[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及棉花基因GhTRXH2在提高植物耐旱性的应用。

[0002] 棉花是世界上最重要的农作物之一，它不仅是重要的纤维和油料来源，而且是纺织、化工原料和重要的战略物资，在国民经济发展中占有较高的地位。近年来，随着全球气温升高，降水量减少，干旱严重影响了棉花的纤维产量和品质，筛选棉花耐旱基因及研究棉花响应干旱的分子机制，对提高棉花等植物耐旱能力、培育棉花等植物耐旱品种具有深远的意义。

[0003] 因此，提高棉花等植物的抗旱性是本领域人员面待解决的技术问题。

[0032] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0033] 本发明利用现代生物技术手段，包括全基因组测序(WGS)/全基因组重测序(WGR)、全基因组关联研究(GWAS)、散装分离分析(BSA‑Seq)，探索和分离了干旱相关的候选基因。结合已鉴定的干旱相关基因和转基因方法、CRI SPR/Cas9基因组编辑系统等基因组修饰技术，开发出耐旱转基因/编辑棉花材料，为棉花抗逆育种提供了重要的基因资源。

[0034] 硫氧还蛋白(Th i oredox i ns,TRXs)是一类生物体中普遍存在的低分子蛋白质，广泛存在于植物、动物和细菌中，具有高度保守的催化活性基序(‑Trp‑Cys‑G l y‑Pro‑Cys‑)。根据结构域的不同，TRXs分为两个家族，TRXI和TRX I I。高等植物中家族Ⅰ进一步被分为H、F、M、O、X和Y六个亚型，TRXH是其中最大的TRX基因家族。TRXH在植物生长发育中发挥重要的功能，通过还原靶蛋白中的二硫键参与了细胞中一系列与氧化还原相关的生理生化反应，如种子生长发育，细胞周期调控，转录因子调控等，此外，TRXH还在植物响应氧化胁迫，干旱胁迫，盐胁迫和病害胁迫等逆境胁迫中发挥着积极的作用。

[0035] 因此，本发明提供棉花基因GhTRXH2在提高植物耐旱性的应用；棉花基因GhTRXH2的核苷酸序列如下所示：

[0036] GhTRXH2核苷酸序列

[0037] ATGGGTTCTGCTCTTTCAAGCTTTTTAGGCTCTTCCGGTTCACCATCAGAGGATTCACCATCTTCA[0038] TCTGAGTCTTCAAGGGTCTCAACCTTCCATTCAGCTCCAAGATGGCAACTTCACTTCAATTCTGTC[0039] AAAGAAACCGCAAAGCTTATGGTTATAGATTTCTCAGCTTCCTGGTGTGGACCATGCAAGTTCATG[0040] GAACCTTTTCTGAATGAAATGGCTGCTAAATTCACTGAAGTTGAATTTGTAAAACTTGATGTTGAT[0041] GAGCTGCCTGACGTGGCACAGGAATTTGGAGTGCAGGCAATGCCAACATTTGTGTTGGTGAAGCAA[0042] GGGAAGGAAGTGGATAGGGTTGTTGGAGCTCGAAAGGATGAGCTTGAGAAGAAGGTTGAGAAGAAT[0043] AAATGCTAA

[0044] 植物为拟南芥。

[0045] 应用为构建GhTRXH2基因过表达载体，获得转基因植物株系，从而提高植物抗旱能力。

[0046] 如图1所示，一种提高植物耐旱性的方法，包括如下步骤：

[0047] (1)提取棉花叶片总RNA，利用反转录试剂盒(TakaRa)合成cDNA；以合成cDNA为模板，扩增GhTRXH2基因；

[0048] (2)构建GhTRXH2基因过表达载体pBI 121‑TRXH2获得转GhTRXH2基因植物株系；

[0049] (3)通过qRT‑PCR检测，分析外源表达量，筛选出高抗旱的转GhTRXH2基因植物株系。

[0050] 一种重组载体，含有上述的棉花基因GhTRXH2。

[0051] 一种遗传工程的细胞，含上述的重组载体。

[0052] 实施例1GhTRXH2基因的克隆、序列和表达分析

[0053] 种植棉花耐旱品种中H177，在幼苗期取棉花叶片，用液氮把棉花叶片研磨成粉末，利用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(诺唯赞)提取棉花叶片总RNA，利用反转录试剂盒(TakaRa)合成cDNA。以合成的cDNA为模板；

[0054] 扩增GhTRXH2，所用引物序列为

[0055] F:5’ATGGGTTCTGCTCTTTCAAGCT3’；

[0056] R:5’TTAGCATTTATTCTTCTCAACCTTCT3’；

[0057] 利用高保真Taq酶KOD‑P l us‑Neo(TOYOBO)扩增GhTRXH2，20u l反应体系如下，10×PCR buffer for KOD‑P l us‑Neo，0.2mMdNTPs，1.5mMMgSO4，0.3uM forward pr imer and 0.3uM reverse pr imer，0.4U KOD‑P l us‑Neo，200mM cDNA；

[0058] 设置的PCR扩增程序为①94℃，2min；②94℃，15sec；58℃，30sec；68℃，2min；32个循环；③68℃，10min；④4℃保存。琼脂糖凝胶电泳分离目的条带并切割回收(北京全式金公司试剂盒 Ge lExtract i on Kit)。将回收产物连接到测序载体Zero C l on i ng Vector中，将重组载体利用热激法转入大肠杆菌感受
态中，获得含有重组载体的大肠杆菌，并测序，最终获得GhTRXH2基因的序列信息。

[0059] 选取中H177幼苗期根、茎、叶，胚珠等组织，利用rea l‑t ime PCR对GbVIP1基因进行组织表达特异性分析。取材后利用上述提取RNA和反转录的方法获得不同组织的cDNA，利用荧光定量试剂SYBR Pr imi x Ex Taq I I(T l i RNaseH P l us)(TaKaRa)进行rea l‑t  ime  PCR。所用的引物序列如下：F:5’TGAAATGGCTGCTAAATTCACT；R:5’TCCACTTCCTTCCCTTGCTT。反应体系如下：10u l2×SYBR Premi x Ex Taq I I，2u l cDNA temp l ate，0.8u l PCR forward pr imer(10uM)，0.8u l PCR reverse pr imer(10uM)，‑ΔΔCt
0.4u l ROX and 6u l灭菌水。反应程序：95℃30s，40个循环、95℃5s，60℃34s。利用2方法对得到的结果进行处理。

[0060] 实施例2GhTRXH2基因的表达载体、重组表达细胞和转基因拟南芥的获得

[0061] 将GhTRXH2基因构建到植物过表达载体pBI 121中获得重组表达载体，以35S启动子启动基因的表达，以NOS终止子终止基因的表达，以卡纳霉素基因作为筛选标记；

[0062] 具体方法如下，利用实施例1中所得重组载体GhTRXH2‑pEASY为模板，以引物F：acgggggactctagaggatccATGGGTTCTGCTCTTTCAAGCT，R:cgatcggggaaattcgagctcTTAGCATTTATTCTTCTCAACCTTCT进行扩增，获得GhTRXH2基因序列的PCR产物，利用限制性内切酶SacI和BamH I对pBI 121载体进行酶切，获得带酶切位点的线性化载体，利用同源重组试剂盒(Cl onExpress I IOne Step C l on i ng Kit，诺唯赞)将PCR产物构建到过表达载体pBI 121中，获得重组载体pBI 121‑GhTRXH2，将重组载体转化大肠杆菌感受态DH5α，经菌落PCR验证，测序验证后获得重组表达细胞。

[0063] 将重组载体pBI 121‑GhTRXH2转入农杆菌细胞GV3101中，取1μL待转化质粒加入解冻的感受态中。在冰上放置5min、然后液氮处理5min，接着放入37℃水浴中处理5min，最后置于冰上5min。在超净台内将600μL YEB液体培养基加入离心管，放入28℃摇床200rpm摇2h。5000rpm离心1min，弃上清500μL，混匀菌液涂至筛选培养皿，28℃培养箱倒置培养36h。
挑取单克隆菌株进行PCR阳性检测。

[0064] 利用农杆菌介导的遗传转化方法将重组载体pBI 121‑GhTRXH2转入拟南芥中获得转棉花GhTRXH2基因的拟南芥。

[0065] 具体操作如下：将含有目的载体的农杆菌在含有卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中培养，至菌液OD值为1.0(培养条件为28℃、200rpm)。然后以5000rpm离心5min，去除上清，加入相同体积的重悬液，震荡混匀后室温静置3h。接着，将混合液倒入烧杯中，并加入侵染液体积0.02％的表面活性剂，混匀备用。修剪拟南芥幼苗的白花和果荚，将其花序浸入重悬液中1min，然后将拟南芥横放在黑暗条件下保温24h，最后继续在人工气候培养箱中培养。利用卡那霉素筛选标记基因对T0代转基因拟南芥进行PCR检测，所用引物

[0066] F:5’TACGCCGCCGCTTCTTCCGCCTACA3’

[0067] R:5’CTTACCAAGCATTTCCTTCCAACAT3’

[0068] 能够扩增出1014bpPCR产物的植株即为转海岛棉GhTRXH2基因的烟草植株。该转基因植株对后续GhTRXH2蛋白在抗黄萎病育种中的应用奠定了基础；

[0069] 实施例3GhTRXH2基因的沉默载体及沉默GhTRXH2基因棉花的获得

[0070] 将GhTRXH2基因构建到沉默载体pTRV2中获得沉默载体，利用实施例1中所得重组载体GhTRXH2‑pEASY为模板，利用引物

[0071] F:5’ggcctcgagacgcgtgagctcTTAGGCTCTTCCGGTTCACCA3’

[0072] F:5’agaaggcctccatggggatccCACCAACACAAATGTTGGCATT3’

[0073] 进行扩增，获得了319bp的GhTRXH2基因片段的PCR产物，利用限制性内切酶Sac I和BamH I对pTRV2载体进行酶切，利用实施例2中的重组载体获得方法构建了沉默载体pTRV2‑GhTRXH2，按照实施例2方法将沉默载体转入农杆菌GV3101细胞中。将棉花种子用无菌水浸泡24h，露白后种到混好的营养土中(基质：蛭石＝1:1)，待幼苗子叶完全平展时进行VI GS实验，接种前将携带pTRV2‑GhTRXH2载体的农杆菌、携带对照载体pTRV2‑GhPDS的农杆菌及携带pTRV2空载体和pYL192载体的农杆菌活化，待农杆菌菌液OD600＝1.5时，离心收集菌液，利用重悬液(10Mm MgCl2，10mM MES，150uM乙酰丁香酮)将农杆菌重悬，然后携带pYL192载体的农杆菌分别与携带pTRV2‑GhTRXH2，pTRV2，pTRV2‑GhPDS载体的农杆菌1:1混合均匀，静置4h后使用。用1ml的注射器针头在棉花幼苗子叶背面扎1个小孔，然后将菌液注射入棉花子叶中，将注射后的棉花幼苗用褐色塑料布遮盖，避光培养24h，然后光照培养，在阳性对照TRV:PDS出现白化后，分别从阴性对照TRV:00和沉默植株(pTRV2‑GhTRXH2)中选取3个生物学重复的样品，然后提取RNA进行荧光定量PCR检测，以荧光定量PCR评估沉默植株的沉默效率。实验方法与qRT‑PCR相同。

[0074] 转GhTRXH2基因拟南芥的抗旱功能分析

[0075] 转基因拟南芥发芽率和根长测定，对野生型和转基因株系的种子进行消毒，经过三天的春化后，分别点于含有150mM D‑甘露醇和不含甘露醇的1/2MS培养基上，在光照培养箱中培养。在培养期间观察并测量主根的长度和种子发芽率。对拟南芥成苗进行干旱处理：选择长势一致的转基因株系和野生型株系，加过量水后进行干旱胁迫，观察植株生长状况并拍照，取样用于指标检测。萌发率和根长统计：含有不同浓度的甘露醇的1/2MS固体培养基划分成三个区域。将2个纯合的T3代转基因种子和WT(野生型)种子在超净台中消毒，均匀的点在平板的三个位置，设置三个重复。4℃春化3天后置于光照培养箱中萌发，当种子胚根露出时，开始统计种子萌发率；根长的统计：在种子点在含有甘露醇的1/2MS固体培养基上，将平板竖直放置在培养箱中生长，确保主根能够在培养基表面垂直生长。当出现表型时，开始统计根长。NBT染色，用100mL磷酸缓冲液(pH7.8)将50mgNBT充分溶解，得到NBT染色工作液，存。采集干旱胁迫前后的拟南芥叶片，洗净，置于滤纸上将多余水分吸干。将拟南芥叶片浸入NBT染色工作液中，常温避光浸染至出现深蓝色。用镊子将叶片小心取出，泡在蒸馏水中反复漂洗，随后置于滤纸上吸干多余水分，再浸入95％乙醇中40℃处理10h，脱去拟南芥叶片中本身的叶绿素，期间多次更换新的95％乙醇。用镊子取出拟南芥叶片，在蒸馏水中反复漂洗5次，置于滤纸上吸干多余水分，将样本浸入上述NBT样本保存液中30min后，小心取出叶片并拍照。

[0076] GhTRXH2基因沉默棉花的抗旱功能分析

[0077] 抗旱相关生理生化指标的测定测定棉花沉默株系在干旱处理前后的MDA含量。取0.1g棉花叶片，加入1mL的MDA提取液，混匀置于冰上，8000rpm离心5min，吸取管中的上清液并静置于冰上。准备在测定管加中入300μL的MDA检测工作液、100μL样本和100μL试剂三。空白管加入300μLMDA检测工作液、100μL蒸馏水和100μL试剂三。混合均匀后在100℃水浴中煮
60min，迅速置于冰上冷却。3000rpm离心5min，吸取离心管中的200μL上清液加入96孔板中，测定样本在450nm、532nm和600nm处的吸光值。根据公式MDA含量(nmo l/g质量)＝5*(12.9*(ΔA532‑ΔA600)*2.58*ΔA450)/W(W：样本质量)。计算处理前后MDA的含量。

[0078] 利用H2O2含量检测试剂盒(so l arb io)检测棉花沉默株系在干旱处理前后的H2O2含量。将植物叶片收集到到离心管中，液氮研磨。称取约0.1g粉末，加入1mL试剂一后冰浴匀浆；离心机温度设置为4℃，8000rpm离心10min，取上清，置于冰上。酶标仪预热30min后，调节波长为415nm，蒸馏水调零。随后将试剂二、三和四在25℃水浴锅中静置10min。用丙酮将1mmo l/mL标准液稀释为1μmo l/mL的标准溶液。分别设置测定管、标准管和空白管。按照样品说明书添加试剂，按照公式H2O2含量(μmo l/g)＝ΔA测定÷(ΔA标准÷C标液)×V样本÷(V样本÷V提取×W)＝2×ΔA测定÷ΔA标准÷W计算结果。

[0079] 上述具体实验方法说明，

[0080] 过氧化氢酶(CAT)活性检测

[0081] (1)称取0.1g的植物叶片，加入1mL试剂一后冰浴匀浆。8000rpm，4℃离心10min，取上清液于新离心管中，放置于冰上。

[0082] (2)酶标仪预热30min以上。调节波长至240nm，蒸馏水调零。

[0083] (3)将CAT检测工作液在25℃水浴10min以上。

[0084] (4)在96孔板中加入10μL样本和190μL工作液，立即混匀并开始计时。记录240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。

[0085] (5)计算ΔA＝A1‑A2。

[0086] 总抗氧化能力(T‑AOC)

[0087] (1)称取约0.1g组织，加入1mL试剂一，冰浴匀浆。8000rpm，4℃离心10min，取上清液，置于冰上待测。

[0088] (2)酶标仪预热30min以上。调节波长至593nm，使用蒸馏水进行调零。

[0089] (3)将40μmo l/mL标准溶液用蒸馏水稀释为一系列浓度(0.15、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.00156μmo l/mL)的标准溶液。每个标准管需100μL标准溶液。

[0090] (4)吸取100μL标准溶液(蒸馏水作空白)与100μL试剂二混合。充分混匀，反应10分钟。在593nm下测定吸光度。计算ΔA标准＝A标准‑A空白。

[0091] (5)吸取24μL样本或蒸馏水(空白管)与180μL混合液混合。充分混匀，室温准确反应10分钟。吸取200μL于微量玻璃比色皿。在593nm下测定吸光度。计算ΔA测定＝A测定‑A空白。

[0092] 超氧化物歧化酶(SOD)活性检测

[0093] (1)称取0.1g的植物叶片并进行液氮研磨，随后加入1mL试剂一，混匀冰浴静置。8000rpm，4℃离心10min，吸取匀浆的上清液，静置于冰上等待测定。

[0094] (2)酶标仪预热30min以上。调节酶标仪波长至560nm，用蒸馏水对酶标仪进行调零。

[0095] (3)按照说明书加入试剂与样品。并在560nm处测定各管吸光值A。

[0096] (4)计算ΔA测定＝A测定‑A对照，计算ΔA空白＝A1空白‑A2空白。如果底部有沉淀，将溶液混匀后再次测定并计算活性。

[0097] DAB染色

[0098] 二氨基苯丙胺(DAB)染色法检测干旱胁迫后棉花叶片活性氧的含量；避光条件下称取0.2gDAB的粉末溶解于200mL ddH2O中。将棉花叶片浸没于DAB染色液中，28℃黑暗处理过夜。倒掉染色液，加入95％乙醇，沸水煮10min，更换乙醇后静置待脱色完成。

[0099] 综上，GhTRXH2蛋白由134个氨基酸残基组成，GhTRXH2理论分子量为14.8kDa，理论等电点为5.23，包含保守的催化活性基序WCGPC。对GhTRXH2基因在棉花中的组织表达特异性进行分析，发现GhTRXH2基因在根、茎和开花后10天的胚珠中高表达，在叶和开花后25天的胚珠中表达较低。在ABA(脱落酸)和干旱胁迫下，GhTRXH2的表达水平显著上调，分别在胁迫处理后9h和6h的表达量显著增加，并均在12h达到峰值(如图2所示)。

[0100] 利用VI GS技术(病毒诱导基因沉默技术)沉默棉花中的GhTRXH2基因，当阳性对照TRV：PDS出现白化时，GhTRXH2的表达水平在沉默株系中显著降低，沉默效率70％左右。选择长势一致的TRV:GhTRXH2和TRV:00植株进行15％PEG模拟干旱处理，结果发现，处理后各株系的棉花幼苗均出现萎蔫和子叶脱落的现象。与TRV:00植株相比，GhTRXH2沉默株系出现了更为严重的萎蔫和形变(如图3所示)。

[0101] 对模拟干旱处理的棉花植株叶片进行DAB染色，发现相比于对照株系TRV:00，GhTRXH2沉默株系的叶片生成了更多的棕红色沉淀，对沉淀进行定量分析，发现GhTRXH2沉默株系的棕色区域显著高于对照组(如图3所示)。

[0102] 为了进一步探究GhTRXH2参与棉花耐旱的机制，对正常生长状态和模拟干旱处理下(15％PEG6000处理9h)GhTRXH2沉默株系及对照植株叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及丙二醛(MDA)与H2O2的含量和总抗氧化能力(T‑AOC)进行了测定。在正常生长状态下，SOD和POD的活性，MDA和H2O2的含量和T‑AOC的能力没有显著性差异；在聚乙二醇(PEG)模拟干旱处理后，沉默株系的SOD和POD指标均低于对照，这说明干旱胁迫下沉默植株的ROS清除能力降低。GhTRXH2基因沉默植株积累了更多的MDA和H2O2含量，总抗氧化能力也显著降低，说明沉默植株比对照受损程度高(如图4所示)。

[0103] 对照植株和沉默植株中分析了这些基因的表达水平。qRT‑PCR结果显示，在正常状态下，这些基因在沉默植株与对照中无显著差异。在PEG处理后，TRV:GhTRXH2植株中GhP5CS、GhDREB2A、GhCOR47和GhRAD29的表达量显著低于对照植株，而ABA通路信号转导途径的负调节因子GhPP2C在沉默植株中的表达量显著高于对照植株。GhERD10的表达在沉默和对照植株中无显著差异。(如图5所示)。这说明GhTRXH2通过调控干旱应答相关基因的表达，在棉花响应干旱的反应中发挥重要作用。

[0104] 为检测GhTRXH2在拟南芥干旱胁迫中发挥的功能，构建GhTRXH2基因过表达载体pBI 121‑TRXH2并通过蘸花法获得转基因拟南芥株系。通过qRT‑PCR检测，筛选出外源表达量较高的两个株系并分别编号为(过表达)OE‑3和OE‑32。将WT(野生型)和过表达株系的种子消毒后均匀地铺在含0mM和200mM甘露醇的1/2MS培养基上，统计发芽率。结果表明，在1/2MS培养基上，转基因及对照株系的种子萌发率并无显著差异，但在添加200mM甘露醇的1/
2MS培养基上过表达株系的发芽率显著高于WT株系，其中OE‑2株系的发芽率约为65％，而GhTRXH2表达量较高的OE‑32株系的发芽率约为74％，远高于WT的发芽率(21％)(如图6所示)。

[0105] 同时对转基因和对照株系在渗透胁迫下的根长进行了测定，结果表明：在正常培养基上，过表达GhTRXH2拟南芥和WT的根长并无明显差异。而在200mM甘露醇处理下，转基因株系的主根长度显著高于WT株系(如图7所示)

[0106] 对转基因和野生型拟南芥在苗期进行抗旱性鉴定，挑选长势一致的过表达及对照株系进行干旱处理，当干旱一周后，拟南芥幼苗均表现出一定程度的脱水干枯状态，而过表达株系则有少量绿色叶片。随后进行复水处理，复水三天后发现，WT株系枯萎严重且叶片失绿，而过表达株系的部分叶片开始舒展，恢复绿色(如图7所示)

[0107] 在干旱处理期间，我们对不同株系的拟南芥叶片进行NBT染色，观察结果发现：对照组的WT株系和OE株系叶片上均有少量的蓝色积累。而干旱处理组的WT株系和OE株系叶片呈深蓝色，其中与过表达株系相比，野生型拟南芥聚集了更深的颜色(如图7所示)测定了处理前后的不同株系拟南芥的MDA含量，结果显示，未处理时拟南芥WT株系和过表达株系的MDA含量无明显差异；在自然干旱处理下，所有株系的MDA含量均增加，但转GhTRXH2基因拟南芥的MDA含量显著低于野生型。转GhTRXH2基因拟南芥通过提高发芽率和根长，降低叶片活性氧和MDA的积累提高自身耐受胁迫的能力，GhTRXH2正调控拟南芥干旱胁迫响应。

[0108] 因此，GhTRXH2基因能够调控植物的干旱胁迫响应，增强植物对干旱的适应性具有深远意义。

[0109] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。