[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种提高雏鸡早期个体发育的胚蛋微生态制剂注射方法。

[0002] 胚蛋注射被认为是促进家禽生长发育的一种有效的方式，该方式可将营养输送到胚胎内，在受精种蛋胚胎发育过程中，通过增加某些营养素的供应，减少疾病的发病率以弥补在孵化过程中发生能量不足的问题。考虑到刚孵化的雏鸡对各种病原体的易感性，胚蛋注射技术可以起到增强孵化雏鸡的免疫反应性，同时降低它们对病原体的易感性。胚蛋注射微生态制剂技术同样存在局限性，如储存运输、稀释方法、注射时机和部位、注射设备是否无菌、操作手法或孵化场管理是否规范等。

[0003] 大量研究表明，在胚胎发育时期注射营养物质后，营养物质通过羊水被口腔吞食进入胃肠道内，可提高种蛋的孵化率和出壳后雏鸡的体增重，与对照组相比，体重增加的趋势可以维持到35日龄，但胚蛋注射存在一定的应激反应。胚蛋注射效果受注射部位、注射时间、注射液的种类和注射剂量等多种因素影响。注射条件不同，注射液被胚胎吸收的利用率不同，促进胚胎发育的效果也不同。

[0004] 目前，胚胎发育时期注射微生态制剂进行早期营养调控的研究较少，如果可以在胚胎发育期注射黏膜免疫微生态制剂达到早期营养调节的目的，一方面能改善雏鸡的生长发育，另一方面可以刺激机体局部黏膜免疫，为进一步探究微生态制剂进行胚蛋注射对雏鸡免疫功能的影响奠定基础。大量研究表明在不同胚胎发育时期注射不同的生物活性物质可以促进雏鸡生长发育。胚蛋注射对于更好地推动家禽行业的健康生产与稳定发展有着重要意义，迫切需要研究绿色、安全和无残留的生物活性物质应用于家禽行业。

[0005] 通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

[0006] (1)本技术将注射时间和部位定为孵化第18.5天羊膜腔注射，能否将注射时间进一步提前或延迟，注射其他部位如气室或卵黄囊，以取得更好的促进生长、发育作用有待进一步研究。

[0007] (2)胚蛋注射构建的乳酸菌微生态制剂对SPF仔鸡的整个生命周期是否具有促进作用，从成本方面考虑是否为正效益等有关问题，还有待进一步的研究。

[0008] (3)胚蛋注射不同浓度微生态制剂对胚胎发育影响的分子机制及对SPF鸡的免疫机制尚不明确还有待进一步研究。

[0043] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0044] 本发明提供了一种用于提高雏鸡早期个体发育的胚蛋微生态制剂注射系统，包括消毒模块、微生态制剂注射模块、孵化模块、数据记录与分析模块及自动翻蛋模块；

[0045] 消毒模块负责对SPF级种蛋进行75％酒精全面消毒处理；

[0046] 微生态制剂注射模块负责在胚胎发育的第18.5天，向每枚蛋内注射设定浓度的微生态制剂溶液，并使用灭菌石蜡密封注射孔；

[0047] 孵化模块负责提供孵化条件，包括温度控制在37.5℃‑38.2℃，湿度控制在60％‑70％；

[0048] 数据记录与分析模块负责记录雏鸡出壳后的体重、孵化率、体重增长情况和采食量，并计算平均每周增重和料肉比；

[0049] 自动翻蛋模块负责每间隔2小时自动翻蛋一次，以促进胚胎均匀发育。

[0050] 其中微生态制剂注射模块包括精确控制注射量的注射器和注射针，以及用于确定羊膜腔位置的照蛋技术设备，以确保微生态制剂溶液的准确注射。

[0051] 其中孵化模块内置温湿度传感器，用于实时监测和调节孵化环境，确保孵化条件符合标准要求。

[0052] 其中数据记录与分析模块配备有传感器和数据处理单元，能够自动收集和分析数据，生成详细的报告，用于科学研究和生产管理。

[0053] 本发明提供了一种用于提高雏鸡早期个体发育的胚蛋微生态制剂注射系统，该系统包括：

[0054] 蛋处理模块，用于对SPF级种蛋进行室温放置、表面消毒、分组称重和孵化器内的孵化，其中孵化器设置有温度控制装置和湿度控制装置，以及自动翻蛋机制；

[0055] 制剂注射模块，用于在胚胎发育的第18.5天确定羊膜腔位置，并在每枚蛋内注射指定浓度的微生态制剂溶液；

[0056] 注射孔密封模块，用于在注射后使用灭菌石蜡密封注射孔，确保胚蛋的无菌状态；

[0057] 数据收集与分析模块，用于收集雏鸡出壳后的体重数据、孵化率、料重比以及肠道消化酶活性数据，并进行相应的分析。

[0058] 其中该系统使用的微生态制剂溶液为浓度为1.0×10^9CFU/mL和1.0×10^11CFU/mL的乳酸菌。

[0059] 其中该系统包括一个自动计算模块，用于根据孵出鸡数、入孵种蛋数、未受精种蛋数和破损种蛋数计算受精种蛋的孵化率。

[0060] 其中该系统包括一个料重比计算模块，用于计算总耗料与总增重的比值，以评估雏鸡的生长效率和饲料利用效率。

[0061] 在“提高雏鸡早期个体发育的胚蛋微生态制剂注射系统”中，各个模块之间的连接关系和工作原理如下所述：

[0062] 1.模块连接关系

[0063] 蛋处理模块：与孵化器连接，负责将处理后的种蛋放入孵化器中进行孵化。

[0064] 制剂注射模块：与蛋处理模块和孵化器连接，当胚胎发育到指定阶段时，通过孵化器中的蛋进行微生态制剂的注射。

[0065] 注射孔密封模块：与制剂注射模块连接，负责在注射完成后对注射孔进行密封。

[0066] 数据收集与分析模块：与孵化器、注射模块和其他相关设备连接，负责收集和分析雏鸡生长和发育相关的数据。

[0067] 2.工作原理

[0068] 蛋处理模块：种蛋在室温下放置16小时后，经过表面消毒、分组称重，然后放入孵化器。孵化器通过温度控制装置和湿度控制装置维持适宜的孵化环境，同时自动翻蛋机制模拟自然孵化过程中的母鸡翻动蛋的行为。

[0069] 制剂注射模块：当胚胎发育到第18.5天时，通过照蛋技术确定羊膜腔位置，然后使用特定的装置在蛋内注射微生态制剂溶液。

[0070] 注射孔密封模块：注射完成后，使用灭菌石蜡对注射孔进行密封，确保蛋内的无菌环境，并迅速将蛋放回孵化器。

[0071] 数据收集与分析模块：雏鸡出壳后，系统收集体重、孵化率、料重比和肠道消化酶活性等数据。通过内部算法或连接到外部计算设备进行分析，以评估雏鸡的生长状况、饲料利用效率和微生态制剂的效果。

[0072] 这个系统通过各个模块之间的协同工作，实现了对种蛋的精确处理、微生态制剂的精确注射以及雏鸡生长数据的全面收集和分析，从而提高了雏鸡的早期个体发育和整体生长效率。

[0073] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高雏鸡早期个体发育的胚蛋微生态制剂注射方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

[0074] 以下是本发明提供的两个具体的实施例以及它们的具体实现方案：

[0075] 实施例1

[0076] 1)种蛋处理与孵化设置：

[0077] 选取一批SPF级种蛋，在室温下放置16小时。

[0078] 使用75％的酒精对种蛋进行全面消毒。

[0079] 种蛋随机分组称重后放入孵化器。

[0080] 设置孵化器的温度在37.5℃至38.2℃之间，湿度为60％‑70％。

[0081] 设定孵化器每隔2小时自动翻蛋一次。

[0082] 2)微生态制剂注射：

[0083] 在胚胎发育到18.5天时，用照蛋灯确定羊膜腔的位置。

[0084] 所有注射液均注射当天配置，在37℃水浴锅预热30min后进行注射。

[0085] 向每个羊膜腔注射0.2ml含有1.0×10^9CFU/mL浓度的乳酸菌微生态制剂。

[0086] 3)注射后处理：

[0087] 注射完成后，立即在注射孔处滴上灭菌石蜡进行密封。

[0088] 将处理过的胚蛋迅速放回孵化器。

[0089] 4)孵化与数据记录：

[0090] 待雏鸡孵化出壳12小时后进行称重，并记录各组的孵化率。

[0091] 在雏鸡1、7、14、21日龄时，空腹12小时后称重体重，记录增重情况和采食量，计算平均每周增重和料肉比。

[0092] 5)肠道健康检测：

[0093] 在出壳后的第1、7、14、21日龄，从对照组和注射组中随机抽取3只鸡。

[0094] 取5cm的空肠段，清除肠道食物残渣并刮去肠黏膜表面。

[0095] 使用含有0.1mg/mL胰蛋白酶抑制剂的PBST溶液反复冲洗肠段。

[0096] 5000rpm离心6分钟后取上清液，进行肠道消化酶活性检测。

[0097] 实施例2

[0098] 1)种蛋处理与孵化设置：

[0099] 同实施例1。

[0100] 2)微生态制剂注射：

[0101] 在胚胎发育到18.5天时，用照蛋灯确定羊膜腔的位置。

[0102] 所有注射液均注射当天配置，在37℃水浴锅预热30min后进行注射。

[0103] 向每个羊膜腔注射0.2ml含有1.0×10^11CFU/mL浓度的乳酸菌微生态制剂。

[0104] 3)注射后处理：

[0105] 同实施例1。

[0106] 4)孵化与数据记录：

[0107] 同实施例1。

[0108] 5)肠道健康检测：

[0109] 同实施例1。

[0110] 在两个实施例中，不同之处在于微生态制剂的浓度不同，一个使用较低的浓度(1.0×10^9CFU/mL)，另一个使用较高的浓度(1.0×10^11CFU/mL)。通过这两个实施例，研究者能够对比不同浓度的微生态制剂对雏鸡早期发育的影响，以及对肠道健康的潜在益处。

[0111] 对于孵化率和料重比的计算：

[0112] 孵化率：`孵化率＝(孵出鸡数/(入孵种蛋数未受精蛋数破损种蛋数))×100％`[0113] 料重比：`料重比＝总耗料/总增重`

[0114] 在两个实施例中的实验操作流程是类似的，主要差异在于注射的微生态制剂浓度不同，这会导致雏鸡肠道微生态和消化酶活性的差异，以及生长发育和料肉比的变化。通过这些数据，研究人员可以评估哪一种浓度对雏鸡的早期发育更为有益。

[0115] 如图1所示，本发明实施例提供的提高雏鸡早期个体发育的胚蛋微生态制剂注射方法，包括：

[0116] S1，将SPF级种蛋室温放置16小时后，浓度为75％的酒精对蛋壳表面进行全面消毒，随机分组称重后放于孵化器；将孵化温度设置为37.5℃‑38.2℃，湿度设置为60％‑70％，每间隔2h自动翻蛋一次；

[0117] S2，在18.5胚龄，经照蛋后确定羊膜腔的位置，每枚蛋内各注射0.2ml溶液；

[0118] S3，胚蛋注射完成后，将灭菌石蜡滴在蛋壳上的注射孔进行密封，再将胚蛋迅速放回孵化出雏器内，所有受精蛋在孵化器外30min内完成胚蛋注射程序；

[0119] S4，待雏鸡出壳12h后称重，统计各组孵化率；选择1、7、14和21日龄各组雏鸡空腹12h后称量体重，每组随机抽取5‑6羽。观察体重增长情况，称量采食量，计算平均每周增重和料肉比；

[0120] S5，在出壳后的第1、7、14、21日龄，分别从对照组和注射组中随机抽取3只鸡，剖杀后取空肠5cm，去除肠道食物残渣后，刮去肠道黏膜表面，用提前在4℃冰箱预冷1.0ml含0.1mg/mL的胰蛋白酶抑制剂的PBST溶液对肠段进行反复冲洗，5000rpm离心6min后取上清，转移至新的1.5mL EP管中，将分离的肠洗液并做好标记，并检测肠道消化酶活性。

[0121] 进一步，S2中注射液为1.0×10 9CFU/mL和1.0×10 11CFU/mL乳酸菌微生态制剂。

[0122] 进一步，S4中，在孵化时，记录孵化和未孵化的雏鸡数量，以计算每个重复的雏鸡孵化率，公式如下：

[0123] 受精种蛋孵化率hatchability(％)＝孵出鸡数/(入孵种蛋数－未受精种蛋数－破损种蛋数)×100；

[0124] 料重比：料重比(g/g‑1)＝总耗料/总增重。

[0125] 参照图2所示,本发明的一种用于胚蛋羊膜腔注射微生态制剂给养提高雏鸡早期个体生长发育的方法,注射部位选择在胚蛋羊膜腔，在孵化的第18‑18.5日龄进行注射。孵化流程及注射方法如下：将SPF级种蛋室温放置16小时后，浓度为75％的酒精对蛋壳表面进行全面消毒，随机分组称重后放于孵化器。将孵化温度设置为37.5℃‑38.2℃，湿度设置为60％‑70％，每间隔2h自动翻蛋一次。在18.5胚龄，经照蛋后确定羊膜腔的位置，每枚蛋内各注射0.2ml溶液，注射操作见图1。胚蛋注射完成后，将灭菌石蜡滴在蛋壳上的注射孔进行密封，再将胚蛋迅速放回孵化出雏器内。所有注射液均注射当天配置，在37℃水浴锅预热
30min后进行；注射所有受精蛋在孵化器30min内完成胚蛋注射程序。

[0126] 采用孵化机孵化SPF蛋,试验组采用本发明方法于孵化第18‑18.5天进行胚蛋注射处理,对照组空白,待对照组与注射微生态制剂高剂量组和低剂量组雏鸡出齐后,按重复组计算孵化率,其中胚蛋注射前孵化第天通过照蛋检测到的死胚不统计在内,结果采用本发明处理的两试验组在不影响孵化率前提下，健雏率提高了生长发育早期采食量和体增重并提高了雏鸡肠道消化酶活性。

[0127] 微生态制剂的制备：该微生物制剂利用分子克隆技术，分离NDV Lasto株HN基因，并成功构建了原核表达系统表达型重组干酪乳杆菌,；将构建的微生态制剂菌液复苏后，用乳糖诱导8h，4℃10000r/min离心10min收集菌体，将微生态制剂菌液浓度调整至1.0×10 9 11
CFU/mL和1.0×10  CFU/mL，在37℃的环境中分别将制备完成的注射液进行平板菌落计数。

[0128] 实施例1：SPF蛋孵化处理效果对比

[0129] 试验组采用本发明方法于孵化第18.5天进行胚蛋注射不同浓度微生态制剂处理,对照组空白,待对照组与注射组雏鸡出齐后,按重复组计算初始蛋重、18.5胚龄蛋重及孵化率,其中胚蛋注射前孵化第18天通过照蛋检测到的死胚不统计在内；结果显示未注射组与各注射组的孵化率分别在96.23％‑98.33％之间，各组之间差异不显著结果证明胚蛋注射微生态制剂不影响孵化率。

[0130] 表1胚蛋注射微生态制剂对种SPF蛋孵化性能的影响

[0131]

[0132]

[0133] 注：同行无字母或数据肩标的字母相同表示差异不显著(P＞0.05)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

[0134] 实施例2：胚蛋注射微生态制剂对SPF雏鸡早期个体生长发育的影响[0135] 选择1、7、14和21日龄各组雏鸡空腹12h后称量体重，每组随机抽取5‑6羽。观察体重增长情况，称量采食量，计算平均每周增重和料重比。结果表2显示可知，注射组雏鸡在1‑7日龄时采食量和周增重与其他组相比差异不显著，7‑14日龄和14‑21日龄时，注射组的采食量和周增重显著高于未注射组，且注射组相比对雏鸡的体重增加有显著促进作用；7‑14和14‑21日龄时，注射组的料重比与其他组相比显著降低，对饲料摄入的促进效果更显著。

[0136] 表2胚蛋注射微生态制剂对SPF雏鸡生长性能的影响

[0137]

[0138]

[0139]

[0140] 实施例3：胚蛋注射微生态制剂对SPF雏鸡早期肠道消化酶的影响[0141] 无菌环境下，剖杀后迅速取相同位置空肠，剖杀后取空肠5cm，去除肠道食物残渣后，刮去肠道黏膜表面，用提前在4℃冰箱预冷1.0ml含0.1mg/mL的胰蛋白酶抑制剂的PBST溶液对肠段进行反复冲洗，5000rpm离心6min后取上清，转移至新的1.5mL EP管中，将分离的肠洗液测定消化酶活性；结果检测到21日龄雏鸡与照组相比，微生态制剂高剂量注射组空肠脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶活性分别显著提高了1.70％、0.70％和2.03％，随着日龄增加，注射组肠洗液脂肪酶活性和胰蛋白酶活均有所提高。18.5胚龄注射微生态制剂能有效激活酸性酶活性，与体内的酶在消化过程中相互协同，使得肠道偏向酸性，这一作用有利于刺激肠壁消化腺的代谢与分泌功能，提高消化酶的分泌量与活力。

[0142] 二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。

[0143] 1992年，全自动化胚蛋注射技术被首次提出，此技术的提出为家禽实现早期营养[供给，提高家禽产业经济效益奠定了理论基础。胚胎发育时期进行免疫接种技术是针对家禽集约化饲养模式而研发的一种新型免疫接种方法，在很多发达国家已广泛应用。

[0144] 鸡胚接种疫苗技术目前主要应用于商业化疫苗接种。1999年，超过80％肉鸡场通过胚蛋注射疫苗取替了传统的皮下注射并有效预防了马立克氏病，其他疫苗包括禽流感疫[苗和鸡毒支原体疫苗也可用于鸡胚免疫接种这些病毒在不引发疾病的前提下，可以复制和激发更好的免疫反应；Sharma and Burmester结果证实了，与传统意义上疫苗接种相比，在禽胚胎发育18d注射疫苗可更早地形成免疫机制，削弱皮下注射的应激反应，降低劳动成本，并减少污染研究表明疫苗通常在孵化前3天进行卵内注射，照蛋可以清晰地看到鸡胚，此时通过羊膜腔或肌肉注射到鸡胚中，可以使疫苗在胚胎中得到更好的消化和吸收。胚龄
18.5d注射疫苗可有效刺激抗体表达，尽管雏鸡的免疫系统在孵化后期才发育完全，该技术也广泛应用到其他商业化疫苗中。胚蛋注射疫苗技术同样存在局限性，如疫苗的储存运输、稀释方法、注射时机和部位、注射设备是否无菌、操作手法或孵化场管理是否规范等。

[0145] 早期接种功能性营养物质有几个优势：减少其他病原微生物的干扰，降低对免疫疗效的影响因素，提高被动免疫水平，且程序简单，对后期预防雏鸡疾病有一定的优势。鸡胚接种技术具有安全、有效、经济等特点使得该技术被广泛认可。

[0146] 三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。

[0147] 胚蛋注射效果受注射部位、注射时间、注射液的种类和注射剂量等多种因素影响，]注射条件不同，被胚胎吸收利用并促进胚胎发育的效果也不同。Casas‑Perez等 发现孵化第18天卵黄囊注射益生菌，可以促进家禽生长发育。Abousaad等在种蛋孵化第7胚龄向气室分别注射1mg/egg维生素C，150μg/egg维生素B6和20μg/egg维生素B12，结果发现血浆总脂质和胆固醇水平都呈下降趋势。Villaluenga等在12胚龄向气室注射低聚糖可以改善家禽[
生长性能及饲料转化率。Salary等 在14胚龄分别通过羊膜腔注射15～30mg/egg维生素E和
100μg/egg维生素B6，孵化率和血清中IgM含量与对照组相比显著提高。Zhai等在17.5胚龄通过羊膜腔注射碳水化合物，刺激肠上皮细胞增殖。Liu等在18胚龄通过卵白注射生长激素可以提高孵化雏鸡体增重并刺激胚胎时期肌肉细胞的增殖和分化，提高股骨的骨骼强度；
Li等在18胚龄羊膜腔注射免疫增强剂可有效抵抗沙门菌入侵，刺激黏膜免疫。Roudi等通过
18胚龄羊膜腔注射减毒新城疫疫苗，可显著诱导四周龄雏鸡产生抗NDV HI。马利克氏病疫苗、球虫病疫苗、新城疫疫苗、传染性法氏囊病疫苗、禽痘苗等这些商业化疫苗，已经获得生产批准，大量研究表明在胚胎发育时期通过合理注射商业化疫苗的方式可以促进家禽业发展。

[0148] 近年来的研究表明，胚蛋注射疫苗能有效解决家禽胚胎发育中出现的能量供应不足的问题，更早地刺激机体免疫，为雏鸡出壳后良好的生长发育奠定基础，为家禽生产提供了新的思路。本发明注射的微生态制剂可以将编码外源性抗原的基因插入到含有真核表达系统的质粒上，将质粒传送到雏鸡体内，激活宿主细胞表达抗原蛋白，可以更好的诱导机体产生免疫应答；目前，有关胚蛋注射的编码外源性抗原的基因微生态制剂研究鲜有报道，其作用机制尚不清晰。因此，亟待开发功能性微生态制剂，结合胚蛋注射技术使其更好的发挥免疫效果

[0149] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。