*表示P<0.05，差异显著；**表示P<0.01，差异极显著；ns表示P＞0.05，差异不显著。

[0144] 3.试验结果

[0145] 3.1猪TRIM72在肌肉中特异性表达

[0146] 实时荧光定量PCR检测发现在大白×长白二元杂仔猪和成年莱芜猪中，TRIM72均在背最长肌的表达量最高，在心、肝、脾、肺、肾和皮下脂肪中几乎不表达，见图1A‑B，说明TRIM72是肌肉特异性表达因子。

[0147] 3.2猪TRIM72由肌肉细胞分泌

[0148] 检测TRIM72蛋白表达发现其可以在分化第8天的猪骨骼肌卫星细胞培养基中表达，而不在分化第8天的猪肌内前体脂肪细胞培养基中表达，见图2，证实TRIM72可以由猪骨骼肌细胞分泌至细胞外发挥作用。

[0149] 3.3TRIM72蛋白水平与猪肌内脂肪含量相关

[0150] 在杜长大三元杂交猪和二花脸猪高低肌内脂肪含量群体中检测TRIM72蛋白表达，发现高肌内脂肪含量组的TRIM72蛋白水平均极显著高于低肌内脂肪含量组(P＜0.01)，见图3‑4，表明TRIM72蛋白含量与杜长大猪和二花脸猪的肌内脂肪沉积相关，TRIM72在不同猪种中都可以影响肌内脂肪沉积。

[0151] 3.4低浓度的TRIM72不影响猪肌内前体脂肪细胞的活力和增值

[0152] 鉴于猪和人TRIM72的蛋白序列相似度高达93.72％，说明人TRIM72重组蛋白完全可以用于猪的研究，因此使用人TRIM72重组蛋白来处理细胞。与未添加组相比，TRIM72重组蛋白添加量为50ng/mL时，猪肌内前体脂肪细胞的活力不受影响，而添加100和150ng/mL TRIM72重组蛋白时细胞活力极显著地受到了抑制(P＜0.01)，见图5。而且，添加100和150ng/mL TRIM72重组蛋白后细胞增殖标志基因Cyclin D1表达水平均极显著下降，增殖抑制基因P21表达水平显著上升(P＜0.05或P＜0.01)，但添加50ng/mL TRIM72重组蛋白组的Cyclin D1和P21 mRNA表达水平变化不显著(P＞0.05)，见图6A‑B，因此选择50ng/mL为TRIM72重组蛋白的适宜添加浓度。3.5TRIM72促进猪肌内前体脂肪细胞的脂质积累[0153] 添加TRIM72重组蛋白分化8天后，发现猪肌内前体脂肪细胞的脂滴明显增多，甘油三酯含量极显著增加(P＜0.01)，成脂分化相关基因PPARG蛋白水平在第8天也极显著升高(P＜0.01)，见图7A‑C。之后TRIM72重组蛋白分别处理肌内前体脂肪细胞0天、2天、4天和8天，发现TRIM72重组蛋白添加组的成脂分化基因PPARG和CEBPA从第4天开始显著上调(P＜
0.01)，成脂标记基因FABP4在第8天时显著上调(P＜0.01)，见图7D‑F，表明TRIM72可能在细胞分化中后期通过上调PPARG、CEBPA和FABP4等基因的表达来促进猪肌内脂肪细胞脂质积累。

[0154] 4.结果分析

[0155] 肌肉因子TRIM72能够在猪肌肉组织中特异性表达和分泌，在杜长大猪和二花脸猪中，高肌内脂肪含量个体的TRIM72蛋白水平均极显著高于低肌内脂肪含量个体，说明TRIM72的蛋白表达水平与不同个体肌内脂肪含量正相关，体外添加TRIM72可以通过在肌内前体脂肪细胞分化的中后期上调成脂分化相关基因PPARG、CEBPA和成脂标记基因FABP4的表达，增加肌内脂肪细胞的脂滴和甘油三酯水平，进而促进猪肌内前体脂肪细胞脂质的积累。

[0156] 本发明筛选到一个能够影响猪肌内脂肪沉积的新肌肉因子，获取了TRIM72对猪肌内前体脂肪细胞成脂分化的作用，通过改变TRIM72蛋白水平及对该基因蛋白量的检测，能够为改善猪肉中肌内脂肪的含量提供参考依据，同时对猪肉质改良也具有重要的应用价值。

[0157] 除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。