[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及敲除PtoABAPT2基因在提高杨树生物量中的应用，还涉及提高杨树生物量的方法。

[0002] 木材是地球上最重要的可再生资源，是纸浆造纸家具等产业产品的主要原料。提高人工林生产力是实现“碳达峰、碳中和”国家战略目标的重要途径之一。目前我国的木材需求量约为8亿立方米，对外依赖度超过50％，是全球第一大木材进口国。随着全球性的天然林禁伐，我国木材供安全面临严峻的挑战。提高人工林生产力对保障我国木材安全具有十分重要战略意义。通过对现有主要速生树种进行遗传改良，提高木材产量和品质，是解决市场供需矛盾的一个重要途径。杨树本身作为一种全球广泛分布的经济速生树种，具有成材快、适应性强、分布广、品种多、易杂交、易改良遗传性、易繁殖等特点，因而广泛用于建造人工速生林。相对于利用常规杂交育种手段，分子技术育种手段，提供了快速、有效的途径。随着近年来遗传学、基因组学和分子生物学技术的发展，杨树成为了一种研究木材形成、多年生植物季节变化规律、生长发育、开花、性别决定以及生物互作的模式植物。因此，利用分子生物学和基因工程技术，提高杨树木材产量具有重要理论意义和应用价值。

[0003] 木材生物量是指树木中木质部分所含的生物质总量，是评估森林生产力和碳储存能力的重要指标。木材生物量的评估主要参考以下重要指标：1)株高：株高反映了树木在垂直方向上的生长状况。不同树种具有不同的遗传特性，这决定了它们的生长速度和最大高度潜力。2)茎粗：其反映了树木在水平方向上的生长状况。茎粗的增加与树木的生长速度密切相关。不同树种的茎粗增长速率也存在差异，这与其遗传特性有关。3)木质部层数：木质部是树木茎干的主要组成部分，木质部层数与树木的生长和木材的质量密切相关。4)细胞壁厚度：细胞壁作为植物光合作用碳储存的重要场所，是森林碳库的最重要组成部分。细胞壁是组成木材的主体，是速生林用材产量的主要影响因素，细胞壁厚度的增加通常伴随着木材产量的增加。同时，细胞壁是木材的主要承载部分，其厚度的增加会提高木材的机械性能，还有助于提高木材的耐久性和稳定性，使其更能抵抗外界环境的侵蚀和破坏。因此，细胞壁厚度在木材的结构性质与开发利用中起到决定性的作用。

[0004] 综上所述，株高、茎粗、木质部层数和细胞壁厚度都是评估木材产量和质量的重要指标，这些指标的增加意味着木材产量和质量的提升。在实际应用中，可选择合适的方法来提升上述指标，从而提高林木总生物量，木材产量和质量。

[0005] s‑酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程，通过硫酯键可逆地将一个酰基与半胱氨酸残基共价连接，通过这种翻译后修饰过程，蛋白质的性质发生了变化，s‑酰化在靶蛋白的运输、稳定性和活性的调节中的作用。通过蛋白质组学方法，已有数百种蛋白质被鉴定出有s‑酰化修饰，表明s‑酰化参与调节植物发育或应激反应。ABAPT家族参与蛋白的去s‑酰化修饰调控。研究表明ABAPT8介导的RIN4的去s‑酰化导致拟南芥和烟草叶片细胞死亡增加，ABAPT11将大多数BSK家族成员去s‑酰化，从而整合BR和SA信号来控制植物发育。但是迄今为止，尚无杨树ABAPT家族基因对木材产量提升的报道。

[0025] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0026] 实施例1、PtoABAPT2基因敲除植株载体的构建方法

[0027] 构建PtoABAPT2的CRISPR‑Cas9敲除载体，PtoABAPT2的编码序列如SEQ ID NO.1所示，利用target design网站在PtoABAPT2的编码区范围内确定四个合适的敲除靶点，再将T1‑T4靶点按顺序依次连接在pYLCRISPR/Cas9‑DH的Cas9载体骨架上，构建为四靶点的Cas9敲除载体，载体图谱如附图1所示，具体实验方法如下：

[0028] (1)利用targetDesign网站选取合适的打靶位点；

[0029] ABAPT5‑T1：5’‑TGGAAAGAAAGCGAACTTCG‑3’(SEQ ID NO.2)；

[0030] ABAPT5‑T2：5’‑TCGCCTTCGCATTAATCTTA‑3’(SEQ ID NO.3)；

[0031] ABAPT5‑T3：5’‑AACCAGTAAGTCCTTTTGAC‑3’(SEQ ID NO.4)；

[0032] ABAPT5‑T4：5’‑GTCAAAAGGACTTACTGGTT‑3’(SEQ ID NO.5)；

[0033] (2)靶点接头制备：

[0034] B1’：5’‑TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG‑3’(SEQ ID NO.6)；

[0035] B2：5’‑AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC‑3’(SEQ ID NO.7)；

[0036] B2’：5’‑TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG‑3’(SEQ ID NO.8)；

[0037] B3：5’‑AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC‑3’(SEQ ID NO.9)；

[0038] B3’：5’‑TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG‑3’(SEQ ID NO.10)；

[0039] B4：5’‑AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC‑3’(SEQ ID NO.11)；

[0040] B4’：5’‑TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG‑3’(SEQ ID NO.12)；

[0041] BL：5’‑AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC‑3’(SEQ ID NO.13)；

[0042] U‑F：5’‑CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG‑3’(SEQ ID NO.14)；

[0043] gRNA‑R：5’‑CGGAGGAAAATTCCATCCAC‑3’(SEQ ID NO.15)；

[0044] 将接头引物退火完成双链结合，反应条件：95℃1min，94℃30s循环至4℃30s，每一循环降1℃。

[0045] (3)利用边切边连的方法构建gRNA表达盒，边切边连反应体系和反应条件如下表1～2：

[0046] 表1、边切边连反应体系

[0047]

[0048] 表2、边切边连反应条件

[0049]

[0050] (4)第一轮巢式PCR扩增，提高靶点接头效率，反应体系和反应条件如下表3～4：

[0051] 表3、第一轮巢式PCR反应体系

[0052]

[0053]

[0054] 表4、第一轮巢式PCR反应条件

[0055]

[0056] (5)第二轮巢式PCR扩增，为每个gRNA表达盒首尾加上酶切位点，反应体系和反应条件如下表5～6：

[0057] 表5、第二轮巢式PCR反应体系

[0058]

[0059] 表6、第二轮巢式PCR反应条件

[0060]

[0061] (6)边切边连将每个gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9‑DH表达载体相连，反应体系和反应条件如下表7～8：

[0062] 表7、连接反应体系

[0063]

[0064] 表8、连接反应温度

[0065]

[0066] 边切边连后的连接产物即为四靶点的Cas9双敲载体(图1)，用于转化大肠杆菌，提取大肠杆菌的质粒，然后转化农杆菌用于后续的遗传转化实验。

[0067] 实施例2、毛白杨遗传转化

[0068] 本研究中杨树遗传转化采用的材料为野生型毛白杨，采用农杆菌介导的叶盘浸染法进行毛白杨遗传转化，转基因杨树的筛选标记为潮霉素。

[0069] 1)农杆菌的培养

[0070] 将构建的植物敲除载体PtoABAPT2转化农杆菌GV3101，然后将含有重组质粒的农杆菌GV3101接种到YEP固体培养基(含有相应抗生素)上，28℃倒置培养；挑取单克隆菌接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养至OD600为0.6～0.8；按1：100的比例将一活菌液转到新鲜的YEP培养基中，28℃培养，至OD600为0.6～0.8，4℃离心，收集菌体，用30mL添加了乙酰丁香酮的WPM液体培养基重悬，放入28℃摇床中振荡培养1h。

[0071] 2)农杆菌介导的叶盘浸染

[0072] 取组培苗无菌叶片，在超净工作台上将其切成0.5×0.5cm2大小的叶盘，放入已重悬好的农杆菌菌液中，浸染10min，每隔2～3min轻轻摇晃菌液，使叶盘被充分浸染。

[0073] 3)毛白杨的共培养

[0074] 将浸染过的叶盘，用灭过菌的镊子夹出，放在灭过菌的滤纸上，吸干菌液，将叶盘平铺在WPM共培养培养基上，在25℃条件下暗培养2d。

[0075] 4)毛白杨的选择培养

[0076] 共培养2d后，将转化过的外植体移到可诱导愈伤组织的选择培养基上，25℃条件下，避光培养3～5周，期间每5d左右更换一次新的选择培养基。

[0077] 5)毛白杨诱导芽培养

[0078] 当叶缘周围出现白色块状疏松愈伤组织时，在超净工作台上将愈伤组织移入WPM生芽培养基上，在25℃，光照培养约4～5周，每10d更换一次新的WPM生芽培养基。

[0079] 6)毛白杨的生根培养

[0080] 当不定芽长至约5cm时，将不定芽转入含有相应抗生素的WPM生根培养基中，诱导生根。

[0081] 7)毛白杨的移栽

[0082] 当幼苗根系比较发达时，将幼苗取出，冲洗掉根部的琼脂，移栽到温室中培养，并覆盖保鲜膜保温保湿。

[0083] WPM重悬液：(WPM粉+2.14g+30g蔗糖+100μmol AS)；

[0084] WPM共培养培养基：(WPM粉+2.14g+30g蔗糖+100μmol AS+1.0mg NAA+2.0mg ZT)；

[0085] WPM选择培养基：(WPM粉+2.14g+30g蔗糖+9mg Hyg+1.0mgNAA+2.0mg ZT+400mg Cef)；

[0086] WPM生芽培养基：(WPM粉+2.14g+30g蔗糖+9mg Hyg+0.1mg NAA+2.0mg ZT+400mg Cef)；

[0087] WPM生根培养基：(WPM+30g蔗糖+9mg Hyg+0.1mg NAA+400mg Cef)；

[0088] YEP培养基：酵母浸出液10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH为7.0，121℃高温高压灭菌20分钟。固体培养基在灭菌前加入琼脂粉10～12g。

[0089] LB培养基：酵母浸出液为5g，蛋白胨为10g，NaCl为10g，pH＝7.0，121℃高温高压灭菌20min。固体培养基在灭菌前加入琼脂粉10～12g。

[0090] 实施例3、转基因阳性苗的鉴定

[0091] 利用CTAB法对30株转基因组培苗进行DNA的提取，具体步骤如下：

[0092] 1)取10mL离心管一支，加入3mL CTAB溶液(100M pH 8.0Tris‑HCl，20mM EDTA，1.4M氯化钠，2％ PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，121℃高压灭菌20分钟后室温保存)和90μLβ‑巯基乙醇(终浓度为3％)，65℃预热；

[0093] 2)取约2.6g杨树新鲜叶片于液氮中研磨成粉末，转移至步骤1)中CTAB提取液中，混匀；

[0094] 3)65℃水浴45分钟，每隔15分钟剧烈振荡混匀一次；

[0095] 4)室温静置5分钟后加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)溶液，剧烈颠倒混匀后平放乳化10分钟；

[0096] 5)1000rpm，离心10分钟，吸取上清到新的离心管中，重复步骤4)一次；

[0097] 6)1000rpm，离心10分钟，吸取上清到新的离心管中，加入等体积‑20℃预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀后12000rpm，离心10分钟；

[0098] 7)倒掉上清，并用500μL 75％乙醇溶液清洗沉淀两次；

[0099] 8)尽量倒净上清，并在37℃恒温烘箱烘干沉淀至透明；

[0100] 9)加入50μL含有RNA酶的无菌水溶解沉淀并消化RNA；

[0101] 之后设计引物扩增包含PtoABAPT2敲除靶点的DNA片段，利用胶回收试剂盒回收目标DNA，具体步骤如下：

[0102] 1)将含有目的条带的琼脂糖凝胶切下，放入2mL离心管；

[0103] 2)加入3倍凝胶体积的Extraction Buffer；

[0104] 3)65℃水浴锅直至凝胶融化；

[0105] 4)如果目的片段小于500bp可加入与凝胶等体积的异丙醇；

[0106] 5)将混合溶液转移至Spin column内，6000g离心1分钟，弃去管内液体；

[0107] 6)向Spin column中加入500μL Extraction Buffer，12000g离心1分钟，弃去管内液体；

[0108] 7)向Spin column中加入500μL Wash Buffer，12000g离心1分钟，弃去管内液体；

[0109] 8)重复步骤7)一次；

[0110] 9)空柱12000g，离心1分钟；

[0111] 10)将Spin column转移至新的1.5mL离心管，加入30μL Elution Buffer，室温静置2分钟，12000g，离心1分钟；之后将回收的目的DNA片段与PMD19载体进行连接，反应体系如下表9所示：

[0112] 表9、DNA片段与PMD19载体进行连接体系

[0113]

[0114] 反应条件：16℃，8小时。之后将所得载体进行大肠杆菌转化，具体步骤如下：

[0115] 1)将制备好的大肠杆菌感受态细胞和待转质粒按照10:1的比例混合，冰上放置30分钟；

[0116] 2)42℃热激90秒钟，立刻置于冰上，静置2分钟；

[0117] 3)加入800μL无筛选压的LB液体培养基，37℃，200rpm，复苏1小时；

[0118] 4)4000g离心5分钟；

[0119] 5)弃上清，留约100μL培养基重悬菌体涂于对应抗性的LB培养基，37℃培养。之后利用PMD19通用引物进行菌落PCR筛选阳性菌落，反应条件如下表10～11：

[0120] 表10、PCR反应体系

[0121]

[0122] 表11、PCR反应条件

[0123]

[0124] 对所挑取的阳性克隆进行测序，通过利用DNAMAN进行序列比对，确定了L7和L13为阳性转基因株系，其突变位点如附图2所示。进行组培苗无菌培养，练苗移栽，用于后续实验。通过测定PtoABAPT2的敲除转基因株系与对照组野生型毛白杨的宏观表型指标，结果显示转基因株系相较野生型毛白杨，在株高、茎粗和生物量方面都呈现明显的优势，如附图3所示。

[0125] 实施例4、木质部宽度和木质部细胞层数测定

[0126] 通过振荡切片机对转基因株系和对照组野生型毛白杨的第十节间进行切片观察，通过甲苯胺蓝染色观察木质部的发育状况，测定统计相应株系的木质部宽度和木质部细胞层数，来表征木质部的发育情况，结果表明，与野生型毛白杨相比，转基因株系的木质部细胞层数和木质部宽度都明显增多，如附图4所示。

[0127] 实施例5、细胞壁厚度检测

[0128] 通过扫描电子显微镜对转基因植株与野生型植株的第十节间的组织横截面切片经喷金后木质部细胞进行观察，各株系木质部纤维细胞细胞壁厚度统计结果如图5所示，统计后发现转基因植株的细胞壁厚度要厚于野生型植株。

[0129] 上述结果显示，PtoABAPT2突变株系转基因杨树与野生型比较，明显增高、增粗，且木质部细胞层数和细胞壁厚度都明显增多，说明PtoABAPT2基因是调控杨树木材的形成的关键调节基因，在林木基因工程领域和无性系林业领域有重要应用价值。

[0130] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。