技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及玉米基因ZmACO2在提高玉米产量中的应用，本发明的基因来源于玉米QTL qEL7.2，位于玉米第7染色体上，ZmACO2为qEL7.2的功能基因，该基因控制玉米雌穗穗长和/或行粒数重要产量性状。
相关背景技术
[0002] 玉米(Zea may L.)是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物，在保障世界粮食安全、经济发展及缓解能源危机等方面作用巨大。与1990年相比，我国2015年玉米总产量增加了2.32倍，但总产的增加主要依赖于种植面积的增加，单产提高对总产增加的贡献约35％～40％。由于土地供给的刚性制约，为满足我国国民经济持续发展对玉米的需求，提高玉米单位面积产量是遗传育种学科的重大课题。
[0003] 玉米产量是一个复杂的数量性状，在特定种植密度下，玉米单位面积产量由单穗籽粒产量与穗数决定；单穗籽粒产量又可进一步剖分为，穗行数，行粒数，百粒重。将玉米的产量性状剖分为不同的产量因子来研究，有利于解析产量性状形成的遗传学基础。穗长和行粒数是玉米产量的重要构成因子，与玉米的单穗产量显著正相关，解析穗长和行粒数的遗传学基础对于认知玉米产量形成的机理具有重要的意义，也为育种实践提供理论依据。
[0004] 鉴于此，本研究利用图位克隆技术，分离了一个位于玉米第7染色体上，可控制玉米穗长和行粒数的QTL qEL7.2，该基因为ZmACO2,编码1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminoc yclopropane-1-carboxylate oxidase2)，参与乙烯合成途径。基于连锁分析、基因过表达和基因敲除转基因家系的效应分析、自然群体中等位基因的效应分析、相关分子生物学分析，证实了该基因在控制穗长、行粒数和穗粒数等性状上的生物学功能，ZmACO2的遗传转化研究可为玉米育种提供基因资源和理论支撑。
具体实施方式
[0029] 以下实施实例进一步定义本发明，并描述了qEL7.02的精细定位、克隆及功能验证的方法。根据以下的描述和实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出适当的完善和修改，以使其适用各种用途和条件。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规分子生物学技术。
[0030] 实施例1：
[0031] ZmACO2克隆
[0032] 利用玉米第7染色体umc1393-umc1567区段的两个近等基因系：Ye478(国家农作物种质中心)和SL17(Zhou et al.,Euphytica,2015)，这两个近等基因系间杂交构建分离群体，开发分子标记，寻找交换单株，自交发展纯合交换家系(图1中A-F)；基于交换家系间的基因型和表现型的比较分析，将qEL7.2定位于标记M3和M4之间约50.8Kb的染色体区段，该区段仅编码一个氨基环丙烷羧酸氧化酶基因，命名为ZmACO2(图1中J)。
[0033] 分别提取Ye478和SL17植株叶片总DNA，根据玉米B73(国家农作物种质中心)基因组参考序列设计引物，在两材料间对ZmACO2基因PCR扩增并重测序，获得了ZmACO2基因完整的核苷酸序列(引物序列见表1，引物ID为1和2)和该基因的启动子核苷酸序列(引物序列见表1，引物ID为3和4，获得的启动子序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)。序列比对发现，该基因在TSS上游启动子区域，Ye478与SL17有多个SNPs和InDels的序列变异(图1中K)。
[0034] 分别提取Ye478和SL17雌穗的总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增获得了该基因完整的编码区CDS(引物序列见表1，引物ID为5，获得的CDS序列为SEQ ID NO.3所示)。这两个自交系ZmACO2编码区没有序列变异，均包含2个外显子，1个内含子，编码326个氨基酸(其序列为SEQ NO.4所示)。
[0035] PCR扩增程序：94℃预变性5min，然后以94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸90s，进行34个循环，最后72℃延伸10min。
[0036] 扩增体系：
[0037]成分 体积(μL)
10×Buffer(Mg+) 10
DNTP(10mM) 0.5
Taq(5U/uL) 0.2
Forward primer(5μM) 1
Reverse primer(5μM) 1
DNA(30ng/μL) 2
ddH2O 5.3
Total 20
[0038] 表1.本发明使用的引物及其序列
[0039]
[0040] 实施例2：玉米自然群体中ZmACO2的功能变异位点
[0041] 为明确玉米自然群体中ZmACO2的等位变异与穗长、行粒数表型的关系，对ZmACO2在214份玉米自交系中扩增重测序，进行候选基因关联分析。结果表明，共鉴定到4个SNP和1个7bp InDel显著性位点(p≤0.001)，这5个变异位点属于一个LD block(图2中A)，构成两种单倍型hap1和hap2(图2中B)。相对于Hap2单倍型，Hap1自交系材料的穗长(p＝6.95×10-5)和行粒数(p＝4.10×10-3)都显著增加(图2中C、D)。
[0042] 同时提取60份自然群体中的幼穗组织，采用TRIZOL试剂提取总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，使用基因特异性引物对(引物序列见表1，引物ID为6)进行定量PCR分析，结合自然群体中玉米穗长和行粒数的表型值，进行表达量与表型的相关性分析。结果表明，自然群体中ZmACO2的表达量越高，穗长越短，行粒数越少，呈极显著负相关(图2中E、F)。在60份自交系材料中，42份材料为Hap1单倍型，18份材料为Hap2单倍型，且ZmACO2在Hap2自交系中的表达量要显著高于在Hap1自交系中的表达量(图2中G)。这些结果说明，启动子区的变异影响ZmACO2的表达，进而影响玉米穗长和行粒数。
[0043] 实施例3：ZmACO2的表达分析
[0044] 提取Ye478和SL17约2mm和5mm幼穗组织，用TRIZOL试剂提取总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用基因特异性引物对(引物序列见表1，引物ID为6)进行定量PCR分析。在～2mm的幼穗组织中，ZmACO2基因在SL17的表达量是Ye478的约5倍；在～5mm的幼穗组织中，ZmACO2基因在SL17的表达量比其在Ye478中高1倍(图3)；推测该基因主要在玉米幼穗的前期高表达，进而影响玉米的穗长和行粒数等性状。
[0045] 实施例4：ZmACO2在玉米中的遗传转化
[0046] ZmACO2基因敲除的遗传转化是利用Ye478中ZmACO2全长CDS序列(SEQ ID NO.3所示)作为应用基因，根据网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行基因靶标设计，最终得到两个Guide RNA，用HindIII单酶切方法将Guide RNA连接到CPB-ZmUbi-hspCas9载体上(图7，引物序列见表1，引物ID为8)。然后再用CRISPR载体检测引物(引物序列见表1，引物ID为9)对得到的克隆进行测序，确定基因连接到载体上。将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介导的遗传转化到玉米自交系ZZC01(遗传转化由中国种子集团有限公司生命科学技术中心完成)。
[0047] 同样，超表达的遗传转化是利用Ye478中ZmACO2全长CDS序列(SEQ ID NO.3所示)作为应用基因，在引物上添加AscI的酶切接头(引物序列见表1，引物ID为10)，因此扩增得到的片段可以用限制性核酸内切酶AscI进行酶切，连接在载体pZZ01523(图8)，然后再用(引物序列见表1，引物ID为5)所示的引物对得到的克隆进行测序，确定基因连接到载体上。将得到的正确克隆质粒通过农杆菌介导的遗传转化导入到玉米自交系ZZC01(遗传转化由中国种子集团有限公司生命科学技术中心完成)。
[0048] 由此获得了5个以ZZC01为背景的玉米转化事件，包括两个Crispr-KO(KO#1，KO#2)及三个超表达转化事件(OE1,OE2,OE3)(图4中A和B)。在2018年春季考察了玉米穗长和行粒数的表型值，结果显示：KO#1、KO#2两个转化事件中，相对于阴性植株，ZmACO2基因功能缺失后，幼穗组织中乙烯的释放量降低38.5％(图4中C)，但是玉米的穗长分别增加了14.6％和24.3％(图4中D)，行粒数分别增加12.0％和27.3％(图4中E)；反之，在三个超表达事件OE1,OE2,OE3中，相对于阴性植株，ZmACO2基因的表达量提高2-4倍(图4中F)，幼穗组织中乙烯的释放量增加50.1％(图4中G)，而玉米的穗长有5.2％到14.3％的减少，行粒数有5.8％到
18.2％的降低(图4中H和I)。基于以上结果证明，降低ZmACO2的表达，使得幼穗中乙烯的释放量降低，从而提高了玉米的穗长和行粒数。
[0049] 实施例5：ZmACO2的功能鉴定
[0050] 根据B73参考基因组注释信息，ZmACO2编码一个1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，参与乙烯合成的最后一步反应。为了验证该基因的功能，体外原核表达ZmACO2基因的蛋白，在不同ACC的浓度下，用气相色谱仪来测定乙烯的释放量，结果表明随着ACC浓度的增加，乙烯的释放量也在增加，最终达到饱和的状态。同时我们将ZmACO2酶活性位点进行突变，作为阳性对照，结果显示乙烯的释放量几乎检测不到(图5中A)。进一步测定了Ye478和SL17材料不同大小幼穗中乙烯的释放量，结果表明SL17材料中乙烯的释放量都显著性的高于Ye478(图5中B)。这些结果表明，ZmACO2能够催化ACC释放乙烯，推测乙烯释放量的增加使得玉米的穗长和行粒数降低。
[0051] 实施例6：ZmACO2分子标记的开发与标记辅助育种
[0052] 基于候选基因关联分析结果，ZmACO2启动子区域中4个SNP和1个7bp InDel是引起自然群体中穗长和行粒数变异的重要位点。因此我们根据7bp InDel设计分子标记引物(引物序列见表1所示，ID：7)。
[0053] 在玉米分子标记辅助选择中，利用InDel7-F/R引物(引物序列见表1，引物ID为7)检测InDel-7bp的变异，以无7bp序列插入的等位基因作为优异的等位变异，它是控制玉米行粒数，穗长的功能位点之一，予以选择保留，可筛选得到更高产量的玉米。
[0054] 在Ye478和SL17扩增条带如图6所示，Ye478的扩增序列为SEQ ID NO.5所示，SL17的扩增序列为SEQ ID NO.6所示。
