技术领域
[0001] 本发明属于植物分子遗传育种研究领域，提供了一种甜瓜叶色黄化性状紧密连锁的分子标记Site1888及其应用。
相关背景技术
[0002] 甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科重要的经济作物之一，以其独特的色、香、味而广受消费者喜爱，在国内外均有着广泛的栽培。叶片是植物进行光合作用的主要场所，叶片的颜色在很大程度上决定了植株的总光合生产力。然而，在甜瓜的栽培和育种过程中，常会遇到各种变异现象，其中叶色黄化突变体是较为常见的一种突变。叶色黄化突变体植株的叶绿素含量较低，光合速率下降，引起矮化、减产、致死等现象，对作物生长和经济产品的产量产生了严重的负面影响。在甜瓜中叶色黄化突变体子叶期即开始表现黄化，且黄化性状伴随整个生育周期。此外，黄化突变体甜瓜的植株矮化、细弱，果实偏小、商品性差，口感不佳、结实率低，严重影响了甜瓜的商品属性，直接导致了果农的甜瓜产量和经济价值下降。叶色黄化突变体的果实在成熟前果皮呈黄色，且幼果膨大迟缓，这种外观特征大大降低果实的商品性，因此及时预测并剔除甜瓜叶色黄化突变体，有利于促进甜瓜产品质量的提高。
解析甜瓜叶色黄化突变体形成发育的遗传基础与调控机理为研究叶色黄化突变体提供参考价值，对加快甜瓜叶色研究与分子育种进程具有重要的现实意义。
具体实施方式
[0022] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。
[0023] 本发明通过甜瓜叶色黄化突变体性状遗传机制和基因定位研究。利用叶色黄化突变体甜瓜品种ZT00091为母本，正常叶色甜瓜品种ZT249为父本，配制杂交组合，构建F2分离群体和F2:3家系，利用F2分离群体对甜瓜叶色黄化突变体基因进行初步定位，利用F2:3家系进行进一步精细定位，确定控制黄化叶色候选区域，设计与甜瓜叶色黄化突变紧密连锁的分子标记。
[0024] 具体实施方式一：本实施方式记载的是一种与甜瓜叶色黄化突变紧密连锁的分子标记Site1888，其引物序列为：
[0025] Site1888F：AACTTGTTCAGCCGGATTCA，
[0026] Site1888R：GGAATTTTTGACCAAAGGCA。
[0027] 上述分子标记Site1888的获得方法如下：
[0028] 1、甜瓜遗传群体的构建
[0029] 利用叶色黄化突变体甜瓜品种ZT00091为母本，正常叶色甜瓜品种ZT249为父本，配置杂交组合“ZT00091×ZT249”得到F1群体，将F1自交得到F2分离群体，将得到的F2分离群体自交获得F2:3家系。父本和母本杂交可以获得无数F1单株，这些单株的基因型和表现型是一致的，随机选择F1单株均可，自交获得F2，F2随机选择自交获得F2:3家系；
[0030] 2022年在黑龙江八一农垦大学航天育种基地各种植ZT00091(20株)、ZT249(20株)、F1单株(20株)，以及F2分离群体(193株)；2023年在大同航天育种基地种植F2:3家系(共320个家系，每个家系10株)，以上甜瓜材料均在温室大棚内种植，栽培方式为常规的水肥管理，单株授粉。
[0031] 2、基因组DNA的提取和基因池构建
[0032] 采用CTAB法提取320个F2:3家系的基因组DNA。
[0033] 3、InDel分子标记筛选
[0034] 通过对叶色黄化突变体甜瓜品种ZT00091及正常叶色甜瓜品种ZT249为父本进行高通量测序，得到两个亲本的基因组序列信息，分析比较两个亲本间差异性位点，利用BSA方法获得与甜瓜叶色黄化突变体紧密连锁的分子标记，共设计开发分子标记30对，在叶色黄化突变体甜瓜基因池和正常叶色甜瓜品种基因池之间进行PCR扩增和多态性筛选，共筛选到8对引物。如图1所示，根据甜瓜叶色黄化突变体性状连锁的分子标记，其中发现Site1888与甜瓜叶色黄化突变体性状紧密连锁。
[0035] 具体实施方式二：本实施方式提供了甜瓜叶色黄化突变体性状连锁的分子标记Site1888的方法，具体步骤如下：
[0036] (1)提取待测样品的DNA，采用分子标记Site1888进行PCR扩增。10μLPCR反应体系为：50‑100ng/μLDNA 1μL，Site1888引物上下游各1μL，Taq酶Mix 3μL，ddH2O 4μL。PCR扩增条件为：在95℃下预变性5min，在95℃变性30s，在55℃退火30s，在72℃延伸45s，第2步到第4步35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
[0037] (2)待测DNA样品经过PCR扩增后，电泳方式能检测出209bp片段的为叶色黄化突变体甜瓜材料，而片段大小为232bp的则是正常叶色甜瓜材料，如图2所示，M位DNA2000 Maker，1条带代表母本，叶色黄化突变体甜瓜ZT00091；2条带代表父本，正常叶色甜瓜ZT249；3条带为F1属杂合条带，表型为正常叶色；4‑11为条带与ZT00091相同的品种，叶色黄化类；12‑19条带与ZT249相同的品种，正常叶色品种；20‑27为条带中间型品种，后代可分离出叶色黄化表型，甜瓜叶色黄化性状鉴定准确率为100％。因此，通过紧密连锁标记的扩增能准确区分甜瓜叶色黄化突变体性状位点的不同基因型，达到辅助育种的目的。
