[0001] 本发明涉及基因可有效提高水稻的耐盐性及其应用，属于作物分子遗传育种领域。

[0002] 土壤盐分是影响植物生长和作物产量的主要胁迫因子，然而，植物对环境的适应+使其具有一定抵抗盐胁迫的能力。在盐胁迫时，大量Na 进入细胞，刺激细胞内二价阳离子
2+
(如Ca )浓度迅速升高，并在细胞内转运，参与调控钙调蛋白(CaM)、依赖蛋白激酶(CDPK/CP +
K)等蛋白，促使细胞中的Na排出，以达到离子平衡。其中，盐超敏感(salt overly sensiti +
ve，SOS)途径是植物耐受Na 的重要防御通路，钙结合蛋白OsSOS3/CBL4感知盐胁迫引起的胞质钙信号，与蔗糖非发酵的I类蛋白激酶3(SnRK3家族成员OsSOS2/OsCIPK24)相互作用并磷酸化，磷酸化的OsSOS2/OsCIPK24迅速激活定位于细胞膜上的转运蛋白OsSOS1，以实现Na+
的外排而增加植物对盐胁迫的适应性(Liu et al.，2021)。并且随着现代生物技术的发+
展，越来越多与抗盐有关的基因被发现、克隆，例如NAC家族OsNAC3通过调节水稻芽Na的稳态来提高水稻耐盐性(Zhang et al.,2021)；WOX基因家族OsQHB的突变增加抗氧化酶的活性从而正调控水稻幼苗的耐盐性(Zhou et al.,2022)。

[0003] 水稻是我国主要粮食作物之一且对盐敏感，土壤盐碱化严重制约水稻的产量和品质。根据联合国粮农组织(FAO)统计，预计到2050年，气候变暖和淡水资源的匮乏将导致全球50％的耕地受到盐的影响，威胁粮食安全。盐对植物的毒害主要体现在：增加土壤渗透+ ‑压，使植物根系吸水受到抑制，限制种子的萌发；植物对钠(Na)和氯(Cl)吸收增加，有害离子的积累对植物细胞膜和细胞器造成损伤；影响气孔闭合和气体的交换，降低蒸腾速率和碳同化率，抑制植物对二氧化碳的吸收，削弱植物的光合作用；引起细胞内活性氧(ROS)的积累，从而破坏细胞结构和影响蛋白质的稳定；干扰营养元素的吸收，破坏营养平衡。因此，进一步提高作物的抗逆性是应对未来气候变化的重要途径。

[0004] 培育优质抗盐品种是提高水稻耐盐性最直接有效的方法之一。

[0005] 一、针对向日葵：

[0006] 向日葵作为治理盐碱地的主要作物，对盐碱具有较强的耐性，能在各种环境条件下保持稳定产量。发掘向日葵基因资源中的耐盐基因并应用至水稻育种研究中为筛选耐盐水稻植株提供新思路，可能是应对土地盐碱化的有效策略。并且研究者已成功克服向日葵参考基因组序列庞大且重复性高的难题，组装了高质量的向日葵参考基因组，为充分挖掘、克隆向日葵基因资源中的有利基因提供模板，同时为水稻高产、高品质育种提供更多基因资源，创制具有良好抗盐能力的水稻新品种，进一步促进水稻农业的可持续发展。

[0007] LOC110940494基因已经在基因库中登录，登录号为110940494，其同源基因为LOC542493，同源基因具有调控光合作用和叶绿体发育的作用。

[0008] 二、针对高粱：

[0009] 最新研究在高粱中发现了主效耐盐基因AT1，该基因在胁迫条件下通过增加过氧化氢(H2O2)的外排来减少盐分对细胞的损伤，从而提高对盐胁迫的耐受性，进一步揭示了作物耐盐的分子机制，并将该理论成果应用到水稻研究中，显著增加了水稻在盐碱地的产量(Zhang et al.,2023)。可见，高粱自身耐盐碱、耐干旱和耐土壤贫瘠的优势是作物改良以应对非生物胁迫的绝佳候选者。发掘高粱基因资源中的耐盐基因并应用至水稻育种研究，培育优质耐盐、高产水稻新品种，为有效利用盐碱化土地和解决全球粮食安全做出贡献。

[0010] 基因LOC8057890和LOC8078076为LOC110940494的同源基因，登录号分别为8057890和8078076，参与光合作用和叶绿体发育的调控。

[0033] 实施例1、基因LOC110940494

[0034] 步骤1、向日葵总RNA提取与cDNA的合成

[0035] 采用EASY spin plus plant RNA rapid extraction kit(Aidlab公司)提取向日葵叶片总RAN。取向日葵叶片0.1g，用液氮研磨后，将510μl裂解液RLT和40μl PLANTaid混匀加入至样品中，立即振荡30sec，充分裂解；13000rpm离心13min，将上清液转移到新的离心管后加入上清液1/2体积的无水乙醇；将混合液吸取到基因组清除柱中，12300rpm离心3min，弃掉废液；再将清除柱放在新的2ml离心管中，加入520μl裂解液RLT plus，静置1min，
13000rpm离心45sec，收集滤液，并加入滤液1/2的无水乙醇，吹打混匀；将混合物全部加入到吸附柱RA中，12300rpm离心2min，弃掉滤液；加入710μl去蛋白液RW1，静置60sec，
12300rpm离心45sec，弃掉滤液；加入510μl冲洗液RW，12300rpm离心45sec，弃掉废液；重复一次弃掉液体，13000rpm离心1min；将吸附柱RA放入到新的RNase free离心管中，加入30μl RNase free water(提前65℃加热)，静置1min，13000rpm离心1min，收集滤液，获得的向日葵总RNA置于‑80℃冰箱保存。

[0036] 使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara公司)进行反转录，去除基因组DNA的反应体系为：2μl 5×g DNAEraser Buffer、1μl g DNA Eraser、1μg TotalRNA，ddH2O补足至10μl，PCR程序为第一步42℃，2min，第二步4℃，8min。在上述体系反应后的产物中加入以下试剂：1μl Prime Script RT Enzyme Mix I、1μl PT Primer Mix、4μl 5×Prime Script Buffer，4μl RNase‑Free ddH2O。PCR反应程序为37℃，15min；85℃，5sec；4℃，60min。反应结束后，在PCR产物中加入40μl RNase‑Free Water，置于‑20℃保存备用。

[0037] 步骤2、LOC110940494基因的PCR扩增

[0038] 人工合成以下引物：

[0039] F1：

[0040] R1：

[0041] 其中单划线部分为向日葵LOC110940494基因的特异性序列，扩增得到LOC110940494基因的完整CDS序列，双划线部分为限制性内切酶HindIII和KpnI(Takara公司)识别序列，未划线部分为pCAMBIA1300‑ubi载体接头序列。

[0042] 以步骤1获得的cDNA为模板，采用KOD FX(TOYOBO公司)扩增LOC110940494基因，反应体系为：25μl 2×PCR Buffer for KOD FX、10μl 2mM dNTPs、上下游引物各1.5μl(浓度为100ng/μl)、2μl cDNA(浓度为200ng/μl)、1μl KOD FX，ddH2O补足至50μl体系。PCR扩增体系：94℃预变性2min、98℃变性10sec、62℃退火30sec、68℃延伸2min，35个循环，68℃延伸10min。PCR产物用质量分数0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，将所需目的基因的条带进行分离，并用AxyPrep PCR清洁试剂盒(Axygen公司)按照产品说明纯化目的片段。经生物公司测序分析后获得基因LOC110940494的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示；其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(末尾为终止密码子)。

[0043] 步骤3、LOC110940494基因过表达载体的构建

[0044] 用限制性内切酶HindIII和KpnI对pCAMBIA1300‑ubi载体进行双酶切，反应体系为：HindIII和KpnI各2μl、8μl 1×Buffer、20μl pCAMBIA1300‑ubi载体质粒，ddH2O补足至40μl体系，37℃水浴酶切4h。用AxyPrep PCR清洁试剂盒(Axygen公司)按照产品说明纯化酶切产物，且按照同样的方法对LOC110940494基因的扩增产物进行纯化。采用Takara公司的无缝克隆试剂盒In‑Fusion HD Cloning Kit，将纯化后的目的片段连接到酶切后的过表达载体上，反应体系为：1μl纯化后的目的片段、1μl载体质粒、0.5μl In‑Fusion HD enzy me，
37℃孵育15min后转至50℃水浴15min。连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后，寄到生物技术公司进行测序，验证载体中插入的目的片段，获得LOC110940494基因的过表达载体。

[0045] 根据文献《A protocol for Agrobacterium‑mediated transformation in rice》(Nishimura etal.,2006)提供的方法，将该载体遗传转化到水稻野生型品种中花11中，获得相应的转基因水稻植株。选择两个表型明显(叶色更绿)的转基因水稻植株分别作为过表达株系OE‑1和过表达株系OE‑2。

[0046] 步骤4、过表达LOC110940494转基因水稻植株的鉴定

[0047] 按照步骤1所述方法提取过表达株系OE‑1和OE‑2叶片组织的总RNA，并反转录成cD NA。

[0048] 首先是使用2×Taq Master Mix(Dye)(CWBIO公司)进行半定量RT‑PCR分析，以水稻Actin基因作为内参，内参基因引物为F2：5’‑TATGACCAGGAAATGGAGAC‑3’与R2：5’‑TGAAGAAACAGCAACAAAAA‑3’，LOC110940494基因的半定量引物为F3：5’‑CTACAAAT CTGGCTCCTAAAC‑3’与R3：5’‑GACATCCAATACCCATAATCT‑3’。以转基因水稻叶片组织的cDNA为模板，扩增内参基因Actin，反应体系为5μl 2×Taq MasterMix(Dye)、F2/R2引物各0.25μl(浓度为100ng/μl)、1μl cDNA(浓度为200ng/μl)，ddH2O补足至10μl。PCR反应程序为：94℃预变性2min、94℃变性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸50sec，30个循环，72℃终延伸2min。通过调整cDNA模板量进行PCR，PCR产物用质量分数1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，使其电泳产物条带亮度一致。以Actin调整的体系扩增目的基因LO C110940494，反应体系为5μl 2×Taq MasterMix(Dye)、F3/R3引物各0.25μl(浓度为100ng/μl)、1μl cDNA(浓度为200ng/μl)，ddH2O补足至10μl。PCR程序同上。PCR产物用质量分数1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果如图1所示，野生型品种中花11中未检测到向日葵LOC110940494基因且过表达株系OE‑1的电泳条带亮度亮于OE‑2，说明过表达株系中LOC110940494基因表达强于OE‑2。

[0049] 再使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara公司)进行qPCR。以水稻Actin基因作为内参，PCR引物的序列为F4：5’‑TGGCATCTCTCAGCACATTCC‑3’与R4：5’‑TGC ACAATGGATGGGTCAGA‑3’。LOC110940494基因的qPCR引物为F5：5’‑CTACAAATCTG GCTCCTAAAC‑3’与R5：5’‑GACATCCAATACCCATAATC‑3’。Actin基因qPCR反应体系为1μl cDNA(浓度为200ng/μl)、5μl Green Premix Ex Taq、F4/R4上下游引物各0.25μl(浓度为100ng/μl)、0.2μl ROX Reference Dye以及3.3μl ddH2O。以Actin内参基因作为对照，同时扩增LOC110940494基因，其qPCR反应体系为1μl cDNA(浓度为200ng/μl)、5μl Green Premix Ex Taq、F5/R5上下游引物各0.25μl(浓度为100ng/μl)、0.2μl ROX Reference Dye以及3.3μl TMddH2O。在StepOne Plus  Real‑Time PCR System(Applied Bio systems公司)运行PCR，运‑△△Ct
行程序为：95℃预变性30sec；95℃5sec，60℃30sec，40个循环，并采用2 法分析LOC110940494基因的表达水平。测定结果采用t检验分析过表达株系与野生型对照之间的显著性差异，结果如图2所示，LOC110940494基因在水稻过表达株系OE‑1和OE‑2中的表达量显著高于野生型中花11，且OE‑1的表达量高于OE‑2。

[0050] 步骤5、过表达LOC110940494转基因水稻植株的耐盐性测定

[0051] 实验所需的120mM NaCl溶液即在1L水中加入7.02g NaCl进行溶解，150mM NaCl溶液则是在1L水中加入8.775g NaCl进行溶解，配置好的盐溶液室温保存备用。露白后的水稻种子在清水中培养5日，再将5日苗龄的野生型品种中花11与过表达株系OE‑1和OE‑2转移到120mM NaCl溶液中处理3天，处理结束后又换NS1040 800×Yoshida水稻营养液(Co olaber公司)进行恢复性培养3天，同时设置的对照组是在清水中培养5日后转移到水稻营养液中继续生长，直至实验结束。结果发现，与对照组的植株相比，盐胁迫下的野生型和过表达株系生长均受到抑制，但是测量结果OE‑1和OE‑2的株高与根长均高于野生型对照(图3，图4)。
进一步加剧盐胁迫，在清水中正常生长一周后的水稻幼苗转移至水稻营养液中继续培养7日，之后用150mM NaCl溶液处理14日苗龄的野生型与过表达株系7天，再在水稻营养液中进行恢复性培养3天，结果表明野生型品种中花11半数出现萎蔫与干枯，而过表达株系的存活率更高(图5，图6)，说明向日葵LOC110940494基因能有效提高水稻植株对高盐的耐受性，具有重要的育种价值。

[0052] 实施例2、同源基因LOC8057890和LOC8078076

[0053] 步骤1、高粱总RNA提取与cDNA的合成

[0054] 采用EASY spin plus plant RNA rapid extraction kit(Aidlab公司)提取高粱叶片总RAN。取高粱叶片0.1g，用液氮研磨后，将510μl裂解液RLT和40μl PLAN Taid混匀加入至样品中，立即振荡30sec，充分裂解；13000rpm离心13min，将上清液转移到新的离心管后加入上清液1/2体积的无水乙醇；将混合液吸取到基因组清除柱中，12300rpm离心3min，弃掉废液；再将清除柱放在新的2ml离心管中，加入520μl裂解液RLT plus，静置1min，13000rpm离心45sec，收集滤液，并加入滤液1/2的无水乙醇，吹打混匀；将混合物全部加入到吸附柱RA中，12300rpm离心2min，弃掉滤液；加入710μl去蛋白液RW1，静置60sec，
12300rpm离心45sec，弃掉滤液；加入510μl冲洗液RW，12300rpm离心45sec，弃掉废液；重复一次弃掉液体，13000rpm离心1min；将吸附柱RA放入到新的RNase free离心管中，加入30μlRNase free water(提前65℃加热)，静置1min，13000rpm离心1min，收集滤液，获得的高粱总RNA置于‑80℃冰箱保存。

[0055] 使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara公司)进行反转录，去除基因组DNA的反应体系为：2μl 5×g DNA Eraser Buffer、1μl g DNA Eraser、1μg Total RNA，ddH2O补足至10μl，PCR程序的第一步42℃，2min，第二步4℃，8min。在上述体系反应后的产物中加入以下试剂：1μl Prime Script RT Enzyme Mix I、1μl PT Primer Mix、4μl 5×Prime Script Buffer，4μl RNase‑Free ddH2O。PCR反应程序为37℃，15min；85℃，5sec；4℃，60min。反应结束后，在PCR产物中加入40μl RNase‑Free Water，置于‑20℃保存备用。

[0056] 步骤2、LOC8057890和LOC8078076基因全长片段的获得

[0057] 表1、引物序列

[0058]

[0059] F1/R1引物对单划线部分为高粱LOC8057890基因的特异性序列，F2/R2引物对单划线部分为高粱LOC8078076基因的特异性序列，双划线部分为限制性内切酶HindIII和KpnI(Takara公司)识别序列，未划线部分为pCAMBIA1300‑ubi载体接头序列，扩增得到LOC8057890和LOC8078076基因的完整CDS序列。

[0060] 以步骤1获得的cDNA为模板，采用KOD FX(TOYOBO公司)分别扩增LOC8057890和LOC8078076基因，反应体系为：25μl 2×PCR Buffer for KOD FX、10μl 2mM dNTPs、上下游引物(F1/R1或F2/R2)各1.5μl(浓度为100ng/μl)、2μl cDNA(浓度为200ng/μl)、1μl KOD FX，ddH2O补足至50μl体系。PCR扩增体系：94℃预变性2min、98℃变性10sec、62℃退火30sec、68℃延伸2min，35个循环，68℃延伸10min。PCR产物用质量分数0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，将所需目的基因的条带进行分离，并用AxyPrep PCR清洁试剂盒(Axygen公司)按照产品说明纯化目的片段。

[0061] 经生物公司测序分析后：

[0062] 获得基因LOC8057890的核苷酸序列，如SEQ ID NO：3所示；其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示(末尾为终止密码子)。

[0063] 获得基因LOC8078076的核苷酸序列，如SEQ ID NO：5所示；其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示(末尾为终止密码子)。

[0064] 步骤3、LOC8057890和LOC8078076基因过表达载体的构建

[0065] 用限制性内切酶HindIII和KpnI对pCAMBIA1300‑ubi载体进行双酶切，反应体系为：HindIII和KpnI各2μl、8μl 1×Buffer、20μl pCAMBIA1300‑ubi载体质粒，ddH2O补足至40μl体系，37℃水浴酶切4h。用AxyPrep PCR清洁试剂盒(Axygen公司)按照产品说明纯化酶切产物，且按照同样的方法分别对LOC8057890和LOC8078076基因的扩增产物进行纯化。采用Takara公司的无缝克隆试剂盒In‑Fusion HD Cloning Kit，将纯化后的目的片段连接到酶切后的过表达载体上，反应体系为：1μl纯化后的目的片段、1μl载体质粒、0.5μlIn‑Fusion HD enzyme，37℃孵育15min后转至50℃水浴15min。连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后，寄到生物技术公司进行测序，验证载体中插入的目的片段，分别获得LOC8057890和LOC8078076基因的两个过表达载体。根据文献《A protocol for Agrobacterium‑mediated transformation in rice》(Nishimura et al.,2006)提供的方法，将以上两个载体遗传转化到水稻野生型品种中花11中，获得相应的转基因水稻植株。

[0066] 针对LOC8057890，选择两个表型明显的转基因水稻植株(如叶色更绿)分别作为LOC8057890名下的过表达株系OE‑1和过表达株系OE‑2；针对LOC8078076，选择两个表型明显的转基因水稻植株(如叶色更绿)分别作为LOC8078076名下的过表达株系OE‑1和过表达株系OE‑2。

[0067] 步骤4、LOC8057890和LOC8078076基因过表达水稻植株的鉴定

[0068] 采用CTAB法，提取转基因水稻植株及其野生型的基因组DNA。取水稻叶片0.1g，用液氮研磨后，加600μl提取液(70ml 1M Tris‑HCl、30ml 0.5M EDTA、61.4gNaCl，15.0gCTAB粉末加超纯水定容至1L，调节pH＝8.0)，65℃温育30min；再加500μl氯仿，混匀，12000rpm离心5min；取上清，加入500μl异丙醇，混匀，12000rpm离心3min，弃去上清；用75％乙醇洗涤沉淀两次，12000rpm离心3min，弃去上清；倒置室温风干DNA后，加100μl纯水溶解DNA。

[0069] 用以上提取的DNA为模板，使用2×Taq Master Mix(Dye)(CWBIO公司)进行PCR扩增，引物序列如表2所示，F3/R3引物对为LOC8057890基因，F4/R4引物对为LOC8078076基因。PCR扩增的程序：94℃预变性2min、94℃变性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸50sec，30个循环，72℃终延伸2min。PCR产物用质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图7所示，过表达成功的株系均在对应位置出现目标条带，而野生型对照则未跑出条带。

[0070] 进一步通过RT‑qPCR检测转基因水稻中LOC8057890和LOC8078076基因的表达量。按照步骤1所述方法提取LOC8057890名下的过表达株系OE‑1和OE‑2以及LOC8078076名下的TM
过表达株系OE‑1和过表达株系OE‑2叶片组织的总RNA，并反转录成cDNA。使用TB Green  TM
Premix Ex Taq 试剂盒(Takara公司)进行qPCR。分别用F3/R3、F4/R4引物对检测LOC8057890和LOC8078076基因的表达水平，以水稻Actin基因作为内参，Actin基因的qPCR引物对为F5/R5。Actin基因的qPCR反应体系为1μl cDNA(浓度为200ng/μl)、5μl Green Premix Ex Taq、F5/R5上下游引物各0.25μl(浓度为100ng/μl)、0.2μl ROX Reference Dye以及3.3μl ddH2O。以Actin内参基因作为对照，同时扩增LOC8057890和LOC8078076基因，其qPCR反应体系为1μl cDNA(浓度为200ng/μl)、5μl Green Premix Ex Taq、F3/R3或F4/R4上下游引物各0.25μl(浓度为100ng/μl)、0.2μl ROX Reference Dye以及3.3μl ddH2O。在TM
StepOne Plus  Real‑Time PCR System(Applied Biosystems公司)运行PCR，运行程序为：
‑△△Ct
95℃预变性30sec；95℃5sec，60℃30sec，40个循环，并采用2 法分别分析LOC8057890和LOC8078076基因的表达水平。测定结果采用t检验分析过表达株系与野生型对照之间的显著性差异，结果如图8所示，LOC8057890基因在水稻过表达株系OE‑1和OE‑2中的表达量显著高于野生型中花11，LOC8078076基因在水稻过表达株系OE‑1和OE‑2中的表达量亦高于野生型对照中花11。

[0071] 表2、引物序列

[0072] 引物名称 引物序列(5’‑3’)F3 GCTTTGCCATGTCCACCTCC
R3 CGCCCATGACACTGTCTACTGA
F4 GGCGGCAGCAGGGAATAAGAA
R4 CTGGAGGTGGCTGGCAATGTT
F5 TGGCATCTCTCAGCACATTCC
R5 TGCACAATGGATGGGTCAGA

[0073] 步骤5、转基因水稻植株的耐盐性测定

[0074] 实验所需的120mM NaCl溶液即在1L水中加入7.02g NaCl进行溶解，150mM NaCl溶液则是在1L水中加入8.775g NaCl进行溶解，配置好的盐溶液室温保存备用。露白后的水稻种子在清水中培养5日，再将5日苗龄的野生型品种中花11与过表达株系转移到120mM NaCl溶液中处理3天，处理结束后又换NS1040 800×Yoshida水稻营养液(Coolaber公司)进行恢复性培养3天，同时设置的对照组是在清水中培养5日后转移到水稻营养液中继续生长，直至实验结束。结果发现，与对照组的植株相比，盐胁迫下的野生型和过表达株系生长均受到抑制，但是测量结果表明两个转基因水稻植株的过表达株系的株高与根长均高于野生型对照(图9，图10)。进一步加剧盐胁迫，在清水中正常生长一周后的水稻幼苗在水稻营养液中继续培养7日，随后用150mM NaCl溶液处理14日苗龄的幼苗7天，处理结束后转入正常的水稻营养液中进行恢复性培养3天。根据盐处理条件后的性状表现分析，野生型品种中花11半数出现萎蔫与干枯，而四个转基因水稻的过表达株系的存活率更高(图11，图12)，说明高粱LOC8057890和LOC8078076基因能有效提高水稻植株对高盐的耐受性，具有重要的育种价值。

[0075] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。