[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及过表达PtoCC1基因在提高杨树生物量中的应用。

[0002] 木材是地球上最重要的可再生资源，是纸浆造纸家具等产业产品的主要原料。通过对现有主要速生树种进行遗传改良，提高木材产量和品质，是解决市场供需矛盾的一个重要途径。杨树本身作为一种全球广泛分布的经济速生树种，具有成材快、适应性强、分布广、品种多、易杂交、易改良遗传性、易繁殖等特点，因而广泛用于建造人工速生林。相对于利用常规杂交育种手段，分子技术育种手段，提供了快速、有效的途径。随着近年来遗传学、基因组学和分子生物学技术的发展，杨树成为了一种研究木材形成、多年生植物季节变化规律、生长发育、开花、性别决定以及生物互作的模式植物。因此，利用分子生物学和基因工程技术，提高杨树木材产量具有重要理论意义和应用价值。

[0003] 次生细胞壁是木材的主要成分，而纤维素作为植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富的生物聚合物。纤维素是由质膜定位的纤维素合酶(CesA)复合物(CSCs)合成的，这些复合物通常排列成六聚体玫瑰花环结构。研究表明，纤维素合酶复合体由皮质微管引导在质膜上以二磷酸尿苷葡糖（UDP‑葡萄糖）为底物，通过β‑1,4糖苷键连接的葡聚糖链合成纤维素，随后这些葡聚糖链通过分子内和分子间氢键的作用形成微纤维。这些微原纤维对细胞壁抗拉强度，对植物发育、细胞定向生长和植物株高至关重要。而在模式植物拟南芥中的研究表明：纤维素合成酶伴侣1（CC1）可以与CesA蛋白和微管相互作用。纤维素合酶活性对胞外和胞内信号的响应变化对于动态环境条件下的生长修饰至关重要。此外，体外和体内分析表明，CC蛋白的细胞质部分与微管相互作用，促进微管的形成和动力学。

[0004] 重要的是，CSCs和皮质微管是相互依赖的，因为其中一个的改变会影响另一个的活动。考虑到皮质微管和CSCs之间的密切联系，先前的研究多聚焦于验证：盐胁迫会影响细胞壁合成，而纤维素相关成分的损伤会改变盐耐受性。并在拟南芥中开展相关研究，通过构建CC1敲除株系，从而阐述了CC1在盐胁迫下维持纤维素持续合成的机制。CCs被证明是盐胁迫下皮质微管阵列和CSC活性恢复所不可或缺的，而CC1的微管相互作用是这一功能的关键。

[0005] 但这一研究具有相当的局限性。首先它是在拟南芥中进行的研究，缺乏对于次生壁纤维素合成的研究。而对于木本植物尤其是速生树种的生物量或次生壁纤维素的增加才是目前亟待解决的问题。其次是只构建了敲除株系，没有过表达CC1基因的相关表型。

[0006] 因此，亟需一种在木本植物中过表达CC1基因，研究CC1基因对木材次生发育和产量的影响。

[0016] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0017] 实施例1、PtoCC1基因植物过表达载体的构建PtoCC1基因植物过表达载体的构建方法，其步骤如下：
根据PtoCC1的CDS序列长度为960bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，通过同源重组的方式连接到Pcxsn‑35S载体骨架上，酶切位点为BamH I，得到载体Pcxsn‑35S::PtoCC1。
所用大肠菌种为DH5α，引物如下所示，载体构建示意图如附图1所示。

[0018] 正向引物：5’‑ACGAACGATACTCGAGGGATGCACGCCAAGACAGACT C‑3’（SEQ ID No.1），反向引物：5’‑CGGGGAAATTCGCTAGTATCATATGTGCAAGCCTCCTTGAG‑3’（SEQ ID No.2）。

[0019] 实施例2、毛白杨遗传转化本研究中杨树遗传转化采用的材料为野生型毛白杨，采用农杆菌介导的叶盘浸染法进行毛白杨遗传转化，转基因杨树的筛选标记为潮霉素。

[0020] 1）农杆菌的培养将构建的植物表达载体Pcxsn‑35S::PtoCC1转化农杆菌GV3101，然后将含有重组质粒的农杆菌GV3101接种到YEP固体培养基（含有相应抗生素）上，28℃倒置培养；挑取单克隆菌接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养至OD600为0.6～0.8；按1：100的比例将一活菌液转到新鲜的YEP培养基中，28℃培养，至OD600为0.6～0.8，4℃离心，收集菌体，用30 mL添加了乙酰丁香酮的WPM液体培养基重悬，放入28℃摇床中振荡培养1h。

[0021] 2）农杆菌介导的叶盘浸染2
取组培苗无菌叶片，在超净工作台上将其切成0.5×0.5 cm大小的叶盘，放入已
重悬好的农杆菌菌液中，浸染10 min，每隔2～3 min轻轻摇晃菌液，使叶盘被充分浸染。

[0022] 3）毛白杨的共培养将浸染过的叶盘，用灭过菌的镊子夹出，放在灭过菌的滤纸上，吸干菌液，将叶盘平铺在WPM共培养培养基上，在 25℃条件下暗培养2 d。

[0023] 4）毛白杨的选择培养共培养2 d后，将转化过的外植体移到可诱导愈伤组织的选择培养基上，25℃条件下，避光培养3～5周，期间每5 d左右更换一次新的选择培养基。

[0024] 5）毛白杨诱导芽培养当叶缘周围出现白色块状疏松愈伤组织时，在超净工作台上将愈伤组织移入WPM生芽培养基上，在25℃，光照培养约4～5周，每10 d更换一次新的WPM生芽培养基。

[0025] 6）毛白杨的生根培养当不定芽长至约5 cm时，将不定芽转入含有相应抗生素的WPM生根培养基中，诱导生根。

[0026] 7）毛白杨的移栽当幼苗根系比较发达时，将幼苗取出，冲洗掉根部的琼脂，移栽到温室中培养，并覆盖保鲜膜保温保湿。

[0027] WPM重悬液：（WPM粉+2.14 g+30 g蔗糖+100 μmol AS）；WPM共培养培养基：（WPM粉+2.14 g+30 g蔗糖+100 μmol AS+1.0 mg NAA+2.0 mg ZT）；
WPM选择培养基：（WPM粉+2.14 g+30 g蔗糖+9 mg Hyg+1.0 mgNAA+2.0 mg ZT+400 mg Cef）；
WPM生芽培养基：（WPM粉+2.14 g+30 g蔗糖+9 mg Hyg+0.1 mg NAA+2.0 mg ZT+
400 mg Cef）；
WPM生根培养基：（WPM+30 g蔗糖+9 mg Hyg+0.1 mg NAA+400 mg Cef）；
YEP培养基（L）：酵母浸出液10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH为7.0，121 ℃高温高压灭菌20 分钟。固体培养基在灭菌前加入琼脂粉10 12 g。
~

[0028] LB培养基（L）：酵母浸出液为5 g，蛋白胨为10 g，NaCl 为10 g，pH= 7.0， 121 ℃高温高压灭菌20 min。固体培养基在灭菌前加入琼脂粉10 12 g。~

[0029] 实施例3、转基因阳性苗的鉴定与宏观表型观察一、提取毛白杨总RNA和反转录合成cDNA
使用DEPC水将RNA提取所需要使用的药勺、研钵、研杵等浸泡过夜，高温高压灭菌后烘干备用。RNA提取试剂采用Axygen公司的试剂盒说明书进行操作，将所得RNA保存至‑80℃冰箱备用。具体步骤如下：
1）将取下的新鲜植物组织，迅速用锡箔纸包裹投入液氮中速冻；
2）在去RNA酶的研钵中，用液氮将样本充分研磨成粉；
3）将粉末转移至AG buffer中，充分震荡混匀至匀浆状，室温静置5‑10min
4）4℃冷冻离心，12000 rpm/min，10 min；
5）取上清至新的1.5 mL EP管中，精确估算上清体积加入0.5倍的无水乙醇，混匀；
6）将混合液转移至spin clum提取柱中，离心12000 rpm/min，1 min；
7）弃收集管中废液，在柱子中加入500 μL PG buffer，离心12000 rpm/min，1 min；
8）弃废液，在柱子中加入600 μL Wash buffer，离心12000 rpm，30 s；
9）重复步骤（8）一次；
10）弃废液，将空管离心12000 rpm/min，1 min，除尽滤膜上的液体；
11）在膜中央加入30‑50 μL RElution buffer，室温静置2 min，离心12000 rpm/min，1min，得到总RNA；
12）取1 μL RNA样品跑琼脂糖凝胶电泳，根据28 s和18 s观察RNA条带完整性检测提取质量。

[0030] cDNA的合成按照PrimeScriptTM RT reagentKit with gDNA Eraser反转录试剂盒(Takara)说明书进行，步骤如下：基因组DNA擦除：
（1）根据RNA浓度，加入1‑7 μL RNA样品（总量不超过1 μg）；
（2）加入2 μL 5×DNA消化酶buffer，1 μL DNA消化酶；
（3）用去RNA酶ddH2O将总体系补齐至10 μL；
（4）反应条件为42℃、2 min 30 s。

[0031] 第一链cDNA合成：在第一步反应体系中加入4 μL反转录buffer，1 μL Oligo dT随机引物，1 μL 反转录酶，4 μL去RNA酶水，最终反应体系为20 μL。

[0032] 反应条件为37℃，15 min反转录—85℃，5 s终止反应—4℃，5 min降温保存。

[0033] 二、设计目的基因靶点特异性引物和PCR扩增获得目的片段为了筛选过表达的转基因株系，利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real‑time PCR）技术，设计定量引物，通过内参对待测样品中的特定cDNA序列进行定量分析。

[0034] 正向引物：5’‑GGGTGCTAGTAAGCCACAAA‑3’（SEQ ID No.3）；反向引物：5’‑TCATATCAGTTGCCACTCCC‑3’（SEQ ID No.4）。

[0035] 鉴定后将WT与PtoCC1的两个阳性过表达株系进行扩繁培养后，选取健康的组培实验苗与同时期的野生型WT一起进行炼苗两周左右。随后标记节间，于25℃ 长日照条件（16 小时光照/8小时黑暗，光强10000 lux）的温室中培养2‑3个月，并进行宏观表型的拍照观察与取样，结果如图2中A所示。然后测定各植株高度和以标记节间为准的相对生长量以及相对生物量，结果如图2中B所示。对各植株的13‑16节间长度进行比较；对第8、12、16、20、24节间下端取完整横截面进行比较，结果如图2中C所示。对第9/13/17/21/24节间中段用游标卡尺测量茎粗数据如图2中D所示。上述结果表明，过表达株系株高高于WT，过表达植株的13‑16节间长度较野生型长，截面和茎粗更大，表明PtoCC1能够促进毛白杨生长。

[0036] 实施例4、PtoCC1过表达植株茎组织横截面切片的显微观察与统计光学显微镜下WT与PtoCC1过表达植株不同茎节间的组织横截面切片经甲苯胺蓝
染色成像结果如图3中A所示。各株系不同节间木质部细胞层数的统计如图3中B所示。扫描电子显微镜下WT与PtoCC1过表达植株不同茎节间的组织横截面切片经喷金后木质部纤维细胞成像如图3中C所示。各株系不同节间木质部纤维细胞细胞壁厚度的统计结果如图3中D所示。扫描电子显微镜下韧皮部纤维细胞成像如图3中E所示。

[0037] 上述结果显示，过量表达PtoCC1的转基因杨树与野生型比较，明显增高、增粗，且木质部细胞层数、细胞壁厚度均明显增多，说明PtoCC1基因是调控杨树木材的形成的关键调节基因，在林木基因工程领域和无性系林业领域有重要应用价值。

[0038] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。