[0001] 本发明涉及药物载体技术领域，特别涉及一种纳米脂质体及其制备方法和应用。

[0002] 皮肤是一个完整的屏障，是阻止异物进入身体的主要防御机制。由于独特的解剖结构，即角质层紧密堆积、紧密连接和快速抗炎反应等，导致药物的皮肤渗透性差。皮肤分为三个层次：表皮、真皮和皮下组织。其中表皮主要分为两层，即非活表皮(角质层)和活表皮(透明层、颗粒层、棘层和基底层)。角质层是大多数药物和异物渗透皮肤的显著屏障，其屏障功能归因于亲水性角蛋白的独特排列，紧密包裹着疏水性层状脂质(神经酰胺、胆固醇、脂肪酸等)，及其包含的密集填充的死角质细胞，充满角蛋白。皮肤渗透的第二个物理屏障是活表皮，由活表皮中紧密连接的粘附膜蛋白组成。因此角质层的紧密堆积和活表皮中的紧密连接结构成为化妆品功效成分渗透皮肤的主要障碍。

[0003] 近年来，纳米脂质体已成为药物递送的最有效载体，并已成功应用于医药领域。核壳型脂质聚合物杂化纳米颗粒作为一种新型胶体纳米载体，由一个内部交联固体核心及外部磷脂层组成，结合了可生物降解聚合物纳米颗粒的机械优势和脂质体的仿生优势，已成为一种强大而有前景的递送平台，如磷脂壳聚纳米粒，目前已应用于眼部药物递送，具有高渗透吸收性、生物相容性、低毒性及缓释等特点。但现有技术中磷脂壳聚纳米粒对小分子水溶性药物的包封率不佳，且随着货架期延长易破乳析出或粒径逐渐增大，作为化妆品原料应用至护肤产品中很难保持良好的活性与稳定性。

[0064] 以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。

[0065] 图1为实施例纳米脂质体(LCS‑NPs)的制备流程示意图，下面参照图1，结合实施例进一步具体描述纳米脂质体的制备方案。

[0066] 实施例1

[0067] 称取0.200g壳聚糖(分子量为200000Da)，溶于10mL 2wt％醋酸溶液，待完全溶解后备用，按照油水比4:1量取液体石蜡，向其中加入2mL司盘80，充分搅拌后，在搅拌条件下将壳聚糖醋酸溶液倒入油相液体石蜡中直至形成较均匀的W/O乳液，用均质机以8000rpm的转速均质10min，得到W/O纳米微乳；称取三聚磷酸钠，使三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:2，配成水溶液在搅拌条件(700rpm)下以20滴/min的速度加入W/O纳米微乳中，持续搅拌
0.5h，搅拌完毕后破乳、冷冻干燥(‑45℃，0.1MPa，48h)，得到纳米壳聚糖微球；

[0068] 取4mg水杨酸和3.4mg甜菜碱溶于去离子水中配制成药物饱和溶液，取0.015g纳米壳聚糖微球分散在水杨酸与甜菜碱的水溶液中，超声1h，随后离心，去除上清液，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球，再将其分散到去离子水中，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液；

[0069] 分别称取0.102g大豆卵磷脂和0.018g胆固醇混合溶于5mL氯仿，于43℃70rpm旋蒸得到脂质薄膜，放入50℃真空干燥箱2h完全除去氯仿，向干燥的脂质薄膜中加入负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液，以超声10s停止5s的方式超声水化30min，再用1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm聚碳酸酯膜分别挤出3次，得到纳米脂质体(LCS‑NPs)。

[0070] 实施例2

[0071] 称取0.200g壳聚糖(分子量为200000Da)，溶于10mL 2wt％醋酸溶液，待完全溶解后备用，按照油水比4:1量取液体石蜡，向其中加入2mL司盘80，充分搅拌后，在搅拌条件下将壳聚糖醋酸溶液倒入油相液体石蜡中直至形成较均匀的W/O乳液，用均质机以7000rpm的转速均质10min，得到W/O纳米微乳；称取三聚磷酸钠，使三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:2，配成水溶液在搅拌条件(700rpm)下以20滴/min的速度加入W/O纳米微乳中，持续搅拌1h，搅拌完毕后破乳、冷冻干燥(‑45℃，0.1MPa，48h)，得到纳米壳聚糖微球；

[0072] 取4mg水杨酸和3.4mg甜菜碱溶于去离子水中配制成药物饱和溶液，取0.017g纳米壳聚糖微球分散在水杨酸与甜菜碱的水溶液中，超声1h，随后离心，去除上清液，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球，再将其分散到去离子水中，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液；

[0073] 分别称取0.102g大豆卵磷脂和0.018g胆固醇混合溶于8mL氯仿，于43℃70rpm旋蒸得到脂质薄膜，放入50℃真空干燥箱2h完全除去氯仿，向干燥的脂质薄膜中加入负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液，以超声10s停止5s的方式超声水化30min，再用1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm聚碳酸酯膜分别挤出3次，得到纳米脂质体(LCS‑NPs)。

[0074] 实施例3

[0075] 称取0.200g壳聚糖(分子量为200000Da)，溶于10mL 2wt％醋酸溶液，待完全溶解后备用，按照油水比4:1量取液体石蜡，向其中加入2mL司盘80，充分搅拌后，在搅拌条件下将壳聚糖醋酸溶液倒入油相液体石蜡中直至形成较均匀的W/O乳液，用均质机以7000rpm的转速均质10min，得到W/O纳米微乳；称取三聚磷酸钠，使三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:2，配成水溶液在搅拌条件(700rpm)下以20滴/min的速度加入W/O纳米微乳中，持续搅拌
0.5h，搅拌完毕后破乳、冷冻干燥(‑45℃，0.1MPa，48h)，得到纳米壳聚糖微球；

[0076] 取4mg水杨酸和3.4mg甜菜碱溶于去离子水中配制成药物饱和溶液，取0.013g纳米壳聚糖微球分散在水杨酸与甜菜碱的水溶液中，超声1h，随后离心，去除上清液，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球，再将其分散到去离子水中，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液；

[0077] 分别称取0.102g大豆卵磷脂和0.018g胆固醇混合溶于5mL氯仿，于43℃70rpm旋蒸得到脂质薄膜，放入50℃真空干燥箱2h完全除去氯仿，向干燥的脂质薄膜中加入负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液，以超声10s停止5s的方式超声水化30min，再用1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm聚碳酸酯膜分别挤出3次，得到纳米脂质体(LCS‑NPs)。

[0078] 实施例4

[0079] 称取0.200g壳聚糖(分子量为200000Da)，溶于10mL 2wt％醋酸溶液，待完全溶解后备用，按照油水比4:1量取液体石蜡，向其中加入2mL司盘80，充分搅拌后，在搅拌条件下将壳聚糖醋酸溶液倒入油相液体石蜡中直至形成较均匀的W/O乳液，用均质机以7000rpm的转速均质10min，得到W/O纳米微乳；称取三聚磷酸钠，使三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:2，配成水溶液在搅拌条件(700rpm)下以20滴/min的速度加入W/O纳米微乳中，持续搅拌
0.5h，搅拌完毕后破乳、冷冻干燥(‑45℃，0.1MPa，48h)，得到纳米壳聚糖微球；

[0080] 取4mg水杨酸和3.4mg甜菜碱溶于去离子水中配制成药物饱和溶液，取0.020g纳米壳聚糖微球分散在水杨酸与甜菜碱的水溶液中，超声1h，随后离心，去除上清液，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球，再将其分散到去离子水中，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液；

[0081] 分别称取0.102g大豆卵磷脂和0.018g胆固醇混合溶于5mL氯仿，于43℃70rpm旋蒸得到脂质薄膜，放入50℃真空干燥箱2h完全除去氯仿，向干燥的脂质薄膜中加入负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液，以超声10s停止5s的方式超声水化30min，再用1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm聚碳酸酯膜分别挤出5次，得到纳米脂质体(LCS‑NPs)。

[0082] 实施例5

[0083] 称取0.200g壳聚糖(分子量为200000Da)，溶于10mL 2wt％醋酸溶液，待完全溶解后备用，按照油水比3:1量取液体石蜡，向其中加入1mL司盘80，充分搅拌后，在搅拌条件下将壳聚糖醋酸溶液倒入油相液体石蜡中直至形成较均匀的W/O乳液，用均质机以7000rpm的转速均质10min，得到W/O纳米微乳；称取三聚磷酸钠，使三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:3，配成水溶液在搅拌条件(700rpm)下以20滴/min的速度加入W/O纳米微乳中，持续搅拌
0.5h，搅拌完毕后破乳、冷冻干燥(‑45℃，0.1MPa，48h)，得到纳米壳聚糖微球；

[0084] 取4mg水杨酸和3.4mg甜菜碱溶于去离子水中配制成药物饱和溶液，取0.020g纳米壳聚糖微球分散在水杨酸与甜菜碱的水溶液中，超声1h，随后离心，去除上清液，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球，再将其分散到去离子水中，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液；

[0085] 分别称取0.096g大豆卵磷脂和0.024g胆固醇混合溶于5mL氯仿，于43℃70rpm旋蒸得到脂质薄膜，放入50℃真空干燥箱2h完全除去氯仿，向干燥的脂质薄膜中加入负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液，以超声10s停止5s的方式超声水化30min，再用1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm聚碳酸酯膜分别挤出3次，得到纳米脂质体(LCS‑NPs)。

[0086] 实施例6

[0087] 称取0.200g壳聚糖(分子量为200000Da)，溶于10mL 2wt％醋酸溶液，待完全溶解后备用，按照油水比3:1量取液体石蜡，向其中加入1mL司盘80，充分搅拌后，在搅拌条件下将壳聚糖醋酸溶液倒入油相液体石蜡中直至形成较均匀的W/O乳液，用均质机以7000rpm的转速均质10min，得到W/O纳米微乳；称取三聚磷酸钠，使三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:3，配成水溶液在搅拌条件(700rpm)下以30滴/min的速度加入W/O纳米微乳中，持续搅拌
0.5h，搅拌完毕后破乳、冷冻干燥(‑45℃，0.1MPa，48h)，得到纳米壳聚糖微球；

[0088] 取8mg烟酰胺溶于去离子水中配制成药物饱和溶液，取0.020g纳米壳聚糖微球分散在水杨酸与甜菜碱的水溶液中，超声1h，随后离心，去除上清液，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球，再将其分散到去离子水中，得到负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液；

[0089] 分别称取0.102g大豆卵磷脂和0.018g胆固醇混合溶于5mL氯仿，于43℃70rpm旋蒸得到脂质薄膜，放入50℃真空干燥箱2h完全除去氯仿，向干燥的脂质薄膜中加入负载水溶性药物的纳米壳聚糖微球分散液，以超声10s停止5s的方式超声水化30min，再用1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm聚碳酸酯膜分别挤出5次，得到纳米脂质体(LCS‑NPs)。

[0090] 性能测试

[0091] 将实施例1～6中的纳米脂质体制成悬浊液保存，并用于性能测试。

[0092] 1、小分子水溶性药物包封率(EE)检测：

[0093] 采用紫外分光光度法检测实施例1～6纳米脂质体小分子水溶性药物的含量，并通过公式包封率(％)＝(m1‑m2)/m1×100％计算小分子水溶性药物包封率，其中，m1为小分子水溶性药物总量，m2为游离态小分子水溶性药物质量。

[0094] 2、粒径、多分散系数(PDI)：

[0095] 采用激光粒度仪Zetasizer Nano ZS90检测实施例1～5纳米脂质体的粒径和多分散系数(PDI)。

[0096] 3、Zeta电位：

[0097] 采用Zetasizer Nano ZS90检测实施例1和实施例5中纳米壳聚糖微球及纳米脂质体(LCS‑NPs)的Zeta电位值。

[0098] 4、快速稳定性实验：

[0099] 将实施例1～6中纳米脂质体的悬浊液常温保存，观察其出现分层、物质析出的时间。

[0100] 5、粒径稳定性：

[0101] 对实施例1～4中纳米脂质体进行粒径稳定性考察，将实施例1～4纳米脂质体的悬浊液放置于常温条件下，分别在制备当天、7天、1个月、2个月以及3个月，利用Zetasizer Nano ZS90检测其粒径变化。

[0102] 6、化学稳定性：

[0103] 对实施例1～4中的纳米脂质体进行化学稳定性考察，分别在制备当天、7天、1个月、2个月以及3个月，利用紫外分光光度法检测纳米脂质体小分子水溶性药物的含量，计算小分子水溶性药物包封率，再根据公式保留率(％)＝EEt/EE0×100％计算小分子水溶性药物保留率，其中为EEt测试当日的包封率，EE0为初始包封率。

[0104] 表1实施例1～6中纳米脂质体小分子水溶性药物包封率检测结果

[0105]检测项目 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6
包封率/％ 61.8 51.5 71.0 81.8 62.3 37.2

[0106] 表1为实施例1～6中纳米脂质体小分子水溶性药物包封率检测结果，由表1可知，实施例1～6中，纳米脂质体的小分子水溶性药物包封率可高达81.8％，而现有技术中纳米脂质体的小分子水溶性药物包封率约为20％，可见，本发明提供的纳米脂质体对小分子(分子量为50～300)水溶性药物的包封能力显著提升，更利于小分子水溶性药物的输送。

[0107] 表2实施例1～5中纳米脂质体的粒径和PDI检测结果

[0108] 测试项目 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5粒径/nm 171.0 195.4 190.2 188.0 218.7
PDI 0.298 0.254 0.300 0.191 0.327

[0109] 表2为实施例1～5中纳米脂质体的粒径和PDI检测结果，由表2可知，实施例1～5中纳米脂质体的平均粒径约为200nm，多分散系数的范围为0.191～0.327，多分散系数大多小于0.300，表明本发明提供的纳米脂质体分散性好，利于水溶性药物的透皮输送。

[0110] 表3实施例1和实施例5中纳米壳聚糖微球及纳米脂质体的Zeta电位值[0111]

[0112] 表3为实施例1和实施例5中纳米壳聚糖微球及纳米脂质体的Zeta电位值，由表3可知，纳米壳聚糖微球的Zeta电位值为正，纳米壳聚糖微球与脂质薄膜混合后，纳米脂质体的Zeta电位值变为负，表明壳聚糖与磷脂发生以静电作用为主要驱动力的自组装，脂质薄膜包裹在壳聚糖微球的外层，形成纳米脂质体。

[0113] 表4实施例1～6中纳米脂质体的快速稳定性实验结果

[0114]

[0115]

[0116] 表4为实施例1～6中纳米脂质体的快速稳定性实验结果，由表4可知，实施例1～6中纳米脂质体保持稳定性的时间大于等于23d，而实施例4中纳米脂质体在三个月内不会出现分层或析出的现象，稳定性较好。

[0117] 表5实施例1～4中纳米脂质体粒径稳定性测试结果

[0118]

[0119] 表5为实施例1～4中纳米脂质体粒径稳定性测试结果，由表5可知，实施例1～4中纳米脂质体在1个月内皆能保持较好的粒径稳定性，从实施例3和实施例4可以发现适当增加聚碳酸酯膜挤出的次数、减小小分子水溶性药物与纳米壳聚糖微球的质量比时，能够制备出粒径稳定性更优的纳米脂质体。

[0120] 表6实施例1～4中纳米脂质体化学稳定性测试结果

[0121]

[0122] 表6为实施例1～4中纳米脂质体化学稳定性测试结果，由表6可知，实施例1～4中纳米脂质体在1个月内对包载的小分子水溶性药物有较好的保留率，实施例3和实施例4中，纳米脂质体在3个月内对包载的小分子水溶性药物均有较好的保留率，表明本发明提供的纳米脂质体化学稳定性较好。

[0123] 由图1可知，本发明采用乳化‑离子凝胶法制备纳米壳聚糖微球，并与纳米脂质薄膜结合成形成包覆层，小分子水溶性药物包封于纳米壳聚糖微球中，再与脂质薄膜以静电作用为主的驱动力进行自组装结合形成纳米多层脂质体LCS‑NPs，制备方法简单，且所得LCS‑NPs对小分子(分子量为50～300)水溶性药物的包载能力较好。

[0124] 图2为纳米脂质体(LCS‑NPs)的结构示意图，由图2可知，本发明提供的纳米脂质体包括位于内部的小分子水溶性药物，以及依次包覆于小分子水溶性药物外部的纳米壳聚糖微球和脂质薄膜。该结构中，纳米壳聚糖微球具有空心结构，能够将小分子水溶性药物包裹于内部后再被脂质薄膜包覆，形成双包覆层，从而实现对小分子(分子量为50～300)水溶性药物的良好包覆性能。

[0125] 图3为纳米脂质体(LCS‑NPs)的透皮机理图，由图3可知，纳米脂质体与皮肤接触后，依次透过皮脂膜和角质层，壳聚糖使表皮的紧密连接结构打开，再配合外层脂质体在角质层的渗透，逐层透皮，发挥出强透皮促渗效果，将小分子水溶性药物传递进入皮肤内部。

[0126] 图4为实施例1中纳米脂质体(LCS‑NPs)的TEM图，由图4可知，实施例1中纳米脂质体为球状纳米颗粒，粒径约为200nm。

[0127] 本能发明提供的纳米脂质体，通过纳米壳聚糖微球与脂质薄膜形成的双包覆层将小分子(分子量为50～300)水溶性药物包覆于内部，纳米脂质体稳定性好，小分子(分子量为50～300)水溶性药物的包载率高，透皮促渗效果好，缓释能力好。本发明提供的纳米脂质体可以应用于乳、霜、精华、凝露、膏、面膜等化妆品的制备，因其稳定性好、透皮吸收效果好，在化妆品中可发挥增效作用。