[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株冷孢杆菌PeribacillusfrigoritoleransH11及其应用。

[0002] 土壤盐碱化现象导致土壤肥力显著降低，成为了农牧业发展的极大挑战。生物改良因其持久的脱盐效果以及对水土保持和生态平衡的积极影响，被普遍认为是当前最具生态效益的改良手段。

[0003] 在植物生长过程中，提高植物抗盐性往往是一个重要的课题，同时也是受多种植物促生菌代谢化合物的协同调控。植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria, PGPR）通过固氮、溶解磷酸盐来帮助植物吸收水分和养分。PGPR通过选择+ +性吸收K 并排除Na 等离子来维持植物体内的离子平衡，进而增强其抗盐性。当植物受到胁迫时，植物根际土壤细菌可以通过分泌酸性物质、离子螯合和交换酸化土壤，从而提高植物对土壤中磷的利用，从而提高植物抗胁迫能力，促进植物生长。

[0004] 芽孢杆菌是根际促生菌中最常见的分离内生菌类群之一，它通过激素合成、养分增溶和植物生物保护等过程，为促进植物生长提供了一种可持续和环境可接受的方法，并且由于芽孢杆菌具有较强的抗逆性，因此在根际促生菌中占据了重要地位。冷孢杆菌Peribacillus frigoritolerans（又叫耐寒芽孢杆菌），属于芽孢杆菌属，革兰阳性、需氧或兼性厌氧杆菌。 2024年，Joanna Ś wiątczak等发现冷孢杆菌Peribacillus frigoritolerans 2RO30在受控和自然条件下对油菜生长具有促进效果，同时显著提高了叶绿素含量指数和根长。研究里的受控条件为病原菌侵染，对照为正常的土壤，并未验证其对盐碱土的适应性以及改良效果。2022年，李文锋等发现冷孢杆菌Peribacillus frigoritoleransS2313对生物可降解地膜具有明显降解作用，8周后降解率可达12.45%，其降解过程可满足棉花、玉米等主要农作物对土壤湿度的需求。但是关于冷芽孢杆菌Peribacillus frigoritolerans的代谢产物以及固氮、解磷、解钾在其耐盐促生方面调控相关报道还尚少。

[0041] 本发明对盐碱土中的微生物进行分离、鉴定，筛选出具有促生功能的植物根际促生菌。利用混合盐模拟盐碱环境，进行单一菌剂植株盆栽试验，对植株生物量、农艺性状指标、植物叶片抗氧化酶活性进行检测，筛选出促生效果较好的菌株。以期为完善盐生生物耐盐机制、合理利用盐生生物根际促生菌改良盐碱土地提供参考依据。

[0042] 下述实施例中用到的培养基、试剂和设备来源如下：(1) Gibbons培养基（1L）: 酵母提取物10g，干酪素5.0g，氯化钾 2.0g。柠檬酸钠
3.0g，七水合硫酸镁2.0g，胰蛋白胨5.0g，氯化钠约100.0g，pH为9.0，121℃ 高压蒸汽灭菌
20min。

[0043] (2) 牛肉膏蛋白胨培养基（1L）: 胰蛋白10g，氯化钠5.0g，牛肉膏5g，调pH为 7.2~7.4，121℃ 高压蒸汽灭菌 20 min。

[0044] (3) LB培养基（1L）：10g 胰化蛋白胨（Tryptone）5g，  酵母提取物（Yeast extract）5g， NaCl 1mL，1mol/ L NaOH调pH为7.4，用去离子水定容至 1L，121℃高压下蒸汽灭菌20min。

[0045] (4) 蒙金娜无机磷培养基（1L）：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，KCl 0.3g，NaCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，Ca3(PO4)210g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0 7.5，115℃蒸汽灭菌，20min。~

[0046] (5) 蒙金娜有机磷培养基（1L）：葡萄糖 10g，(NH4)2SO40.5g，KCl 0.3g，NaCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO35g，卵磷脂0.2g，琼脂粉20g，蒸馏水 1000mL，pH为7.0 7.5，115℃蒸汽灭菌20min。
~

[0047] (6) 硅酸盐培养基（1L）：蔗糖5g，MgSO40.5g，CaCO30.1g，NaHPO42g，FeCl30.005g，玻璃粉1g，琼脂粉20g，pH为7.0；121℃高压灭菌20min。

[0048] (7) 阿须贝无氮培养基（1L）：K2HPO40.2g，NaCl 0.2g，Mg(SO4).7H2O 0.5g，CaSO40.2g，K2SO4·2H2O 0.2g，CaCO35.0g，葡萄糖10.0 g琼脂粉20g，蒸馏水 1000mL，pH为7.0；121℃高压灭菌20min。

[0049] 试剂仪器设备来源：分光光度计为T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），16S rRNA基因扩增引物为通用引物27F/1492R及细菌DNA提取试剂盒 （Takara，Japan），2×Taq Plus PCR Master Mix （Takara）； PCR仪（伯乐）；超净工作台 SW‑CJ‑2F（苏州安泰空气技术有限公司，离心机 H11‑I6K （湖南可成仪器设备有限公司），电子天平 FA1204B （上海天美天平仪器有限公司）。

[0050] 实施例1 菌株筛选及鉴定耐盐碱菌株的分离过程：采集呼和浩特市舍必崖村的盐碱土，称取5g盐碱土样，溶于45mL无菌水中，30℃、180r/min震荡30min，静置得到土壤原液。吸取上清液，将其稀释到‑4 ‑7
10 10 倍后，依次涂布到pH为9的牛肉膏蛋白胨培养基与Gibbons培养基上，30℃倒置培~
养5d。5d后在固体培养基上长出若干种单菌落，从中挑取不同类型的单菌落反复划线进行纯化，直到获得每种单菌落的纯化菌株。将挑取纯化到的纯菌株接种于10mL LB液体培养基中，过夜培养。带有菌株的LB培养液与80%甘油比例为2︰1混匀于1.5mL离心管中，编号保存于‑80℃冰箱。剩余菌株斜面培养基上30℃恒温培养2d后，存于4℃冰箱以进行后续试验。

[0051] 提高培养基盐浓度（NaCl）筛选：在LB液体培养基中添加NaCl，调节其浓度为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%共8个梯度。将活化好的菌株依次接种于不同浓度的LB液体培养基中，每株菌设置3个重复。接种后将培养基放置摇床180r/min，30℃振荡过夜培养，将菌液移至96孔板中，每4小时用酶标仪测其在620nm处的吸光度，绘制生长曲线，以揭示NaCl浓度对菌株生长的影响。

[0052] 菌株固氮能力的测定：采用划线接种法将将分离得到的菌株划线接种于阿须贝培养基上，30℃倒置培养。以“+” 代表菌株的固氮能力。划线第二天开始观察记录其生长情况，长出菌落记为“+++++”，延迟一天减少一个“+”，记录7d，观察菌株的固氮能力。

[0053] 菌株溶磷能力测定：将分离得到的菌株分别接种到蒙金娜有机磷培养基和蒙金娜无机磷培养基上，30℃培养5d后，观察筛选得到既解有机磷又解无机磷的菌。将其用牙签接种于蒙金娜培养基上30℃倒置培养至解磷圈无明显变化。观察测量解磷圈的大小，记录溶磷圈直径（D）、菌落直径（d），计算D/d，判断解磷能力的强弱。生长但未产生透明圈的菌株记“＋”；透明圈直径和菌落直径比1

[0054] 菌株解钾能力测定：用牙签将菌株接种到硅酸盐培养基上，30℃培养5d后观察菌落周围是否产生透明的解钾圈，判断其是否具有解钾功能。若菌株生长但未产生透明解钾圈，则标记为“+”；果透明圈直径和菌落直径的比值1＜D/d＜1.5，则标记为“++”；如果比值D/d≥1.5，则标记为“+++”。

[0055] 菌株产ACC脱氨酶能力测定：将目标菌株接种至 LB 固体培养基上，并在恒温 28°C 的环境条件下进行 24 小时的培养。培养结束后，从 LB 平板上精心挑选出单个菌落，再次接种至 DF 固体培养基。DF 培养基作为中间过渡的培养基，同样在 28°C 的恒温条件下进行 24 小时的培养。随后，将 DF 平板上生长状况良好的菌株进一步转接至 ADF 固体培养基上，每个转接过程均设立了三个生物学重复。在 28°C 的恒温培养条件下，继续培养 72 小时。最终，能够在 ADF 固体培养基中，以 1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸作为唯一氮源进行生长的菌株，将被判定为阳性菌株（标记为“+”），并将作为后续研究的对象。

[0056] 菌株产铁载体能力测定：将目标菌株接种于CAS固体培养基上，用无菌的枪头挑取适量的菌体点接在CAS平板上，每种菌设3个重复，在28℃下培养48h，在CAS检测平板上，分泌铁载体的细菌菌落周围会出现明显的橙色铁载体晕圈。记录平板上橙色晕圈的有无，并测定单菌落橙色铁载体晕圈直径和菌落直径的比值。产生橙色晕圈且橙色晕圈直径和菌落直径的比值小于1记“+”； 橙色晕圈直径和菌落直径的比值大于1且小于1.5的菌株记“++”；比值大于1.5的菌株记“+++”；“+”越多代表菌株具有越强的产铁载体的能力，而菌株周围未产生橙色晕圈菌株则标记为“‑”代表不产铁载体。

[0057] 从土壤中分离到的80株细菌中，通过提高培养基盐浓度（NaCl）筛选法筛选具有耐盐碱及促生能力的细菌菌株，筛选得到30株耐盐碱细菌。进一步验证其固氮、解磷、解钾能力后得到一株可以在pH值为9.0、盐浓度为8%的培养基上生长的具有固氮、解磷、解钾(图1)能力的细菌H11（图1）。提取细菌DNA，进行PCR鉴定后的序列测序（上海生工公司）以及系统发育树结果显示该菌为冷孢杆菌Peribacillus frigoritolerans。

[0058] 表1 细菌H11具有固氮、解磷、解钾能力。

[0059] 菌株PCR鉴定：使用TGuide S96 磁珠法土壤基因组 DNA 提取试剂盒完成核酸的提取。检测方法：使用酶标仪（厂家：基因有限公司Gene Compang Limited，型号 synergy HTX）对核酸进行浓度检测，根据进行检测扩增，扩增后 PCR 产物使用浓度 1%的琼脂糖进行电泳检测对完整性进行检测（如图2）。用引物27F（SEQ ID No.1，AGAGTTTGATCTTGGCTCAG）和1492R（SEQ ID No.2，GGTTACCTTGTTACGACTT）扩增菌株的16S rRNA全长。扩增后序列（SEQ ID No.3）与NCBI数据库对比，获得同源性较高的物种序列，对所选的序列进行最大似然分析Maximum Likelihood (ML)分析，并利用软件MEGA 11构建系统发育树。结果表明菌株H11与Peribacillus frigoritolerans的基因相似性最高为99.58%（图3）。

[0060] SEQ ID No.3 16s rRNAGCCGTGGCGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAGCGAATCGATGGGAGCTTGCTCCCTGAGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATACGTTCTTTTCTCGCATGAGAGAAGATGGAAAGACGGTTTACGCTGTCACTTATAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCAGAGTAACTGCTGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCCGAGACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAACCTGCGAAGGTAAGCGAATCCCATAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTCATGGAGCCAGCCGCCTAAGGTTGACAAGAGGG
所述H11在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养4d，菌落呈乳白色，菌落表面光滑、湿润、粘稠、凸起、且边缘整齐（图4）。革兰氏染色后的细胞形态如图5所示。

[0061] 此外，还进一步检测了H11菌株调节土壤pH的能力。具体操作如下：处理组：从呼和浩特舍必崖村采集回来的天然盐碱土与花卉营养土比例为2︰1混装在花盆中， 种植材料（马铃薯）以及菌液处理之前对其进行pH值进行测定，种植材料之后经过菌液处理三次（每隔10天浇灌一次），再让植物生长30天，种植后60天测定盆栽土壤的pH值。土壤pH值测定方法参照吕贻忠等著的《土壤学实验》进行。

[0062] 对照组：从呼和浩特舍必崖村采集回来的天然盐碱土与花卉营养土比例为2︰1混装在花盆中， 种植材料（马铃薯）之前对其进行pH值进行测定(同上)，后期只用水进行浇灌，材料种植后60天测定盆栽土壤的pH值。结果见表2。

[0063] 土壤养分含量测定：马铃薯种植后75天，每个处理采集土样3份，其有机质、全氮含量、有效磷和速效钾含量采用鲍士旦主编的《土壤农化分析》中的检测方法进行测定。结果见表3。

[0064] 土壤酶活性测定：马铃薯种植后75天，每个处理采集土样3份，用比色法测定磷酸酶，高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶，具体方法参考关松荫等编著的《土壤酶及其研究法》。结果见表3。
表2 土壤pH值测定
。

[0065] 表3土壤养分含量注：表格中a和b代表有统计学差异（P<0.05）。
实施例2 H11对马铃薯的生长影响
盆栽实验：将马铃薯发芽一致的种子播种于盐碱土与营养土比例为2︰1的花盆中，
10d后，选取20株长势一致的幼苗进行实验。

[0066] 菌液的配制：将菌株接种于5mL LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养12h，按1%接种量接种至20mL LB液体培养基中，培养12h后，4000rpm离心10min，倒掉上清再用无菌水稀释到20mL。每株幼苗接种2mL菌液，对照不做特殊处理，每个处理设置5个平行，每隔10d补交一次菌液共浇三次。

[0067] 形态指标的测定：马铃薯种植后60 天，测量植株株高、地上鲜/干重、地下鲜/干重。

[0068] 植物生理指标的测定：植株的过氧化物酶（POD）活性测定参照李小芳、张志良著《植物生理学实验指导（第5版）》88～89页进行，叶绿素含量参照张志良等著《植物生理学实验指导》52～53页进行。

[0069] 基础数据整理与分析：采用Excel 2021进行数据统计和图表制作，利用SPSS 27.0进行同一处理不同材料间的单因素ANOVA检验方差分析。 结果如图6～11所示。在盐碱土壤生长环境下，用所述菌株的菌液处理过的马铃薯植株比经对照水处理过的，生长情况明显更具优势。用H11的菌液对马铃薯进行处理，与空白对照相比，马铃薯株高、鲜重与叶绿素含量、POD活性与空白对照相比显著提高。说明菌株H11可以显著提高植物马铃薯对盐碱胁迫的耐受性。因此，所述菌株H11可以促进盐碱肋迫环境下马铃薯生长和发育，从而增加其生物量、提高盐碱土壤的利用率。