[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及OsPTST1基因在提高植物氮素利用效率和增产中的应用。

[0002] 水稻作为重要的粮食作物之一，其产量占据全国总粮的四成左右。随着人口的增加和可耕地面积的减少，未来对粮食的需求将持续增加。

[0003] 另一方面，氮素是植物必需的矿质营养元素之一，在促进植物生长发育、促进植物蛋白质和叶绿素的合成、提高作物产量方面具有重要作用。然而，在农业生产中，为了克服氮素利用率低并提高粮食产量，大量无机氮肥被广泛使用，而未被吸收利用的氮肥则流失至空气、水体或土壤中，导致温室气体排放超标、地表水富营养化以及土壤酸化等一系列破坏生态环境的问题。同时，氮肥过量使用也会对作物生长产生负面影响，如降低抗逆能力、易倒伏、品质下降和抑制根系生长等。

[0004] 因此，减少农业生产中氮肥的使用、挖掘出调控氮素吸收和利用的关键基因、提高氮素利用效率、培育氮素高效利用作物新品种，是确保农作物高产、优质和稳定的重要生物学途径之一，研发和推广氮素高效水稻品种也是未来水稻种植业的发展趋势之一。

[0005] 如何提高水稻产量、减少化学肥料的使用，实现“减肥增产”是本领域技术人员亟需解决的问题。

[0042] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0043] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。

[0044] 下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

[0045] 实施例1水稻OsPTST1基因CRISPR‑Cas9载体的构建

[0046] 根据Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.ms u.edu/)上公布的OsPTST1基因序列(如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2)，选择合适的靶序列(如SEQ ID No.3)，设计引物gRNA‑Os PTST1‑F(如SEQ ID No.4)和gRNA‑OsPTST1‑R(如SEQ IDNo.5)。

[0047] 将引物对gRNA‑OsPTST1‑F/R变性退火得到gRNA‑OsPTST1‑F/R的二聚体产物。将gRNA‑OsPTST1‑F/R的二聚体产物连入pYLgRNA‑U3载体，得到一个中间载体。然后根据参考文献：MaX,Zhang Q,Zhu Q,et al.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Mol Plant.2015；8(8):1274‑1284.中的步骤利用边切边连的方法将中间载体一起连入pYLCRISPR/Cas9‑MH终载体，得到单靶点的OsPTST1 CRISPR/Cas9基因编辑载体。载体构建成功后，最后通过农杆菌介导转化中花11的愈伤组织，获得T0代转基因植株(参见附图1)。农杆菌介导的水稻遗传转化体系参考Hiei等人(Efficient transformation ofrice(Oryza sativaL.)mediatedbyAgrobacterium and sequence analysis ofthe boundaries ofthe T‑DNA.The Plant Journal，1994)报道的方法。获得ptst1突变体植株ptst1‑1和ptst1‑2(OsPTST1基因结构及突变位点参见附图2，突变体的基因表达量参见附图4)。

[0048] 水稻OsPTST1基因，核苷酸序列如下：

[0049] AAGAGCACAAGAGTGCACGAAGACGAGACGAGAGCGAGCTGTTCATCCT

[0050] CCCACTCCACCTCGGAGCTGAGCTCTGCTTCTCTCCCGATCTCTCCACCCA

[0051] CCGCAGCAGCATCCTTTCGACCTCTCTAGGGTTCCAGCCTCGAGTTGGCCT

[0052] CGTCCCCCCCCCCCCCCCCCCACATTCGCTGCGAGGTTGCTGCTCGCTTCA

[0053] CTTGTCTTCGGTTTGATTTCCCCCCACCTAACTGATTCTGATTGATACGGCT

[0054] CGGCTCGTGTGTGCGGCTCACTTAGGTTTGGGATTCTCTTCCGGATTGGAT

[0055] TGGTGGAGTGGCAGGGAATTGTTAGTTCTGGTGTGGTTTGTGGTTAAGAG

[0056] AAGGGGTGAGGTTCTTGCTGCCGTGTATCTGTACTGATTCCTTTTGCATAG

[0057] TTGTTTTTTTTTCTTTTCGTGTATACTGTTATCTGCTACTGTATGAGAGACT

[0058] TATGTTTTGGCTAATGTTCTCGATTGGAAGCTATGAAAATGTAATTTTGAT

[0059] CTATCTTATTTCCTATTTTTGTTCAGGGAAATAGCTATGGAGTGTCTGACC

[0060] ACAAGTTTTACTAGGTAAGTTATTCTCTTGATTGTGCAATATTATTATTCA

[0061] GATATAGAATACTCCAACATGAACAGCATGTATGTATGATCTATTGATATT

[0062] GTCCGTAATCTGATTTTAGCTTGGTAAGTTAGTTAATCCCCGTACGACTTT

[0063] CAGAATTCCCCATGCCCTGTTGAAACCACATCCAGAATGCATAGTTCTTCT

[0064] TTTACCCCCCTTTTATCATTACTTTAACATGGTTAGGTGATGTTTTTGGTGA

[0065] AGGAATCCGGGAAGGGAGTATAATCTCATATGTCCGAGCGAAGCTCTGTC

[0066] TGAAAAACAAAGGATTCAAAGAAGGGTTCTATGCTATTTTCCAGCTTCCA

[0067] CAAACTCAAGACGATGTCGCAAGTTCACAACTATGGCATATCCTGTTAGC

[0068] CCAATAGCTGGCAGACGTTCAAATTGGAGATCTTTTGCTGCAAGTCTGAA

[0069] TTTGGAAGATGGTCCTGCATCCTCTGACTCAACATCATCCCCTTCAGAGCA

[0070] AACTAGTGATGGTGGTGAAGTTTATGGTGACCCTTCTGAAAATCTGAATTC

[0071] TCGGAAACTTAAATCTGACGAGGTATCATATCATCCAATTGTGTATTGTTT

[0072] CACCCATGCAGTTTTTTTTCTTTGCCAGGACGGCGGAAGGACACGCCGTCC

[0073] GAAATTCATTAGATTTTAAAAGGAGTACAGTACAAATAGCTTGGCAAACC

[0074] CGTGCAGCTTATCACTCTGCATTCCTGTACCATATGTCACTCAAAGATTAG

[0075] CAGAGCCAGCATTTCAATTCCTCCAATGAGTTCACTATAAATGATCTCTAC

[0076] TTTCAAGGCATACCTCACGTTATTATACTTTCCTGCATAAATCTTTCAGTCC

[0077] ATTTTTAGGAGTTATTGTTTGTATTTGTCAAATATTAGGTCAACAGGGGGT

[0078] TTTTAATGTAGCATCTGCGTAAGAGAAATATGTATCTGTATGATATCTATG

[0079] TGGTCTTATTCCCTAGCAGCTAAGACAGCTTAAGGAGATATTCTCCTTAAC

[0080] CCTTATAATCATAAGTATTAGAGAGTGACCTCCTTCAGAAATGAACTCAA

[0081] CAGAGAAATGGCAAACTTGATTGTAGCTCTAACAGTTGATGTTTCGGTTCG

[0082] TAGATCGCACTTGAAAGATTGATACTTCCAAAGTACAAAGAACAACGTTG

[0083] CAACTTGGTCTTTTTTTTTTCTTTTCGATTAGCAACCTACAGACACTAGCAT

[0084] TATTTTATATATGACTAATGTTGTGCTTCTCTTTTTATTTTGGCATGCAGTT

[0085] GAAATCTCTTTTGGCTGATTCAGAACGATCTAAGCTTTTGAAAAAGCTTAG

[0086] TGAAGCAAACCAATACAACCGGTTCCTCAAGAGACAGGTTCTATTATTGT

[0087] ACCTTTTTCCAAAGTGTTCATTGAATTGCATCATATATACTGTTCACAATT

[0088] ATCAGCAAATAACATAATACAGAATTGTTCATACTGAATAGCTTTCTATTA

[0089] TCTGCGACTTGAACTTTATGCTTTCTACTGAAGATAGCGCCTAGACGTTTT

[0090] GTAAAATGAAAAACAATTACTCTGTCCAGGCACTGTATTTGCTGTCATGAT

[0091] GCAAGTCAGCAAGAACTAGCAATTTTGTTCAGTCAGGATCGAATAGAATA

[0092] TAGAACTCCCCTTTTACTTGTAGATTACTGTTGTTGATTCACTTTATGCTAC

[0093] GCACTATATCGCCAGAAAAATTACATTTTTTTTATAAAAAATCTATAATGC

[0094] ATTTTGTAGTACAAATGTATTTAAATATTCCTAACGAATCCAGGACTTTGA

[0095] ACTACTGAAAGTATCTTAGGATATTTTTCTTTAAAAAATCATTCATGAACT

[0096] AGTTTGCTAAATTGAAGCTTCTTTTGCATCAGATGAATATTTTTGTGAGAT

[0097] TACATTTTTTTTGTATAAATAGCTGTCCATACAGAGTTGTGGTTATGTCAA

[0098] ATATGCACAATTCCATTTCTCTTATTAAGCACTGAATCATTGCTAACTAGA

[0099] TAGAAATGTACTATTTCTTGCAGTTGCAAATGAAGGATAATGACGTTGTG

[0100] AAGTTCAAGAGTGAACTTGCCGTTATGGAACTTGAACTGCAGGTTAGCTC

[0101] TAACAGACTTTTCTTGTTTCATAGTTCAATCATAAGCCCTTTGGGGACAGG

[0102] GGATGCTATCAACATGCCTTTAACTCATCTAGCATCTTGAGAATTCATTCA

[0103] TAACTTCATGTTTCCTTTTCCATAAAGATATCAGACTGTAAATACATGAAT

[0104] GAAGTATGTCTGGCTTCCTCTAAAGGATTGTATGATTTTGTATGCCTCTGT

[0105] ACTTTGTCTCCCCTAGGACTGGCTTTAAATCAATATATTTTGTTTCTTGGTT

[0106] TTGTTCAAACTTTTATCAGTGATCAGTATTGTTGATACTGTTACTCTAAATG

[0107] TATTTACATTTTGTATGTATTCACTGTTTCTTTATGTCCACAGGCTCTGGTT

[0108] GCCCTAGCTGAAGAGATTGCTAATTTTGATGTTCCATCTGGGTCTAGGAAG

[0109] ATAAATGGAAAATATATCCAGTCACATCTTCTCACCAGATTAGAAGGTTA

[0110] TCTCTATCACAATGCTCCAAGTTGAATTAACAATGAAATTTTCTGACGAAA

[0111] TGTTTGTTTCCTATAGCTGTTCATGATAAGGTTATGGAACAAATTAAGGAT

[0112] GTAGACTCTTTAAAGCACCAAGAAATTTCTGTCTTCTGGGTTGGCATTGCT

[0113] GAGGTAAAACAAGGTTTTTGACTTAACTCGTTATATGGAACAGAACTATT

[0114] GTCATATATCTACAGCTATCATTTATGTCCTCTATTGTTCTTCATTGGTTTT

[0115] TTGTCTGCACATCAGAATGTACAAATTATGGGCTCCTTCGATGGCTGGTCC

[0116] CAGGGAGAGGCAATGTCCATGGAGTATTCAGGTTACCAAGCAAGATTCTC

[0117] TGCAACTCTGAATCTTAGACCTGGGAGGTGTGTTTTGTGAATTCTGCAGAG

[0118] CGATCTGATTTGCTATGATTTATTTATTAACTAAACAATCTCACTTATCTGT

[0119] TTGTATGCAAAATAAAGGTATGAGATCAAATTCTTGGTTGATGGAGAGTG

[0120] GAGGCTGTCACTGGAGTACCCAATTGATGGCGAAGGTTCAATGCAGAACA

[0121] ATATACTTGTTGTAAATTAATGTAGATATCTGTTGGCTCCTAGTTTGCCAT

[0122] AGTTGTAACTTGCAGCTATAAAACCTAGCGCAAGATTGAACTGTACTCGA

[0123] TTGCTATCATGCATCCGATTTGCAAAATTTCACTTTACCATGAAATGCAAG

[0124] GCCTTTTTTTCCTGGTTGGA；SEQ ID No.1。

[0125] 水稻OsPTST1基因，CDS核苷酸序列如下：

[0126] ATGGAGTGTCTGACCACAAGTTTTACTAGGAATCCGGGAAGGGAGTATAA

[0127] TCTCATATGTCCGAGCGAAGCTCTGTCTGAAAAACAAAGGATTCAAAGAA

[0128] GGGTTCTATGCTATTTTCCAGCTTCCACAAACTCAAGACGATGTCGCAAGT

[0129] TCACAACTATGGCATATCCTGTTAGCCCAATAGCTGGCAGACGTTCAAATT

[0130] GGAGATCTTTTGCTGCAAGTCTGAATTTGGAAGATGGTCCTGCATCCTCTG

[0131] ACTCAACATCATCCCCTTCAGAGCAAACTAGTGATGGTGGTGAAGTTTAT

[0132] GGTGACCCTTCTGAAAATCTGAATTCTCGGAAACTTAAATCTGACGAGTT

[0133] GAAATCTCTTTTGGCTGATTCAGAACGATCTAAGCTTTTGAAAAAGCTTAG

[0134] TGAAGCAAACCAATACAACCGGTTCCTCAAGAGACAGTTGCAAATGAAG

[0135] GATAATGACGTTGTGAAGTTCAAGAGTGAACTTGCCGTTATGGAACTTGA

[0136] ACTGCAGGCTCTGGTTGCCCTAGCTGAAGAGATTGCTAATTTTGATGTTCC

[0137] ATCTGGGTCTAGGAAGATAAATGGAAAATATATCCAGTCACATCTTCTCA

[0138] CCAGATTAGAAGCTGTTCATGATAAGGTTATGGAACAAATTAAGGATGTA

[0139] GACTCTTTAAAGCACCAAGAAATTTCTGTCTTCTGGGTTGGCATTGCTGAG

[0140] AATGTACAAATTATGGGCTCCTTCGATGGCTGGTCCCAGGGAGAGGCAAT

[0141] GTCCATGGAGTATTCAGGTTACCAAGCAAGATTCTCTGCAACTCTGAATCT

[0142] TAGACCTGGGAGGTATGAGATCAAATTCTTGGTTGATGGAGAGTGGAGGC

[0143] TGTCACTGGAGTACCCAATTGATGGCGAAGGTTCAATGCAGAACAATATA

[0144] CTTGTTGTAAATTAA；SEQ ID No.2。

[0145] PAM

[0146] CRISPR/cas9 target site：TGGTGAAGGAATCCGGGAAGGG；SEQ ID No.3；

[0147] 含有靶序列的接头引物对，序列如下：

[0148] gRNA‑OsPTST1‑F：ggcaTGGTGAAGGAATCCGGGAA；SEQ ID

[0149] No.4；

[0150] gRNA‑OsPTST1‑R：aaacTTCCCGGATTCCTTCACCA；SEQ IDNo.5。

[0151] 实施例2水稻OsPTST1基因超表达载体的构建

[0152] 根据Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上公布的OsPTST1基因序列(如SEQ ID No.1)设计引物OE‑PTST1‑F(如SEQ ID No.6)和OE‑PTST1‑R(如SEQ ID No.7)，以NIP的cDNA为模板(因以水稻NIP为背景材料测序完成)，并在引物上分别设计酶切位点KpnI和BamHI位点，扩增目的基因从起始密码子至终止密码子的cDNA全长(如SEQ IDNo.2)。用双切双连方式将经过KpnI和BamHI酶切后纯化的目的片段连接到相同酶切后的pU1301载体上(参见附图3)(构建方法如Jian，Zhang，Babi，et al.OsMADS6 plays an essential role in endosperm nutrient accumulation and is subject to epigenetic regulation in rice(Oryza sativa)[J].The Plant Journal，2010)。将大肠杆菌DH5ɑ感受态置于冰上解冻，将连接产物加入到感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30mins；42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却3～5mins；加入700μL无抗生素的LB(Luria‑Bertani)培养液，37℃摇床上摇菌45mins；4000rpm离心1min，弃掉500μL左右上清，将剩余菌体重悬，涂布在相应抗性的LB固体平板上，37℃培养箱中倒置培养13～
16hrs。待长出单菌落后鉴定筛选阳性工程菌，使用试剂盒(上海翊圣，19001ES50)提取质粒，得到PU1301‑OsPTST1超表达载体，测序鉴定正确。载体构建成功后，进一步进行遗传转化，获得OE‑OsPTST1超表达植株(其基因表达量参见附图4)。

[0153] OE‑PTST1‑F：TTACTTCTGCACTAGGTACCTCAACATCATCC CCTTCAG；SEQ ID No.6；

[0154] OE‑PTST1‑R：TCCTCTTAGAATTCCCGGGGATTAATTTACAA CAAGTATA；SEQ ID No.7。

[0155] 实施例3水稻OsPTST1基因在水稻NIP各组织中的定量表达分析

[0156] 通过对样品RNA的提取、反转录获得cDNA，用qRT‑PCR检测OsPTST1基因的表达水平，具体方法如下：

[0157] 取水稻野生型ZH11、NIP、突变体植株ptst1和超表达植株OE‑OsPTST1新鲜叶片样品采用Trizol法提取RNA。cDNA的合成使用TOYOBO公司的反转录试剂盒First Strand cDNA Synthesis Kit Rever Tra Ace‑ɑ。合成的第一链cDNA用DEPC·H2O稀释至50μL用于克隆等分子实验。实时荧光定量qPCR(quantitative PCR)反应使用上海翊圣生物科技有限公司Hieff Power qPCR SYBR Green MasterMix。

[0158] 10μL体系包括：1μL cDNA，5μL SYBR Green MasterMix，0.2μL 10μM Primer F(forward)，0.2μL 10μM Primer R(reverse)，3.6μLddH2O。

[0159] 扩增程序是：95℃3mins，95℃10s，60℃30s，72℃15s，40个循环，在荧光定量PCR仪中进行。以Ubiquitin(LOC_Os03g13170)基因作为内参，基因的相对表达量用2‑Δ ΔCT计算。

[0160] 定量检测OsPTST1表达量的引物序列为：

[0161] OsPTST1‑qRT‑F：AAAGGATTCAAAGAAGGGTT；SEQ IDNo.8；

[0162] OsPTST1‑qRT‑R：AGCTATTGGGCTAACAGGAT；SEQ IDNo.9。

[0163] 结果表明，水稻OsPTST1基因在穗中表达最高，其次是叶鞘和叶中，OsPTST1基因在水稻地上部高表达(参见附图5)。

[0164] 实施例4水稻proOsPTST1::OsPTST1‑GUS重组载体的构建以及转化[0165] (1)利用CTAB法提取水稻NIP基因组DNA.

[0166] (2)根据RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)网站上查到的OsPTST1基因转录起始位点ATG上游2000bp序列，设计启动子OsPTST1引物。使用高保真酶KOD FX，以水稻NIP基因组DNA为模板扩增启动子OsPTST1，引物序列如下：

[0167] proOsPTST1‑F：acgaattcgagctcggtaccACAGAGAGATATCTCAG CTAG；SEQ ID No.10；

[0168] proOsPTST1‑R：TCGTGCACTCTTGTGCTCT；SEQ ID No.11。

[0169] (3)利用GUS载体用作扩增GUS基因编码序列的模板。通过高保真酶KOD FX扩增GUS基因编码序列，引物序列如下：

[0170] GUS‑F：TCGTGCACTCTTGTGCTCTATGTTACGTCCTGTAGA AACCCCA；SEQ ID No.12；

[0171] GUS‑R：caggtcgactctagaggatccTCATTGTTTGCCTCCCTGCT；SEQ ID No.13。

[0172] 最后通过同源重组的方法与KpnI和BamHI酶切处理后pYLCRISPR/CAS9Pubi‑H(参见附图1)连接，将连接产物转化到感受态细胞中，涂布在相应抗性的LB固体平板上，菌落PCR鉴定筛选阳性工程菌，提取质粒进行测序验证。最终成功构建了proOsPTST1::OsPTST1‑GUS重组载体。并通过农杆菌介导法转化进入日本晴水稻的愈伤组织中，并获得阳性的转化苗。

[0173] (4)将转基因抗性植株浸到GUS染液中，置于37℃保温箱中避光过夜。用50％，70％，100％的浓度梯度乙醇依次漂洗样品，每次浸泡5min，加入100％乙醇浸泡直至完全脱色，最后在体视显微镜下拍照记录。GUS染色液配制：将X‑gluc溶于磷酸钠缓冲液中(含
100mmol/LpH 7.0的磷酸钠缓冲液，10mmol/L EDTA，5mmol/L铁氰化钾，5mmol/L亚铁氰化钾)，终浓度为1mmol/L。结果表明，OsPTST1启动子驱动的GUS基因在穗、叶鞘和叶中表达较强，在0Dap种子和根中表达较弱，该基因在地上部组织表达量较高(参见附图6)，与定量表达结果一致。

[0174] 实施例5OsPTST1突变体植株和超表达植株表型观察和农艺性状统计[0175] 将获得的ptst1突变体植株和OE‑OsPTST1超表达植株种植于中国水稻研究所富阳基地试验田，单株种植，行距19.8cm，株距16.5cm，所有田间试验遵循正常大田的生产方式统一管理。产量性状考察：在种子成熟之后，将内行中间15～20株作为考察对象，10次重复。

[0176] 经过多世代种植后，对野生型、ptst1和OE‑PTST1株系进行农艺性状考察与分析(表型参见附图7、统计数据参见附图8)，结果显示：与野生型相比，ptst1株系在成熟期株高不变，叶片深绿；OE‑PTST1植株株高不变，叶片早衰。相较于野生型ZH11成熟籽粒，突变体ptst1株系中粒长和千粒重显著增加，最终导致单株产量增加8.9％‑11.2％；相较于野生型NIP，过表达OE‑PTST1株系粒长、粒宽和千粒重都显著减少，产量减少30.5％‑40.2％。

[0177] 实施例6OsPTST1突变体植株和超表达植株氮素利用效率测定

[0178] 在中国水稻研究所低氮(LN:施氮肥量10kg/亩)田种植本项目中所涉及的OsPTST1突变体植株和超表达植株，材料成熟后收获种子并清理干净以称量出单株产量，利用单株产量分别除以低氮田的平均施氮量，得出各遗传材料在低氮田的氮素利用效率。对野生型相比，ptst1植株在低氮田的氮素利用效显著提高(参见附图9)。

[0179] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

[0180] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。