[0001] 本发明涉及微生物菌剂技术领域，特别是涉及一种利用含海滨海芽孢杆菌的复合菌剂提高酿酒葡萄耐盐性的方法及应用。

[0003] 酿酒葡萄，作为世界范围内广泛种植且经济价值极高的水果作物，对土壤条件的敏感性尤为突出。它不仅要求土壤具备良好的排水性能，还需保持适宜的盐分水平和酸碱平衡。然而，在盐碱化日益严重的地区，葡萄植株常常表现出生长缓慢、根系发育不良、叶片黄化甚至枯死等现象，严重时还会导致结实率下降，果实品质劣化，给葡萄酒产业带来巨大的经济损失。因此，如何在不损害环境的前提下，提升葡萄植株对盐碱环境的适应性和耐受力，成为农业科学领域亟待解决的问题。

[0004] 正是基于这样的背景，微生物技术，尤其是特定微生物的生物修复和促生作用，展现出了巨大的应用潜力。海滨海芽孢杆菌，作为一种自然环境中常见的革兰氏阳性菌，其独特的生理特性使之能在高盐环境下存活并繁衍，这使得海滨海芽孢杆菌成为改良盐碱地、促进植物耐盐性提升的理想候选。但单独使用海滨海芽孢杆菌作为生物制剂对植物进行喷施，可能存在以下缺陷：海滨海芽孢杆菌主要针对的是水产养殖环境的优化，其特化的酶系和功能可能更适合分解水体中的有机物质、降低氮磷含量及改善水质。应用于植物喷施时，在促进植物生长、提高抗逆性或防治病虫害方面不如专门针对植物设计的生物制剂有效。植物叶片表面的微环境与水体环境差异较大，海滨海芽孢杆菌可能无法在植物叶面有效定殖、生长和发挥预期作用，导致效果打折。

[0005] 综上所述，开发得到效果好的复合微生物菌剂，不仅能够针对性地解决盐碱化土壤对酿酒葡萄种植的限制，还有望推动农业可持续发展，保障粮食安全与生态环境的和谐共生，其研究与实践意义重大。

[0019] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0020] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0021] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0022] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0023] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0024] 在贺兰山东麓产区的葡萄园进行实验，葡萄品种为蛇龙珠。

[0025] 海滨海芽孢杆菌(Bacillus litoralis)编号为SHBCC D70807、亚洲长生嗜盐古菌(Halovivax asiaticus)编号为SHBCC D50155和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)编号为SHBCC D73423，上述菌株均购买于上海保藏生物技术中心。

[0026] 海滨海芽孢杆菌在30℃和pH 7.0条件下发酵，发酵培养基组分为葡萄糖10.0g/L、蛋白豚5.0g/L、MgSO45.0 g/L、CaCI22.0 g/L；亚洲长生嗜盐古菌在40℃和pH 9.0条件下发酵，发酵培养基组分为葡萄糖30g/L、尿素0.5g/L、MgSO40.2g/L、KH2PO41.5g/L和0.05g/L氯化钠；巨大芽孢杆菌在35℃和pH 7.3条件下发酵，发酵培养基组分为麸皮12g、大米粉0.6g、玉米浆0.6g、碳酸钙0.4g、硫酸镁0.01g、磷酸氢二钾0.04g和氯化钠0.05g和纯净水18ml。

[0027] 实施例1

[0028] 一、实验方法

[0029] 复合菌剂的制备

[0030] 1、将活化后的海滨海芽孢杆菌、亚洲长生嗜盐古菌和巨大芽孢杆菌分别接种于对应的发酵培养基进行发酵，发酵结束后，发酵培养基中混合物即为培养物，对应为培养物1‑3，将培养物1‑3进行混合，将三者发酵得到的培养物按照活菌数比为3:2:1的比例混合，得
9
到总活菌数为1.0×10CFU/mL的复合菌剂。

[0031] 2、实验设计

[0032] 在同一个片区，挑选长势一致的葡萄幼苗进行定苗。均分为三组：

[0033] (1)蒸馏水处理组(CK组)，只喷施3mmol·L‑1蒸馏水，均匀喷洒至叶片的正反面，喷施量以葡萄叶片布满处理液而不滴落为标准；

[0034] (2)盐碱胁迫处理组，用盐碱处理液进行灌根盐碱胁迫处理(盐碱处理液：1L纯净水，1.16gNaCl，2.12g Na2CO3，15.12g NaHCO3，25.56Na2SO4，pH＝8.9)；

[0035] (3)复合菌剂处理组，先用盐碱处理液进行灌根盐碱胁迫处理，再喷施3mmol·L‑1复合菌剂处理组，均匀喷洒至叶片的正反面，喷施量以葡萄叶片布满处理液而不滴落为标准。各组于葡萄幼苗第三片叶展开后才进行处理。喷施处理15天后，取葡萄叶片、根尖部位，于‑80℃冰箱保存，用于各项生理和分子指标的测定。每个处理包含3个生物学重复。

[0036] 3、测定项目及方法

[0037] 3.1植株形态及干物质质量的测定

[0038] 使用直尺测量葡萄幼苗子叶节至绿色叶片最上端的距离；使用游标卡尺测量葡萄幼苗子叶节上端1cm处的宽度。使用自来水冲洗干净植株根部的土壤，对植株根系进行分析形态指标数据。用水清洗掉葡萄根系上的土壤和杂质，反复清洗2遍。洗净后使用滤纸吸干多余水分，将地上部与地下部分别放入信封中，将样品放到105℃的烘箱中进行杀青，30min后将烘箱温度调为80℃进行烘干，烘干后用万分之一天平进行称重，每个处理包含3次重复。

[0039] 3.2活性氧含量的测定

[0040] 采用碘化钾方法测定H2O2含量，将0.5g样品用0.1％三氯乙酸溶液研磨成匀浆后离心(4℃、12000g×20min)，取上清液0.5ml与反应液进行反应，测定在390nm下的吸光值，计2‑
算H2O2含量。采用盐酸羟胺法测定O 含量，将0.5g样品用预冷的磷酸缓冲溶液(PBS，PH 
2‑
7.8)研磨成匀浆后离心，取上清液0.5ml进行反应，测定530nm下的吸光值，计算O 含量。

[0041] 3.3抗氧化酶活性的测定

[0042] 采用氮蓝四唑(NBT)法和愈创木酚法来测定超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性；采用H2O2氧化还原法测定过氧化氢酶(CAT)活性；采用抗坏血酸法测定抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性。

[0043] 3.4丙二醛含量的测定

[0044] 采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛(MDA)含量：取0.5g样品，用pH7.8的磷酸缓冲液研磨呈匀浆后倒入10mL的离心管中，4℃离心，作为提取液。取0.5ml提取液与1mL的TBA混匀，100℃加热15min，冰浴后离心，吸取上清液用分光光度计测定并计算MDA含量。

[0045] 3.5可溶性糖含量的测定

[0046] 采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量：取0.1g样品，加80％(V/V)乙醇溶液，80℃水浴30min，冷去后离心10000g×15min，提取上清液，用80％乙醇清洗2次，装至10mL离心管中。吸取0.5mL提取液与2.5mL蒽酮试剂混匀，测定OD620的吸光值，每个样品重复测定3次，计算可溶性糖含量。

[0047] 3.6可溶性蛋白含量的测定

[0048] 采用考马斯亮蓝(G‑250)染色法测定可溶性蛋白含量(李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京:高等教育出版社,2000.)：取0.5mL提取液与2.5mL考马斯亮蓝溶液混匀，测定595nm波长下吸光值，计算可溶性蛋白。

[0049] 3.7脯氨酸含量的测定

[0050] 采用茚三酮显色法测定脯氨酸含量：称取0.3g样品，放入离心管中，加入3％的磺基水杨酸溶液，在水浴锅中加热10min，冷却后过滤为提取液。吸取1ml提取液，与1ml冰醋酸1.5ml 2.5％酸性茚三酮试剂混匀，在沸水浴中加热至液体呈红色。冷却后加入2ml甲苯，测定520mm波长下吸光值，计算脯氨酸含量。

[0051] 4、数据分析

[0052] 使用SPSS10.0软件进行数据的统计和分析。使用单因素方差分析(ANOVA)方法分析处理组间的显著性(P<0.05)。

[0053] 二、结果分析

[0054] 外源复合菌剂对盐碱胁迫下葡萄幼苗生长的影响

[0055] 1.1对株高及地上部生物量积累的影响

[0056] 为了研究复合菌剂对盐碱胁迫下葡萄幼苗生长的影响。本发明测定了盐碱胁迫下外源复合菌剂处理15天后葡萄幼苗的株高、总根长、茎粗、根鲜重、根干重、地上部鲜重及地上部干重。结果显示。与对照(CK)相比，盐碱胁迫处理显著降低了葡萄幼苗植株的株高(降低幅度为18.31％)、茎粗(17.23％)、叶鲜重(21.88％)、叶干重(28.51％)、地上部鲜重(15.39％)及地上部干重(19.23％)。与盐碱胁迫处理相比，本发明的复合菌剂处理能够显著增加葡萄幼苗植株的株高、茎粗、叶鲜重、叶干重、地上部鲜重及地上部干重。

[0057] 1.2对根系形态及生物量积累的影响

[0058] 为了研究外源复合菌剂对盐碱胁迫下葡萄幼苗根系生长的影响，本发明称量了幼苗根系鲜、干重。表1结果显示，与对照组相比，盐碱胁迫明显抑制了葡萄幼苗的根系生长。与对照(CK)相比，盐碱胁迫处理显著降低了葡萄幼苗植株的总根长、根表面积、根体积、根尖数、根鲜重、根干重。与盐碱胁迫处理相比，复合菌剂处理显著的增加了葡萄幼苗植株的总根长、根表面积、根体积、根尖数、根鲜重、根干重。

[0059] 表1复合菌剂对盐碱胁迫下葡萄幼苗根系形态及生物量的影响

[0060]

[0061] 1.3复合菌剂对盐胁迫下葡萄幼苗抗氧化防御能力的影响

[0062] 1.3.1对活性氧含量的影响

[0063] 本发明测定了盐碱胁迫处理组和复合菌剂处理组在处理15天后葡萄幼苗根系与2‑
叶片的O 和H2O2含量，结果显示，与盐碱胁迫处理组相比较，复合菌剂处理组能显著(P＜
2‑ 2‑
0.05)增加葡萄幼苗根系与叶片中O 和H2O2含量，根系中O 和H2O2含量升高幅度分别为
2‑
71.27％和56.37％，叶片中O 和H2O2含量升高幅度分别为57.61％和79.60％。

[0064] 1.3.2对抗氧化酶活性的影响

[0065] 本发明测定了盐碱胁迫处理组和复合菌剂处理组在处理15天后葡萄幼苗根系和叶片中的SOD、POD、APX及CAT含量，结果显示。与盐碱胁迫处理组相比较，复合菌剂处理组能(P＜0.05)提高葡萄幼苗根系和叶片中SOD、POD、CAT及APX含量，根系中升高幅度分别为23.41％、32.32％、74.52％及48.52％，，叶片中升高幅度为分别为29.74％、81.70％、
42.71％及61.33％。

[0066] 1.3.3对丙二醛含量的影响

[0067] 本发明测定了盐碱胁迫处理组和复合菌剂处理组在处理15天后葡萄幼苗根系与叶片中MDA含量，结果显示，与盐碱胁迫处理组相比较，复合菌剂处理组能显著(P＜0.05)增加了葡萄幼苗根系与叶片中MDA含量，根系中MDA含量升高幅度为68.42％，叶片中MDA含量升高幅度为124.53％。

[0068] 1.4外源复合菌剂对盐碱胁迫下葡萄幼苗渗透调节物质的影响

[0069] 1.4.1本发明测定了盐碱胁迫处理组和复合菌剂处理组在处理15天后葡萄幼苗根系与叶片的可溶性蛋白含量含量，结果显示：与盐碱胁迫处理组相比较，复合菌剂处理组能显著(P＜0.05)增加了葡萄幼苗根系与叶片中可溶性蛋白含量，根系中可溶性蛋白含量升高幅度为47.33％，叶片中可溶性蛋白含量升高幅度为55.19％。

[0070] 1.4.2本发明测定了盐碱胁迫处理组和复合菌剂处理组在处理15天后葡萄幼苗根系与叶片的可溶性糖含量，结果显示：与盐碱胁迫处理组相比较，复合菌剂处理组能显著(P＜0.05)增加了葡萄幼苗根系及叶片中可溶性糖含量。根系中可溶性糖含量升高幅度为33.15％，叶片中可溶性糖含量升高幅度分别为30.62％。

[0071] 1.4.3本发明测定了盐碱胁迫处理组和复合菌剂处理组在处理15天后葡萄幼苗根系与叶片的脯氨酸含量，结果显示：与盐碱胁迫处理组相比较，复合菌剂处理组能(P＜0.05)增加了葡萄幼苗根系及叶片中脯氨酸含量。根系中脯氨酸含量升高幅度为47.23％，叶片中脯氨酸含量升高幅度分别为36.54％。

[0072] 盐碱胁迫处理能够降低了葡萄幼苗的株高、根长、根体积、根尖数，表明盐碱胁迫能够对葡萄幼苗产生显著的生长抑制，并影响植株生物量的积累。喷施复合菌剂处理能够显著的缓解由盐碱胁迫导致的植株生长抑制，并增加植株的生物量累积。盐碱胁迫显著的增加了葡萄叶片和根系中活性氧及丙二醛(MDA)含量，并提高了抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性。本发明的复合菌剂处理后，能够显著的降低盐碱胁迫下葡萄叶片和根系中抗氧化酶的活性，降低活性氧和MDA的含量。这表明本发明所提供的复合菌剂可以直接或间接的参与盐碱胁迫下葡萄植株内活性氧的清除，从而降低盐碱胁迫引起的氧化损伤。

[0073] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。