[0001] 本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种提高阳光玫瑰葡萄玫瑰香味道的果实膨大方法及其制备方法。

[0002] 阳光玫瑰(Shine Muscat)葡萄于2007年引入我国，经过十多年发展，种植范围遍布全国各地，因其具有果粒饱满、色泽清亮、香味浓郁等特点近年来吸引广大种植户的关注。

[0003] 在自然条件下，阳光玫瑰坐果率低、粒小、穗形散乱。目前在实际生产过程中广泛使用CPPU、TDZ、链霉素(SM)以及赤霉酸(GA3)以克服自然条件下的生产障碍。例如，施用GA3能使葡萄无核化，施用CPPU促进果实膨大。然而，植物生长调节剂的处理也会对水果品质产生不利影响，受经济利益驱使，有些种植户会盲目增加细胞分裂素的施用种类和使用量，造成有机酸、糖分、香气成分的大大降低，在味蕾和嗅觉上降低了阳光玫瑰品质。更重要的是，香气是决定水果风味品质的关键因素，它是消费者感知到的水果品质的主要决定因素。果实香气主要来源于挥发性化合物，主要包括酯类、醛类、萜类、醇类、苯类等物质。

[0004] 目前，植物生长调节剂的使用虽然能使阳光玫瑰产量得到提高，但植物生长调节剂的滥用使得果实香味消失，口感变差，阳光玫瑰的品质大大降低；因此，如何通过一种科学的方法既能提高产量又能尽量保障阳光玫瑰的品质是十分有必要的。

[0038] 下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0039] 实施例：

[0040] 1、材料和方法

[0041] 1.1、材料和方法

[0042] 田间随机选取长势健康，生长一致的阳光玫瑰葡萄作为试验材料。试验设3个处理，分别以CPPU(T1)，TDZ(T2)和CPPU+TDZ(T3)为主要试剂，以清水作为对照(CK)。分别在谢花初期、幼果期进行蘸穗、蘸果处理。各供试药剂处理浓度设计如表1所示。其中在谢花初期搭配链霉素施用，在幼果期搭配赤霉素施用。各处理分别选取长势一致且无病虫害的葡萄，每15株为1个重复，每个处理共3次重复，小区完全随机排列，其他田间管理按照常规大田进行。

[0043] 分别选择在果实膨大期，硬核期和成熟期采样，每次取样兼顾阴、阳两面及上中下不同部位，随机采样。采样时，在每个小区中随机选择15串，每串取6粒果实，共90粒，随机选取10粒进行单果重、硬度、可溶性固形物等指标测定；并切取一小部分进行石蜡切片的制作，其余果实迅速洗净擦干用锡箔纸包好后放入液氮冷冻5min，干冰运回实验室，样品采用液氮冷冻粉碎仪粉碎后混匀，取一部分送至上海派森诺生物有限公司进行转录组测序和非靶向代谢组分析，一部分用于品质指标的测定。

[0044] 各处理组处理试剂浓度设计如表1所示：

[0045] 表1各处理试剂浓度设计

[0046]

[0047] 1.2、测定指标及方法

[0048] 1.2.1、果实外观测定

[0049] 在果实成熟期间，使用电子分析天平测定30粒果实重量，分3次重复，计算单果重。用德国Bareiss蔬果硬度计HPE II Fff从每颗果实的果柄基部到底部取同一直线上中下三点测量，取均值计算果实硬度。用游标卡尺测量果实的纵横径，计算果形指数。

[0050] 1.2.2、果肉石蜡切片的观察

[0051] 果实结构的观察采用石蜡切片法从果实赤道处垂直于果皮取大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm的方块(包含果皮和果肉)放入FAA固定液固定1‑3d后，转入70％的酒精置4℃保存。固定组织经脱水，包埋，切片后进行脱蜡(二甲苯I 5 ‑10min，二甲苯II 5‑10min，无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，95％酒精5min，85％酒精5min，75％酒精5min，UP水浸泡
5min)至水，采用番红‑固绿染色(切片进入植物番红染色液加盖浸染2min，自来水快速洗去多余染液。然后切片依次进入50％、70％、80％乙醇快速分化，每次3‑5s。后用植物固绿染色液染色约6‑30s，去除切片稍滤干染液。切片经三次无水乙醇快速脱水，每次5‑10s。)，最后切片经二甲苯透明5min，用中性树胶封片。采用数码三目摄像显微镜(BA210Digital)在40倍视野下观察并采集图像。

[0052] 1.2.3、果实品质测定

[0053] 用MyBrix手持式折光率仪测定可溶性固形物含量，用酸碱中和滴定法测定可滴定酸含量，并计算糖酸比。用双抗一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定总糖和维生素C含量。

[0054] 利用LC‑MS/MS测定分析有机酸组分及其含量。样本前处理：称量50mg样本立即加入500μL 70％甲醇预冷液混匀，在4℃条件下12000r/min离心10min，吸取300μL上清液到1.5mL离心管中，‑20℃静置30min，4℃条件下12000r/min离心10min，移取200μL上清液至进TM
样瓶中，置于‑20℃保存待用。数据采集仪器系统包括型号为ExionLC  AD的超高效液相色谱(UltraPerformance Liquid Chromatography，UPLC)和型号为 6500+的串联质谱(Tandem Mass Spectrometry，MS/MS)。液相条件：采用ACQUITY HSS T3色谱柱(1.8μm 
100mm×2.1mm i.d.)；流动相A相为超纯水(0.05％甲酸)，B相为乙腈(0.05％甲酸)；梯度洗脱程序为：0min A/B为95：5(V/V)，8‑9.5min A/B为5：95(V/V)，9.6‑12min A/B为95：5(V/V)；流速0.35mL/min；柱温40℃；进样量22μL。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)温度550℃，正离子模式下质谱电压5500V，负离子模式下质谱电压‑4500V，气帘气(CUR)35psi。同时配制不同浓度梯度的标准品溶液后获取各浓度标准品对应的质谱峰强度数据；以外标浓度为横坐标，外标峰面积为纵坐标，绘制不同物质的标准曲线。研究中所检测的物质标准曲线线性方程线性良好，可用于定量分析。质谱数据采用MultiQuant3.0.3软件进行处理，通过参考标准品保留时间和峰型信息对待测物在不同样品中检测到的色谱峰进行积分矫正。将所测样本积分峰面积代入标准曲线方程进行计算，并将得到的值代入公式：样本中各物质的含量(ng/g)＝c*V/1000/m计算得到样品含量，其中c代表标准曲线中x值；V代表提取时所用溶液的体积(μL)；m代表称取的样本质量(g)。

[0055] 果实香气化合物的测定。采用美国安捷伦7890B‑5977A气相色谱‑质谱仪(GC‑MS)进行香气分析，利用液‑液萃取法萃取，采用CTC自动进样装置(Agilent，美国)上样检测，色谱柱为HP‑5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent)。色谱条件：进样口温度为40℃；柱温初始温度40℃保持2min，以2℃/min升至70℃，保持2min，以3℃/min升至120℃，再以5℃升至150℃，最后以10℃/min升至230℃，保持2min。质谱条件：载气为高纯He气(纯度≥
99.999％)，流速1mL/min，采用EI电离方式，电子能量70eV，离子源温度230℃，扫描质量范围50‑550Amu。样品前处理：利用液氮冷冻研磨仪将果实研磨呈粉末状，称取10g放入250ml锥形瓶中，加入10g优级纯硫酸铵，10ml二级水和20ml二氯甲烷后迅速封口，震荡混匀4℃冷藏过夜后萃取，取上层重复萃取2次，萃取时间为2h，合并有机相用无水硫酸钠脱水后，置于氮吹仪浓缩至1.5mL，用0.45μm滤膜过滤待测。利用质谱全离子扫描图谱，将检测出的挥发性成分通过与NIST Library提供的标准谱图进行匹配，并结合相关文献以确定最终成分。

[0056] 1.2.4、转录组测序分析

[0057] 转录组测序由上海派森诺生物科技有限公司完成，样品总RNA浓度及纯度采用nanodrop检测，完整性采用RNA专用琼脂糖电泳检测。选择总量≥1ug的total RNA，使用NEBNext Ultra II RNALibrary Prep Kit for Illumina试剂盒(New England Biolabs Inc；Ipswich，Massachusetts，USA)(链特异性建库试剂盒NEBNext Ultra Directional RNALibrary Prep Kit for Illumina)通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA 尾的mRNA，随后使用二价阳离子将mRNA随机打断。以打断的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物合成cDNA。纯化双链cDNA后进行双末端修复及3’端引入“A”碱基并连接测序接头。用AMPure XP beads筛选400‑500bp左右的cDNA，进行PCR扩增后使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies Inc,California，USA),Agilent High Sensitivity DNAKit(Agilent Technologies Inc,California，USA,5067‑4626)进行文库质量检测。利用Pico green检测文库总浓度(Quantifluor‑ST 
fluorometer,Promega，Madison，Wisconsin，USA,E6090；Quant‑iT PicoGreen dsDNAAssay Kit,Invitrogen，California,USA,P7589)，QPCR定量检测有效文库浓度(StepOnePlus Real‑Time PCR Systems,Thermo Scientific,Waltham，Massachusetts，USA)。样品上机测序后获得图像文件，用测序平台的软件进行转化，生成FASTQ的原始数据。原始数据经过滤得到高质量的clean reads。直接从基因组网站下载参考基因组和基因注释文件。使用TopHat2的升级版HISAT2将过滤后的Reads比对到参考基因组并进行比对结果的统计。使用HTSeq(v0.9.1)统计比对到每一个基因上Read Count值，作为基因的原始表达量。为了使不同基因、不同样本间的基因表达水平具有可比性，采用FPKM对表达量进行标准化(Nosrmalization)，FPKM(Fragments Per Kilo bases per Million fragments)是每百万片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目，对于Pair‑End测序，每个Fragments会有两个Reads，FPKM只计算两个Reads能比对到同一个转录本的Fragments数量。

[0058] 使用DESeq(v1.38.3)软件进行两个比较组合之间的差异表达分析。采用DESeq对基因表达进行差异分析，筛选差异表达基因条件为：表达差异倍数|log2FoldChange|>1，显著性P‑value<0.05。

[0059] 使用topGO(v2.50.0)进行GO富集分析，通过超几何分布方法计算P‑value(显著富集的标准为P‑value<0.05)，找出差异基因(all/up/down)显著富集的GO term，从而确定差异基因行使的主要生物学功能。使用clusterProfiler(v4.6.0)软件进行KEGG通路富集分析，重点关注P‑value<0.05的显著富集通路。

[0060] 1.2.5、qRT‑PCR验证分析

[0061] 将提取的样本总RNA，利用PrimeScript TM 1st stand cDNASynthesis Kit进行逆转录合成单链cDNA。使用Vazyme公司 qPCR Green Master Mix试剂进行实时荧光定量PCR(Real‑time quantitative PCR，qRT‑PCR)，通过在线网站primer设计qRT‑‑△△CT
PCR引物(见表2)，荧光定量PCR仪器为LightCycler480II,384。结果采用2 法计算基因相对表达量，3次生物学重复。

[0062] 表2qRT‑PCR引物序列

[0063]

[0064] 1.2.6、非靶向代谢组分析

[0065] 非靶向代谢组学分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

[0066] 色谱条件：样品采用Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC色谱柱进行分离；柱温25℃；流速0.5mL/min；进样量2μL；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；梯度洗脱程序如下：0‑0.5min，95％ B；0.5‑7min，B从95％线性变化至65％；7‑8min，B从65％线性变化至40％；8‑9min，B维持在40％；9 ‑9.1min，B从40％线性变化至95％；9.1‑12min，B维持在95％；整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。

[0067] Q‑TOF质谱条件：采用AB Triple TOF 6600质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集。样品经用Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)分离后，用Triple TOF 6600质谱仪(AB SCIEX)进行质谱分析，分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。

[0068] ESI源设置参数如下：雾化气辅助加热气1(Gas1)：60，辅助加热气2(Gas2)：60，气帘气(CUR)：30psi，离子源温度：600℃，喷雾电压(ISVF)±5500V(正负两种模式)；一级质荷比检测范围：60‑1000Da，二级子离子质荷比检测范围：25‑1000Da，一级质谱扫描累积时间：0.20s/spectra,二级质谱扫描累积时间0.05s/spectra；二级质谱采用数据依赖型采集模式(IDA)获得，并且采用峰强度值筛选模式，去簇电压(DP)：±60V(正负两种模式)，碰撞能量：35±15eV，IDA设置如下:动态排除同位素离子范围：4Da，每次扫描采集10个碎片图谱。

[0069] 数据分析流程：原始数据经ProteoWizard转换成.mzXML格式，然后采用XCMS软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。对XCMS提取得到的数据首先进行代谢物结构鉴定、数据预处理，然后进行实验数据质量评价，最后再进行数据分析。

[0070] 1.3、数据统计与分析

[0071] 所有测定指标均设置3次重复，所得数据为3次重复平均值，试验数据采用GraphPad Prism10软件进行统计分析，P<0.05表示差异显著。

[0072] 2、结果

[0073] 2.1、果实外形

[0074] 如图1所示，果实成熟期间，各处理组葡萄果实比对照体积大，且均具有显著差异。从果穗型上来看，处理组的果穗大且穗形均为紧凑型，CK果穗小且穗形较为松散；从果粒形状来看，CK3果粒较小，T31处理的果实呈椭圆形，T32处理的果实底部呈三角形，T33处理的果实最大且底部呈三角形。从果实横切面来看，CK3果实中含种子，处理后果实中均无籽，T31无空心，外形和CK3一致，T32和T33均出现空心现象，且T32的空心现象最严重。从表3可以看出，各处理均能有效增加单果重，纵径和横径。与CK3相比，T31，T32和T33的单果重依次增加了3.34％，53.30％和70.53％；纵径依次增加了6.65％，14.93％和20.21％；横径依次增加了的5.44％，23.63％和27.34％。

[0075] 表3成熟期果实基本理化指标的测定

[0076]

[0077] 注：小写字母表示p＜0.05

[0078] 2.2、葡萄果皮和中心果肉细胞结构观察

[0079] 如图2，通过观察各时期不同处理间果皮和中心果肉的细胞结构发现，亚表皮结构在膨大期发生了显著变化，与处理组相比，CK1亚表皮细胞小且排列致密。硬核期处理组亚表皮层数均增加，细胞排列致密，其中T21亚表皮细胞排列最紧密；同一视野观察下，处理组的细胞数量显著增加。从硬核期至成熟期发现，CK3薄壁细胞形状模糊，T31薄壁细胞完整并呈椭圆状，T32和T33薄壁细胞细胞壁不完整，形成了空洞或裂缝。

[0080] 2.3、果实品质

[0081] 如表5所示，与对照相比，处理组间硬度无显著差异。可溶性固形物含量从高到低依次为T32＞T33＞T31＞CK3，其中，T33与其他组间具有显著差异。总糖含量从高到低依次为T32＞T33＞T31＞CK3，维生素C含量从高到低依次为CK3＞T31＞T33＞T32；有机酸含量从高到低依次为CK3＞T32＞T31＞T33。

[0082] 除此之外，本公开采用靶向代谢技术共鉴定出36种有机酸组分(表4)。其中CK3鉴定出有机酸33种，T31鉴定出有机酸34种，T32鉴定出有机酸33种，T33鉴定出有机酸32种；且总有机酸含量高低依次为CK3＞T32＞T31＞T33。经分析发现，果实中酒石酸、L‑苹果酸、顺式乌头酸和乙酰丙酸含量较高。其中，酒石酸含量最高，占有机酸总量的81.46‑84.24％；L‑苹果酸和顺乌头酸分别占有机酸总量的13.38‑15.81％和0.57‑1.14％；其次是3‑羟基‑3‑甲基谷氨酸占有机酸总量的0.08‑0.6％；其他有机酸相对含量均不足1％。特别的是，T31增加了L‑苹果酸、顺式乌头酸、3‑羟基‑3‑甲基谷氨酸的含量，降低了酒石酸的含量；T32增加了酒石酸的含量，降低了L‑苹果酸、顺式乌头酸、3‑羟基‑3‑甲基谷氨酸的含量；T33增加了L‑苹果酸的含量，降低了酒石酸、顺式乌头酸、3‑羟基‑3‑甲基谷氨酸的含量。

[0083] 表4果实有机酸组分及其含量

[0084]

[0085]

[0086]

[0087] 注：N/A表示未检出

[0088] 如表5所示，葡萄果实共测定出109种香气化合物。其中包括17种酯类，18种醇类，12种酮类，10种醛类，13种烯萜类，11种苯类，4种酸类，15种烷烃类，9种其他类。不同处理下香气化合物种类发生了变化。CK3中鉴定出53种香气化合物，T31中鉴定出43种香气化合物，T32中鉴定出35种香气化合物，T33中鉴定出38种香气化合物(图3)。本公开发现CK3产生的酮、苯、酸和烷烃类化合物种类最多，T31产生的醇和醛类化合物种类最多，T32产生的烯萜类化合物种类最多，T33产生的酯类化合物最多。与CK3相比，T32和T33中烯萜类化合物的种类增加，T31中种类减少；T31和T33中醛类化合物种类增加；T33中酯类化合物种类增加，T31和T32酯类化合物种类减少。

[0089] 表5不同处理组果实香气化合物的种类和相对含量

[0090]

[0091]

[0092]

[0093]

[0094] 注：—表示未检出。

[0095] 如图3，CK3中香气化合物相对含量最高达76.46％。T32测定香气的相对含量最低为64.33％。其中，CK3中产生的苯、酸、烷烃和其他类香气化合物的相对含量最高，酯、醇和醛类在T33中的相对含量最高，酮和烯萜类在T32中相对含量最高(表6)。与CK3相比，处理组中酯和烯萜类相对含量增加；T31和T33中醛类相对含量增加，T32中醛类化合物的相对含量减少。

[0096] 不同处理间因产生化合物成分不同产生了独有的香气。CK3独有产生的庚酸丁酯、侧柏烯分别具有生苹果香气和特有的木香香气；T31独有产生的3‑蒈烯和己烯醛分别具有花香和蔬菜香气；T32独有产生的β‑萜品烯和反式‑β‑罗勒烯分别具有嫩叶香和草香；T33独有产生的橙花甲酸酯和p‑薄荷三烯分别具有橙花、玫瑰香和薄荷香。除此之外，还有D‑柠檬烯、壬醛、松油烯、异氟尔酮、篙酮和异胡薄荷醇等产生了不同的香气，增加了果实的风味。

[0097] 2.4、转录组测序分析

[0098] 2.4.1、差异表达基因分析

[0099] 不同处理与对照组相比，在膨大期，T11、T12和T13分别鉴定出861、1384和587个DEGs。这些DEGs包括上调基因408、852和278个，下调基因453、532和309个。在硬核期，T21、T22和T23分别鉴定出54、456和185个DEGs。这些DEGs包括上调基因41、293和147个，下调基因13、163和38个。在成熟期，T31、T32和T33分别鉴定出439、1001和1525个DEGs。这些DEGs包括上调基因167、319和426个，下调基因272、682和1099个。结果可知，在硬核期中鉴定出的DEGs的数量显著低于另外两个时期。根据差异分析的结果，统计到各比较组间存在共有特有差异基因，在膨大期，硬核期和成熟期各比较组共有DEGs分别为289、13和202个。这些数据均表明不同脲类细胞分裂素处理对果实不同时期均有影响。

[0100] 2.4.2、差异表达基因的KEGG富集分析

[0101] 通过KEGG富集分析揭示了不同时期各处理与对照比较间的差异基因参与的代谢途径。注释结果表明，在果实膨大期，CK1‑vs‑T11差异表达基因共参与到58条代谢通路，选择KEGG前20条代谢通路进行分析发现(图4)，富集程度较多的是内质网中的蛋白质加工、植物激素信号转导和玉米素生物合成；CK1‑vs‑T12差异表达基因共参与到75条代谢通路，其中富集程度较多的是内质网中的蛋白质加工、植物激素信号转导和玉米素生物合成；CK1‑vs‑T13差异表达基因共参与到52条代谢通路，其中富集程度较多的是植物激素信号转导、内质网中的蛋白质加工、ABA转运蛋白。

[0102] 在硬核期，CK2‑vs‑T21差异表达基因共参与到17条代谢通路，其中富集程度较多的是色氨酸代谢；CK2‑vs‑T22差异表达基因共参与到62条代谢通路，其中富集程度较多的是苯丙酸生物合成、植物激素信号转导、类黄酮生物合成和淀粉和蔗糖代谢；CK2‑vs‑T23差异表达基因共参与到33条代谢通路，其中富集程度较多的是植物激素信号转导、植物‑病原互作和脂肪酸延伸。

[0103] 在成熟期，CK3‑vs‑T31差异表达基因共参与到54条代谢通路，其中富集程度较多的是内质网中的蛋白质加工、苯丙酸生物合成和半乳糖代谢；CK3‑vs‑T32差异表达基因共参与到73条代谢通路，其中富集程度较多的是苯丙酸生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢、植物激素信号转导和内质网中的蛋白质加工；CK3‑vs‑T33差异表达基因共参与到99条代谢通路，其中富集程度较多的是苯丙酸生物合成、植物激素信号转导和类黄酮生物合成。

[0104] 结果表明，与多种途径相关的基因在不同时期发生了变化，脲类细胞分裂素诱导变化主要参与植物激素信号转导，调控与葡萄果实香气化合物合成相关的代谢途径的富集，包括脂肪酸代谢途径、氨基酸代谢途径等。

[0105] 2.4.3、相关基因分析

[0106] 在植物激素信号转导途径中，油菜素内脂激素(BR)信号转导过程涉及到的关键基因木葡聚糖内糖基转移酶(TCH4)在处理过程中发生了显著变化(图5)。与对照相比，处理组中TCH4基因表达量在果实硬核期均下调，膨大期时，TCH4基因在T11和T12中表达量上调。成熟期时，仅在T33中TCH4表达量均下调。

[0107] 本公开发现，膨大期LOXC在各处理组中的表达量均上调(图6)。随着果实的发育，在T31，T32和T33中的表达量均下调。与LOXC不同的是，果实膨大期各处理中ADH1和ADH2基因表达量均上调，硬核期，T21和T23中ADH1和ADH2表达量均上调，T22中ADH1基因表达量上调，ADH2基因表达量下调；成熟期ADH1和ADH2在T31中基因表达量均下调，在T32中ADH2基因表达量上调，ADH1基因表达量下调；在T33中ADH1和ADH2下调。氨基酸代谢途径中苯丙氨酸途径中涉及到的相关酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)参与香气化合物的合成，在果实生长过程中，与对照相比，处理组中PAL基因在不同时期发生变化。

[0108] 2.4.4qRT‑PCR验证

[0109] 为了验证RNA‑seq结果的可靠性，本公开筛选了4个差异表达基因进行qRT‑PCR验证。其中包括TCH4、HCT、LOX和ADH1。结果显示尽管RNA‑seq数据和qRT‑PCR数据间存在倍数上的差异，但差异表达基因的表达量变化趋势与转录组数据结果基本一致，表明转录组数据可靠。

[0110] 2.5、代谢组学分析

[0111] 基于UHPLC‑Q‑TOF‑MS分别对膨大期、硬核期和成熟期果实进行非靶向代谢组学分析，在样本中检测到10类共355种代谢物(图6)，其中脂质和类脂分子107种，苯丙和聚酮类52种，苯环型化合物50种，有机氧化合物39种，有机杂环化合物38种，有机酸及其衍生物29种，有机氮化合物19种，生物碱及其衍生物10种，核苷、核苷酸和类似物7种以及木脂素、新木脂素及相关化合物4种。根据结果分析了不同时期的聚类热图表明所有样品组间具有一定差异(图7)。

[0112] 2.5.1、差异代谢物分析

[0113] 基于log2|Fold Change|＞1，OPLS‑DA VIP>1和P value<0.05此筛选条件，统计出差异代谢物(DAMs)。结果表明，在果实膨大期产生的差异代谢物上调数量高于下调数量，硬核期产生的差异代谢物下调数量高于上调数量，成熟期中T32产生的差异代谢物上调数量大于下调，其他处理组产生的差异代谢物上调数量均小于下调数量。

[0114] 由韦恩图可知，果实膨大期不同处理间共有DAMs有9个；硬核期不同处理间共有DAMs有2个；成熟期不同处理间共有DAMs有5个。

[0115] 2.5.2、差异代谢物KEGG富集分析

[0116] 为进一步了解果实在生长发育过程中差异代谢物在代谢途径中的变化情况，利用KEGG数据库选择DAMs富集前20条KEGG通路进行差异代谢物的通路富集。结果发现(图8)，在果实膨大期，T11产生的DAMS富集在黄酮和黄酮醇的生物合成和次生代谢物的生物合成中，硬核期中T21产生的DAMs富集在碳水化合物、脂质代谢和氨基酸代谢、其他次生代谢物的生物合成中，随果实的生长发育，DAMs富集到碳水化合物、脂质代谢、次生代谢物生物合成中，在成熟期DAMs富集在黄酮和黄酮醇以及次生代谢物的生物合成中。

[0117] 在膨大期，T12产生的差异代谢物主要富集在脂质代谢和全局和概述图谱中；在硬核期，T22产生的DAMs富集在氨基酸代谢以及脂质代谢；随着果实的生长发育，DAMs富集在其他次生代谢物的生物合成、脂质代谢(以及碳水化合物代谢中；在成熟期DAMs主要富集到脂质代谢和全局和概述图谱中。

[0118] 在膨大期，T13产生的差异代谢物主要富集在氨基酸代谢、碳水化合物代谢、全局和概述图谱等途径中；硬核期中T23产生的DAMs富集在氨基酸代谢、碳水化合物、脂质代谢、辅助因子和维生素的代谢、其他次生代谢物的生物合成、萜类和多酮类的代谢中，随果实发育DAMs富集在其他次生代谢物的生物合成、脂质代谢、碳水化合物和氨基酸的代谢中；在成熟期，DAMs富集在氨基酸代谢、碳水化合物代谢和全局和概述图谱中。

[0119] 3、讨论

[0120] 3.1、脲类细胞分裂素影响葡萄的收获指标

[0121] 果实品质是决定水果商品性的核心要素，是影响水果生产和市场销售的关键因素。可溶性固形物、糖酸含量、维生素C含量等常作为评价果实的风味品质的收获指标。CPPU和TDZ对水果的品质有一定的影响，且中具有一定的差异。研究发现，在西瓜授粉前处理CPPU能增加果实可溶性固形物的含量。在猕猴桃中施用CPPU降低可溶性固形物、可滴定酸、糖和维生素C的含量。

[0122] 本公开发现，在阳光玫瑰中施用CPPU促进了TSS和总糖的积累，降低了维生素C和酸含量。有研究报道TDZ处理后果实TSS含量降低，且提高了滴定酸的含量。但在本公开中施用TDZ增加了TSS和总糖的含量。这些结论均表明脲类细胞分裂素对果实品质具有不同的影响，这可能和果实的种类，生长环境及处理时间和浓度等有关。

[0123] 有研究发现在开花前处理CPPU会导致细胞壁重新排列，这可能会影响果实的硬度。本公开中在硬核期使用CPPU处理后的果实薄壁细胞结构排列即规律又致密，与其他组相比细胞数量显著增加。

[0124] 因此，这种特异的细胞排列特性可能增强T31果实的硬度，水果的硬度决定了采收后的储存时间，CPPU处理能够延长水果货架期。而硬核期亚表皮层数和细胞数量的增多可能是脲类细胞分裂素促使果实重量和大小发生变化的原因之一。值得注意的是，到成熟期T32和T33果实薄壁细胞的细胞壁严重破裂，导致果实空心。

[0125] 3.2、果实表型与植物激素代谢、信号转导途径有关

[0126] 随着果实的生长发育，果实外观及大小均发生改变。TCH4是细胞壁水解酶内糖基转移酶/水解酶(XTH)家族成员中的一员，被称为XTH22，参与芸苔素内脂(BR)的合成和信号转导。有研究表明，XHT对水果的成熟和软化过程至关重要。TCH4通过参与新生木葡聚糖整合到细胞壁或降解过程，调控细胞壁的松弛，导致细胞壁重组，影响果实硬度。

[0127] 本公开中经过脲类细胞分裂素处理后膨大期各处理中TCH4基因表达量下调；硬核期T21中TCH4维持了较高的表达，有研究表明TCH4基因水平提高促进果形指数减小，因此CPPU的应用上调了TCH4表达，降低果实的果形指数。与硬核期相比，成熟期TCH4的表达量均下调，表明脲类细胞分裂素诱导TCH4参与调控果实的硬度。其中T33表达量下调较多，但T31的硬度最高，因此猜测脲类细胞分裂素诱导TCH4参与果实软化，但不是关键因子。这一结果为进一步解析CPPU和TDZ调控葡萄果实的形状和大小分子机制提供了理论依据。

[0128] 3.3、对香气化合物的组分和含量影响

[0129] 在果实成熟过程中会产生挥发性化合物，这些挥发性化合物是影响果实风味的关键因素。

[0130] 目前研究证明植物生长调节剂在调控果实挥发性化合物的生物合成中具有重要作用。有研究发现，CPPU降低了葡萄中萜类和芳香类化合物，值得注意的是，本公开中CPPU降低了阳光玫瑰中芳香类物质的相对含量，但增加了葡萄中萜类物质的相对含量。GA3+CPPU处理增加了葡萄中单萜、α‑萜醇、利那醇和柠檬烯的水平，降低了脂肪酸衍生化合物的水平。不同的是，本公开中CPPU处理除了增加葡萄中柠檬烯的水平，还增加特有的烯萜类和醛类物质，并使得醛类物质含量增加，但CPPU与TDZ搭配使用时柠檬烯的水平降低。以上这些差异可能与种植品种、施用外源物质的时间和浓度等有关。研究发现1.2ppm TDZ处理再生芽产生了大量单萜碳氢化合物。相似的是，在葡萄中施用TDZ产生了大量的烯萜类物质。TDZ和GA3联合处理后降低了葡萄挥发性化合物的总含量，结果与本公开一致。这些结论表明在阳光玫瑰葡萄上施用脲类细胞分裂素能诱导或抑制不同种类香气化合物的产生。

[0131] 3.4、果实香气合成与脂肪酸途径和氨基酸途径有关

[0132] 果实香气的形成是一个复杂的代谢过程，涉及许多基因和相关代谢途径。通过转录组学和非靶向代谢组学结合分析，随着果实的发育成熟，合成香气化合物相关的基因和代谢物主要富集在植物激素信号转导、脂肪酸、苯丙氨酸、酪氨酸和丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和次生代谢生物合成等代谢途径中。其中，脂肪酸代谢途径中亚麻酸和亚油酸是果实香气形成的重要前体物质，该途径中涉及到的相关酶有LOX和ADH等，这些酶与醛、酯和醇类等物质的形成相关，参与果实香气化合物的形成。

[0133] 本文发现膨大期ADH1和ADH2基因在处理组中的表达模式均一致，在硬核期和成熟期2个基因的表达模式出现了差异，CPPU促进ADH1和ADH2的表达，TDZ降低了ADH1的表达，抑制了ADH1的活性。本公开中ADH活性发生了不同变化，故脲类细胞分裂素参与调控醇类化合物的产生。

[0134] 苯丙氨酸代谢途径中PAL能直接或间接调控合成苯丙氨酸的骨架物质。有研究称CPPU在甜瓜果实中的应用干扰了苯丙氨酸代谢，影响了芳香酯的产生。相似的是，CPPU和TDZ处理后葡萄在成熟期均下调了PAL基因的表达量，可能影响芳香酯的产生。这些结论说明了TDZ和CPPU诱导关键酶合成香气的机制不同，导致香气的组分或比例产生差异，形成不同的风味。

[0135] 4、结论

[0136] 不同脲类细胞分裂素对果实品质和香气化合物的形成均产生不同的影响。结合转录组学和非靶向代谢组学分析表明，脲类细胞分裂素诱导植物激素信号转导途径、脂肪酸及氨基酸等代谢途径上相关基因的表达，同时诱导相关代谢产物在碳水化合物、次生代谢物生物合成、脂肪酸和氨基酸等代谢途径中发生动态变化，从而调控果实生长发育和果实香气的形成。在实际生产中可以根据市场不同需求选用不同的方案：

[0137] (1)选择施用CPPU葡萄穗行略松散，果粒小呈椭圆形，无籽且无空心现象，果实中的维生素C含量高，香味更加丰富；(2)选择施用TDZ葡萄穗行紧凑，颗粒略大且饱满，葡萄无籽存在空心现象，葡萄总糖和可溶性固形物含量高；(3)选择施用CPPU+TDZ使葡萄穗行紧凑，颗粒最大近似圆形且饱满，葡萄无籽存在空心现象，葡萄的玫瑰香味增加。

[0138] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。