[0001] 本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株高产叶酸的植物乳植杆菌及其应用。

[0002] 叶酸(Folic acid，FA)又名维生素B9，属于水溶性的B族维生素中的一种，是一组含有蝶酰谷氨酸结构的一类化合物的统称，由蝶啶、对氨基苯甲酸和一个或多个谷氨酸结合而成。叶酸是人类饮食中重要的营养成分之一，是维持人体正常机能与代谢活动不可或缺的维生素。人体自身无法合成叶酸，只能通过肠道微生物和日常膳食中摄取叶酸。但由于饮食结构和烹饪方法等原因，叶酸缺乏存在人口和地域差异，而孕妇叶酸缺乏情况较为普遍。通过化学合成的产品补充叶酸容易因为剂量控制不当而导致B12缺乏以及引起巨幼红细胞性贫血、神经系统紊乱、神经管缺陷等疾病。

[0003] 现已经报道许多乳酸乳球菌、嗜热链球菌、明串珠菌和双歧杆菌等乳酸菌能够产生含多个谷氨酸残基的叶酸，微生物合成叶酸的途径也已被了解得比较清楚，因此，利用微生物发酵生产叶酸无疑是一个很好的思路。但不同乳酸菌株在叶酸生物合成方面存在很大差异。并且，乳酸菌间的互生作用、拮抗作用等对新物质的产生有着深刻影响。因此，找到一株高产叶酸并能应用于叶酸发酵生产的乳酸菌具有重大研究意义。

[0044] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都落入本发明的保护范围之内。

[0045] 在乳杆菌属中，植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)已经被证明可以产生叶酸，但不同的植物乳植杆菌菌株之间产生叶酸的能力以及与其他产叶酸的乳酸菌之间的互生作用和拮抗作用存在很大差异，而乳酸菌之间的互生作用和拮抗作用对叶酸的产生具有重要影响，还会影响发酵乳的品质。

[0046] 本发明从新疆脱脂酸奶中经分离、筛选得到一株植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株，该菌株具有高产叶酸的能力，并且在与其他乳酸菌共同发酵的过程中表现出显著的协同作用。

[0047] 以下通过具体实施例来对本发明的方案进行说明。

[0048] 以下实施例中采用的培养基的成分如下：

[0049] MRS液体培养基：蛋白胨：1％wt，牛肉膏粉：0.8％wt，酵母膏粉：0.4％wt，葡萄糖：2％wt，磷酸氢二钾(无水)：0.2％wt，柠檬酸三氨(无水)：0.2％wt，乙酸钠(含三水)：0.5％wt，硫酸镁(含七水)：0.22％wt，硫酸锰(含四水)：0.05％wt，吐温80：0.1％wt，其余为蒸馏水。

[0050] 以下实施例中采用的植物乳植杆菌H8‑5、植物乳植杆菌FJ2‑3、植物乳植杆菌FJ6‑4、植物乳植杆菌H2‑4、植物乳植杆菌FJ3‑3、植物乳植杆菌F4‑1从四川泡菜中分离得到，植物乳植杆菌D37从西藏特产奶豆腐中分离得到，嗜热链球菌菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC 20369，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC 20358。

[0051] 以下通过具体实施例对本发明的方案进行说明。

[0052] 如无特殊说明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；以下实施例中所用的材料、试剂、培养基等均可从商业途径得到。

[0053] 实施例1

[0054] 本实施例提供了植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株的筛选、分离过程及其鉴定。

[0055] 1、植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株的筛选、分离过程

[0056] 无菌条件下，称取一定量的新疆脱脂酸奶并研磨，溶解在适量无菌生理盐水中混‑1制成混合液。取1mL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10 菌悬液，然后逐级稀释。各吸‑2
取100μL将稀释液涂布到MRS固体培养基平板上。无菌生理盐水菌悬液选取稀释梯度为10 ，‑3 ‑4
10 ，10 。涂好的平板倒置于37℃恒温培养48h，挑取长势良好，菌落饱满均匀的单菌落于新鲜的MRS液体中，37℃恒温培养24h±2h。

[0057] 2、TXZ 2‑26菌株的鉴定

[0058] 2.1植物乳植杆菌TXZ 2‑26的形态学以及一般性质

[0059] 挑取菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24h。吸取菌液进行革兰氏染色并镜检，菌株形态及染色结果如图1所示。

[0060] 2.2植物乳植杆菌TXZ 2‑26的16s rDNA序列测定

[0061] 将TXZ 2‑26菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h。按Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书方法提取TXZ 2‑26菌株基因组DNA。以该基因组DNA为模板，27F(5’‑agagtttgatcctggctcag‑3’)和1492R(5’‑tacgacttaaccccaatcgc‑3’)为引物进行16s rDNA扩增，得到其16s rDNA序列(如SEQ ID No.1所示)。并对PCR扩增产物进行测序分析。

[0062] 将获得的TXZ2‑26菌株的16s rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，结果显示，TXZ2‑26菌株与植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)的Identity＝99.51％(>97％)。因此，鉴定此菌株为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)，将其命名为植物乳植杆菌TXZ2‑26，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为CCTCC M 20232008，保藏日期为2023年10月
25日起保存30年。

[0063] 3、植物乳植杆菌TXZ 2‑26的生长曲线测定

[0064] 挑取TXZ 2‑26菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24h为种子液。将种子液以1％接种量接种于MRS液体培养基中，取200微升接种至96孔板于37℃培养24h，以培养时间为横坐标，以OD600为纵坐标，绘制菌体的生长曲线(如图2所示)。

[0065] 实施例2

[0066] 本实施例通过高效液相色谱法(HPLC)考察了植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株产叶酸的能力。

[0067] 测定实施例1中从新疆脱脂酸奶中分离得到的植物乳植杆菌TXZ2‑26以及从四川泡菜中分离得到的植物乳植杆菌H8‑5、植物乳植杆菌FJ2‑3、植物乳植杆菌FJ6‑4、植物乳植杆菌H2‑4、植物乳植杆菌FJ3‑3、植物乳植杆菌F4‑1，从西藏特产奶豆腐中分离得到的植物乳植杆菌D37和模式菌株植物乳植杆菌WCFS1菌株的叶酸产量并进行比较，测定方法如下：

[0068] 将菌株接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24h。12000r/min离心5min，弃上8
清，使用无菌生理盐水将菌泥重复清洗2‑3次并重悬，将菌悬液稀释至1.0×10 CFU/mL，以
2％接种量接种于5mL MRS液体培养基中，于37℃静置避光培养12h。取1mL菌液于2mL棕色离心管，12000r/min离心5min收集发酵上清液，用于测定胞外叶酸；同时使用无菌水重悬菌泥得到菌悬液，测定菌密度(OD600)，剩余菌悬液于20M/s 60min条件下研磨破碎6次得到胞内叶酸混合液。在发酵上清液和胞内叶酸混合液中加入2.5％胰酶在37℃恒温孵育2h，对其中含有三个以上谷氨酰残基的叶酸衍生物进行解缀得到总叶酸，在‑20℃下储存直至测定。

[0069] 用HPLC测定胞外叶酸和胞内叶酸的色谱条件如下：

[0070] 色谱柱：Agilent ZORBAX SB‑C18色谱柱4.6×250mm 5μm；DAD检测器，检测波长280nm；柱温35℃；流速0.9mL/min。流动相A(0.03％三氟乙酸)和流动相B(乙腈)采用梯度洗脱：0～2min流动相A保持100％；2～4.5min流动相A由100％递减到83％；4.5～9.5min流动相A保持83％；9.5～10min流动相A增加至100％；10min～15min平衡。

[0071] 叶酸产量的比较结果如图3所示。TXZ2‑26胞内叶酸色谱图如图4所示，TXZ2‑26胞外叶酸色谱图如图5所示。

[0072] 实施例3

[0073] 本实施例通过高效液相色谱法(HPLC)考察了植物乳植杆菌TXZ 2‑26与其他发酵菌的协同作用。

[0074] 将菌株接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24h。统一调整菌株OD600为0.5，以1％接种量接种于1mL MRS液体培养基中，于37℃静置培养24h。通过比较混合培养和单独培养24h后的菌液浓度的大小来确定菌种间相互作用。如果混合培养后菌液的浓度更大，则表明有正相互作用，反之则为负相互作用。培养结果如图6所示，其中S为嗜热链球菌单独培养，L为德氏乳杆菌保加利亚亚种单独培养，S+L为嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种按1∶1的活菌数比接种培养，S+L+H8‑5/TXZ2‑26/D37/FJ2‑3为嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和植物乳植杆菌H8‑5/TXZ2‑26/D37/FJ2‑3按1∶1∶1的活菌数比接种培养。由图6可见，植物乳植杆菌H8‑5和D37与嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种共同培养表现为拮抗作用，植物乳植杆菌TXZ2‑26和FJ2‑3与嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种共同培养表现为协同作用。

[0075] 实施例4

[0076] 本实施例提供了植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株的发酵液，其制备方法为：

[0077] 将植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养12h±2h。12000r/min离心5min，弃上清，使用无菌生理盐水将菌泥重复清洗2‑3次并重悬，以2％接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置避光培养24h±2h，将菌液以12000r/min避光离心5min，得到发酵液。

[0078] 实施例5

[0079] 本实施例提供了植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株的菌泥，其制备方法为：将植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24h±2h。12000r/min离心5min，弃上清，使用无菌生理盐水将菌泥重复清洗2‑3次并重悬，以2％接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置避光培养24h±2h，将菌液以12000r/min避光离心5min，收集沉淀即为菌泥。

[0080] 实施例6

[0081] 本实施例提供了植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株和其他发酵菌的菌悬液，其制备方法为：将植物乳杆菌TXZ2‑26、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24h±2h，调整菌株浓度后，以1％接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养24h±2h。

[0082] 实施例7

[0083] 本实施例提供了植物乳杆菌TXZ 2‑26菌株缓解高盐饮食诱导的高血压的效果。

[0084] 高盐饮食诱导小鼠高血压模型建立以及分组情况：在本研究中，成年无特定病原体的C57BL/6野生型小鼠，约8～9周龄，处于性成熟阶段，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，在SPF级动物房适应1周后，将48只小鼠随机分为三组，每组12只。将小鼠饲养在受控环境条件下[12小时光/暗循环，55±5％相对湿度(RH)，23℃环境温度(Ta)]，可自由获取标准食物和水。随机将小鼠分成四组，即：正常组、高血压模型组、低产叶酸益生菌组(植物乳植杆菌F4‑1)和高产叶酸益生菌组(植物乳植杆菌TXZ 2‑26)。正常组小鼠饲喂对照饲料(AIN‑93G)，而高血压模型组和其它两种益生菌处理组将N(G)‑硝基‑L‑精氨酸甲酯(L‑NAME，0.5mg/mL)溶于水中并自由采食对照饲料，饲喂2周。随后，饲喂正常饮水、自由采食对照饲料(AIN‑93G，北京华阜康生物科技股份有限公司，北京，中国；饲料组分见表1)2周，然后饲喂4％高盐饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司，北京，中国；饲料组分见表2)3周。在共计5周的试验周期内，益生菌处理组每日灌胃200μL菌液(F 4‑1，TXZ 2‑26，1.0×
10
10 CFU/ml)，其余各组每天灌胃0.2mL生理盐水。末次给药24h后，使用无创血压测量系统(美国Visitech Systems BP‑2000)测量小鼠血压，每只小鼠的血压测量10～30次(20～
30min)，取平均值。在小鼠末次给药24h后，对所有小鼠实施禁食12h，然后进行安乐死处理，眼部静脉取血后断颈，收集血清、肾脏等组织用于后续分析。

[0085] 表1维持及高盐饲料配方组分配比表

[0086]

[0087]

[0088] 结果：

[0089] 如图7所示，高盐饮食能显著增加小鼠收缩压(SBP)、舒张压(DBP)，低产叶酸植物乳植杆菌F4‑1的干预不能显著降低小鼠收缩压，可显著降低舒张压增加；而高产叶酸植物乳杆菌TXZ 2‑26的干预既显著降低小鼠收缩压，又显著降低舒张压的增加，有效缓解高盐饮食诱导的高血压。

[0090] 如图8所示，高盐饮食显著增加了小鼠血清产炎性物质水平(IFN‑β、TNF‑α、IL‑6、IL‑1β)，低产叶酸植物乳植杆菌F4‑1的干预不能显著降低附血清产炎性物质水平增加；而高产叶酸植物乳植杆菌TXZ 2‑26的干预可有效降低血清产炎性物质水平。

[0091] 实施例8

[0092] 本实施例提供了植物乳杆菌TXZ 2‑26菌株缓解高脂饮食诱导的肥胖的效果。

[0093] 高脂饮食诱导小鼠肥胖模型建立以及分组情况：由于已知雌激素会影响小鼠机体糖、脂代谢，因此在本研究中仅使用雄性动物。在本研究中，成年无特定病原体的C57BL/6野生型小鼠，约8～9周龄，处于性成熟阶段，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，在SPF级动物房适应1周后，将48只小鼠随机分为三组，每组12只。将小鼠饲养在受控环境条件下[12小时光/暗循环，55±5％相对湿度(RH)，23℃环境温度(Ta)]，可自由获取标准食物和水。随机将小鼠分成四组，即：正常组、模型组、低产叶酸益生菌组(植物乳植杆菌F4‑1)和高产叶酸益生菌组(植物乳植杆菌TXZ 2‑26)。正常组小鼠饲喂10％低脂饲料(H10010)，而模型组和其它两种益生菌处理组饲喂60％脂肪供能高脂饲料(H10060，北京华阜康生物科技股份有限公司，北京，中国；饲料组分见表2)。小鼠每天在固定时间点进行灌胃：正常组和模型组，每天灌胃0.2mL，0.9％生理盐水；益生菌组每日灌胃200μL菌液(F 4‑1，TXZ 2‑26，1.0×10
10 CFU/mL)，实验持续12周，实验期间每天记录小鼠体重。小鼠在末次给药24h后，对所有小鼠实施禁食12h，然后进行安乐死处理，眼部静脉取血后断颈，收集血清、肝脏、皮下脂肪和附睾脂肪用于后续分析。

[0094] 表2维持及高脂饲料配方组分配比表

[0095]

[0096] 结果：

[0097] 如图9所示，高脂饮食能显著增加小鼠体重，低产叶酸植物乳植杆菌F4‑1的干预不能显著降低小鼠体重增加，而高产叶酸植物乳植杆菌TXZ 2‑26的干预显著降低小鼠体重的增加。

[0098] 如图10所示，高脂饮食显著增加了小鼠的皮下及附睾脂肪重量；低产叶酸植物乳植杆菌F4‑1的干预能够显著减少附睾脂肪重量增加，但不能显著降低皮下脂肪重量增加；而高产叶酸植物乳植杆菌TXZ 2‑26的干预既能显著减少皮下及附睾脂肪重量，甚至能显著地将皮下脂肪系数恢复至接近正常水平。

[0099] 如图11所示，高脂饮食显著增加了小鼠的肝脏总量，升高血液丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，导致肝损伤；低产叶酸植物乳植杆菌F4‑1的干预能显著降低肝脏总量，降低血液ALT和AST，能缓解肝损伤；而高产叶酸植物乳植杆菌TXZ 2‑26的干预后能进一步更显著地缓解将其恢复至接近正常水平。

[0100] 如图12所示，高脂饮食显著增加了小鼠的血清中TC(总胆固醇)、TG(总[0101] 甘油三酯)水平，低产叶酸植物乳植杆菌F4‑1的干预能显著降低血清中TC、TG水平，而高产叶酸植物乳植杆菌TXZ 2‑26的干预能进一步显著降低血清中TC、TG水平，将其恢复至接近正常水平。

[0102] 如图13所示，高脂饮食显著提高了小鼠的血清中葡萄糖水平，低产叶酸植物乳植杆菌F4‑1的干预不能显著降低血清中葡萄糖水平，而植物乳植杆菌TXZ2‑26能将其恢复至接近正常水平。

[0103] 以上结果表明，低产叶酸植物乳植杆菌F4‑1能够轻微缓解高脂饮食引起的肝损伤和血脂水平，不能全面有效减少高脂饮食导致的肥胖症状；而高产叶酸植物乳植杆菌TXZ 2‑26能够有效缓解肥胖症状，包括降低高脂饮食导致的体重增加，减少皮下脂肪、附睾脂肪以及肝脏重量、减少肝损伤，降低高血脂及高血糖将其恢复至接近正常水平。

[0104] 实施例9

[0105] 本实施例提供了一种发酵酸奶，其制备方法为：

[0106] 羊乳处理：将新鲜羊乳加热至60℃，并加入7.5％的蔗糖，在95℃下加热10min后冷却至42℃。

[0107] 将植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株、嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株按1∶1∶1的活菌数比接种至MRS液体培养基中，37℃下培养24h。将培养好的菌液在4℃，8000rmp的条件下离心5min，收集菌泥，用无菌生理盐水清洗2次并重悬，将菌悬液浓度调节
11
至1×10 CFU/mL，得到接种液。将接种液以6％的接种量接种至经过处理的羊乳中，在37℃下进行发酵。pH值达到4.7～4.2时结束发酵。然后将所得发酵羊奶在4℃下后熟24小时。

[0108] 对比例1

[0109] 本对比例提供了一种发酵酸奶，其制备方法为：

[0110] 以植物乳植杆菌D37菌株、嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株为发酵菌，按实施例9的方法制备酸奶，其中D37与嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的活菌数比均为1∶1∶1。

[0111] 对比例2

[0112] 本对比例提供了一种发酵酸奶，其制备方法为：

[0113] 以植物乳植杆菌FJ2‑3菌株、嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株为发酵菌，按实施例9的方法制备酸奶，其中FJ2‑3与嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的活菌数比均为1∶1∶1。

[0114] 对比例3

[0115] 本对比例提供了一种发酵酸奶，其制备方法为：

[0116] 以植物乳植杆菌H8‑5菌株、嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株为发酵菌，按实施例9的方法制备酸奶，其中H8‑5与嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的活菌数比均为1∶1∶1。

[0117] 对比例4

[0118] 本对比例提供了一种发酵酸奶，其制备方法为：

[0119] 以嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株为发酵菌，按实施例9的方法制备酸奶，其中嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的活菌数比均为1∶1。

[0120] 检验例

[0121] 对实施例9、对比例1～4制得的发酵酸奶进行质构、感官的测定，并对实施例9制得的发酵酸奶进行乳酸菌数、酸度、持水率和叶酸含量的测定。

[0122] 1、质构

[0123] 质构测试仪：英国stable micro systems公司TA.XT.plusC。

[0124] 测定参数：TPA模式，P/36R探头，测前速度6mm/s，测试速度1.00mm/s，测后速度5.00mm/s，位移10mm，触发力5.0g。

[0125] 结果如表3所示。

[0126] 表3质构测试结果

[0127]

[0128]

[0129] 由以上结果可见，以嗜热链球菌菌株、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株为发酵菌制得的酸奶的粘附性最大，整体来看，其质构测试结果最好。

[0130] 2、感官评定

[0131] 根据表4所示的评分标准，选择实验室10名感官评价员对实施例9、对比例1～4制得的发酵酸奶进行感官评定，结果如图14所示。综合各个指标的评分结果，实施例9制得的发酵酸奶的感官评分结果最优。

[0132] 表4发酵乳感官评分表

[0133]

[0134] 3、乳酸菌数

[0135] 称取25g样品置于盛有225mL无菌生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min均质1min‑2min，得到1：10的样品匀液，然后继续使用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选择1：1000、
1：10000、1：100000的样品稀释液在MRS琼脂培养基均匀涂布并24小时。经测定，发酵完成后
8
1：100000的样品稀释液的菌数为5×10CFU/mL，说明发酵后乳酸菌的成活率符合国标规定GB 19302‑2010食品安全国家标准，植物乳植杆菌TXZ 2‑26菌株适合用于制备发酵乳。

[0136] 4、酸度测定

[0137] 参照GB 5009.239‑2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中乳和乳制品的酸度测定，对实施例9制得的发酵酸奶进行可滴定酸度的检测。经检测，实施例9制得的发酵酸奶的TA值为128°T，符合规定。

[0138] 5、持水率测定

[0139] 将样品于4℃、4000rpm离心10min后，弃去上清液称重，按下式计算持水率：

[0140] 发酵乳持水率(％)＝(离心沉淀物重量/样品重量)×100％

[0141] 经检测，实施例9制得的发酵酸奶的持水率为53％。

[0142] 6、酸奶中的叶酸含量测定

[0143] 精确称取10g(精确到0.01)酸奶样品，加入10mL含0.5％抗坏血酸的蒸馏水中，振摇5min后，具塞，于121℃高压水解15min。试样取出冷却后加入2.5％胰酶于37℃恒温酶解2h，酶解完成后使用蒸馏水将样品定容至25mL，使用高效液相色谱法进行叶酸含量的测定。
结果如图15所示，实施例9制得的发酵酸奶的叶酸含量最高。

[0144] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。