[0001] 本发明涉及天然产物生物合成技术领域，具体是指一种链霉菌高产萜类底盘的搭建以及基于该底盘菌株用于不同种萜类化合物的高效生产。

[0002] 萜类化合物是含有异戊二烯单元的化合物的总称。它在自然界中广泛存在，迄今为止，人们从动物、植物以及微生物体内发现的萜类化合物超过12万种。该类化合物具有许多生理活性，被广泛应用于食品、化妆品及医药行业。萜类化合物主要由天然产物提取、化学合成、微生物发酵等方法。天然产物提取主要是通过对特定的植物进行萃取纯化分离获得对应的萜类化合物，然而这种生产方式受气候、品种、地理位置、成熟度等诸多不可控因素影响，具有明显的季节性，含量不稳定性，并且大面积种植、养殖的成本较高，含量通常也比较低。另外，在含有多种成分的萃取物中纯化分离特定的萜类化合物在技术上非常困难，这些共同造成了许多具有良好生理活性的化合物价格昂贵。化学合成法受到合成过程中步数众多，合成难度较大，且存在污染等特点，其产品的质量、安全性及使用范围都受到了限制。微生物发酵法主要是利用微生物的生物代谢，将基础代谢物如葡萄糖、淀粉、黄豆饼粉等廉价原料转化为对应的萜类化合物，这种方法不受季节、地域、气候等因素的影响，原料易获取、生产周期短、工艺操作简单、成本低廉、产物质量可控、产物易纯化、安全性高，并且环境污染较少，不仅解决了因种植植物等而占用大量耕地的问题，也解决了化学合成不环保的弊端。最重要的是，发酵法生产的萜类化合物属于天然型产品，其活性与天然植物提取的活性成分一致，被认为是萜类化合物生产最有前景的方法。本发明以萜类产物为研究目标，以白色链霉菌(Streptomyces albus)为异源表达宿主，打造了高产萜类的白色链霉菌底盘，建立了一个提高萜类天然产物产量的放线菌萜类高产底盘，提供了一个用链霉菌生产萜类化合物的方法。

[0003] 目前研究较多的萜类化合物产生菌的主要是酵母菌、大肠杆菌。但是酵母菌属于真核生物，培养条件和基因操作相较于细菌来说较为复杂，且在发酵过程中，会伴有其他物质产生。而大肠杆菌因为自身调控体系过于简单，次级代谢产物产生能力差，实现萜类化合物的大量生产难度较大，且存在噬菌体污染，且对于异源物质的抵抗能力差，从而造成了生产萜类的难度加大。

[0062] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。其中表示基因连接，例如1813M1(核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示)‑1813M2(:核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示)‑
1813M3(核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示)表示核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示的基因
1813M1、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因1813M2、核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的基因1813M3顺次连接(连接方式的全核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示)。

[0063] 本发明提出了一种微生物底盘细胞，根据本发明的实施例，该微生物过表达1813M1、1813M2、1813M3基因。利用根据本发明实施例的微生物，萜类前体产量显著提高。

[0064] 本发明在此基础上，提出了几种微生物，用于生产倍半萜，二萜。根据本发明的实施例，进一步过表达包括选自IspA、PtlB、1813T4、1813T2、1813T1、S1813O2、红没药醇合酶基因、bjks基因至少之一。利用根据本发明实施例的微生物，萜类产量显著提高。

[0065] 本申请所述的微生物用于生产红没药醇、阿替生酸、半日花酸、贝壳杉烯，相比于现有技术，其产量得到了显著提高，均达到克级每升。

[0066] 发明人发现，所述微生物通过进一步调控上述基因的的表达强度至少之一，微生物生产萜类的产量进一步显著提高。

[0067] 需要说明的是，通过实验发现：进一步引入表达1813M1、1813M2、1813M3基因能够达到在增强链霉菌中自身MEP途径体内高效合成萜类前体五碳单元；引入表达部分或全部1813T4、PtlB、IspA能够达到进一步高效生产倍半萜前体、二萜前体，达到微生物细胞萜类底盘构建的目的；进一步引入表达1813T2、1813O2、1813T1、bjks、红没药醇合酶基因，使得其能够将倍半萜，二萜前体进一步发生转化，达到红没药醇、阿替生酸、半日花酸、贝壳杉烯高效生产的目的。

[0068] 本发明提出了一种获得微生物生产的萜类化合物的粗品的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述微生物进行发酵处理；以及将发酵处理产物进行萃取处理，以便获得所述目标萜类化合物浸膏。利用根据本发明实施例的获得发酵萜类产物的方法，能够获得高回收率的微生物的产萜化合物。

[0069] 根据本发明的具体实施例，所述发酵处理是通过种子液发酵处理和微生物生产发酵处理两部分内容来进行的，具体如下所述：

[0070] 将接合转移筛选出来的阳性单克隆菌落转移到新的MS固体培养基上进行培养，待5‑7天长出孢子后将新鲜孢子接种到装有玻璃珠和50ml胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基的
250ml三角振荡瓶中，并加入50μL安普霉素，28℃，250rpm恒温振荡摇床培养48h。48h后将培养好的菌液转移到灭菌的基础培养基中(转接量为4％)，再次于28℃，250rpm恒温振荡摇床培养7天，即完成发酵。

[0071] 根据本发明的再一具体实施例，所述萃取收菌处理包括：将所述发酵后的发酵液进行离心，超声破碎处理以及有机萃取处理。发明人对发酵处理后的萃取过程进行了优化筛选，发明人发现，采用超声处理前用丙酮进行浸泡有助于菌体的裂解，大大提高底物的溶出速度。另外，不同的萜类化合物，胞内与胞外培养基中所具有的浓度差值不一样，受其自身所具有的转运蛋白的偏好性的影响。需要说明的是，本申请所述的“有机萃取处理”是指采取有机溶剂对超声破碎处理产物进行萃取，有机萃取的方式不受特别限制，如根据本发明的具体实施例，可以采用乙酸乙酯溶剂处理经过丙酮溶剂超声破碎处理后的所释放的胞中萜类化合物。

[0072] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0073] 实施例1确定Stremptomyces.s.1813中MEP途径合酶

[0074] 以大肠杆菌的的MEP途径为参照，通过序列同源性比对分析，从Stremptomyces.s.1813基因组测序文件中筛选出本源的MEP途径合成酶1813M1、[0075] 1813M2、1813M3。

[0076] 实施例2构建表达载体

[0077] 所有基因均通过PCR扩增获得，所用引物如序列表1所示:

[0078] 表1实施例中所用引物序列

[0079]

[0080]

[0081] 质粒构建主要采用，PCR扩增目标片段、酶切待插入载体、同源重组。具体构建方法如下：在本实施例中，发明人详细介绍了各个质粒的构建过程。

[0082] (1)二萜高产底盘相应质粒构建

[0083] pLDLL0001质粒构建：以Streptomyces.s.1813的基因组为模板，用引物1‑F/1‑R(引物序列见表1)扩增1813M1(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，用引物2‑F/2‑R扩增1813M2(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)，用引物3‑F/3‑R扩增1813M3(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)，扩增条件为：95℃，3min预变性，然后在30个PCR循环95℃,15s:60℃,15s；72℃,1min，最后72℃充分延伸10min，将带有kasO型启动子的质粒pSET‑152‑kasO用NdeI和EcoRI进行酶切，酶切37℃1.5h，经过胶回收进行产物纯化后测定DNA浓度，将上述扩增的3个片段与酶切后的pSET‑152‑kasO(核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示)的线性质粒片段同源重组用方法进行组装，反应条件37℃30min，随后转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，即获得含有
1813M1‑1813M2‑1813M3片段(其连接方式的全核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示)的质粒pLDL0001。该质粒示意图如图1所示，该质粒控制基因表达的为kasO启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO：12)，质粒复制子为P15A复制子。

[0084] pLDL0004质粒构建：以Streptomyces.s.1813的基因组为模板，通过引物4‑F/4‑R扩增核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的1813T4及其前面一段序列，将构建好的pLDL0001质粒利用NdeI进行酶切，经过胶回收纯化后利用C112同源重组试剂盒完成同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL0004质粒。该质粒示意图如图4所示，该质粒控制基因表达的为kasO启动子，质粒复制子为P15A复制子。上述2个质粒作为下一步pLDL0011、pLDL0012、pLDL0013的构建基础。

[0085] pLDL0011质粒构建：以Streptomyces.s.1813的基因组为模板，通过引物5‑F/5‑R扩增核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示1813T2及其前面一段序列，通过引物6‑F/6‑R扩增核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示1813O2，将构建好的pLDL0004质粒利用EcoRV进行酶切，经过胶回收纯化后将上述3个片段利用C115同源重组试剂盒完成同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL0011质粒。该质粒示意图如图7所示，该质粒控制基因表达的为kasO启动子，质粒复制子为P15A复制子。

[0086] pLDL0014质粒构建：将pSET‑152‑kasO用NdeI和EcoRI进行酶切，用引物6‑F/14‑R将扩增pLDL0011中构建的1813T2‑1813O2片段并与酶切后的pSET‑152‑kasO的线性质粒片段同源重组用方法进行组装，利用C115同源重组试剂盒完成同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL0014质粒。该质粒示意图如图10所示，该质粒控制基因表达的为kasO启动子，质粒复制子为P15A复制子。

[0087] pLDL0012质粒构建：以Streptomyces.s.1813的基因组为模板，通过引物5‑F/5‑R扩增1813T2及其前面一段序列(T2promoter，核苷酸序列SEQ ID N0:14)，以合成的核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示的密码子优化后bjks片段为模板，通过引物7‑F/7‑R扩增bjks，将构建好的pLDL0004质粒利用EcoRV进行酶切，经过胶回收纯化后将上述3个片段利用C115同源重组试剂盒完成同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL0012。该质粒示意图如图8所示，该质粒控制基因表达的为kasO启动子，质粒复制子为P15A复制子。

[0088] pLDL0015质粒构建：将pSET‑152‑kasO用NdeI和EcoRI进行酶切，用引物7‑F/15‑R将扩增pLDL0012中构建的1813T2‑bjks片段与酶切后的pSET‑152‑kasO的线性质粒片段同源重组用方法进行组装，利用C112同源重组试剂盒完成同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL0015质粒。该质粒示意图如图11所示，该质粒控制基因表达的为kasO启动子，质粒复制子为P15A复制子。

[0089] pLDL0013质粒的构建:以Streptomyces.s.1813的基因组为模板，通过引物5‑F/5‑R扩增核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示的1813T2及其前面一段序列，通过引物6‑F/6‑R扩增核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示的1813O2,通过引物8‑F/8‑R扩增核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示的1813T1序列，将构建好的pLDL0004质粒利用EcoRV进行酶切，经过胶回收纯化后将上述3个片段利用C115同源重组试剂盒完成同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL00013质粒构建。该质粒示意图如图9所示，该质粒控制基因表达的为kasO启动子，质粒复制子为P15A复制子。

[0090] pLDL0016质粒构建：将pSET‑152‑kasO用NdeI和EcoRI进行酶切，用引物8‑F/16‑R将扩增的pLDL0013中的1813T2和1813O2和1813T1并与酶切后的pSET‑152‑kasO的线性质粒片段同源重组用方法进行组装，利用C112同源重组试剂盒完成同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL0016质粒。该质粒示意图如图12所示，该质粒控制基因表达的为kasO启动子，质粒复制子为P15A复制子。

[0091] (2)倍半萜高产底盘相应质粒构建

[0092] pLDL0002质粒构建：以来源于文献中(C.N.Tetzla,Z.You,D.E.Cane,S.Takamatsu,S.Omura andH.Ikeda,Biochemistry,2006,45,6179‑6186.)的FPP合酶基因为模板，通过引物10‑F/10‑R扩增核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示的PtlB及其前面所带启动子(GAPDHp(SEQ ID N0:13))，并通过前端引物引入一个EcoRV酶切位点，将构建好的pLDL0001质粒利用NdeI进行酶切，经过胶回收纯化后将PCR片段PtlB与酶切载体进行同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL0002质粒，质粒示意图依次如图2所示。

[0093] pLDL0003质粒构建：以大肠杆菌K‑12MG1655的基因组为模板，通过引物9‑F/9‑R扩增核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示的IspA及其前面所带启动子(P9R7(SEQ ID N0:15))，并通过前端引物引入一个EcoRV酶切位点，将构建好的pLDL0001质粒利用NdeI进行酶切，经过胶回收纯化后将PCR片段IspA分别与酶切载体进行同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL0003质粒，质粒示意图依次如图3所示。上述2个质粒作为下一步pLDL0010质粒构建的基础。

[0094] pLDL0010质粒构建：通过化学合成密码子优化合成的柠檬链霉菌来源的红药药醇合酶基因命名成MCTC1。以经密码子优化并合成的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示的柠檬链霉菌的MCTC1基因为模版，通过引物11‑F/11‑R扩增核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示的红药药醇合酶基因基因片段，将构建好的pLDL0003质粒利用EcoRV进行酶切，经过胶回收纯化后将红没药醇合酶基因的PCR片段酶切载体分别进行同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，随后完成pLDL0010质粒构建，质粒示意图如图6所示。

[0095] pLDL0009质粒构建:按照上述方法PCR扩增得到核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示的经密码子优化的柠檬链霉菌来源的红没药醇合酶基因MCTC1，将构建好的pLDL0002粒利用EcoRV进行酶切，经过胶回收纯化红没药醇合酶基因的PCR片段酶切载体进行同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a获得质粒，获得pLDL0009质粒，质粒示意图依次如图5所示。

[0096] pLDL0017质粒构建：将pSET‑152‑kasO用NdeI和EcoRI进行酶切，用引物8‑F/17‑R将扩增的pLDL0009中的构建的MCTC1与酶切后的pSET‑152‑kasO的线性质粒片段同源重组用方法进行组装，利用C112同源重组试剂盒完成同源重组，随后转化大肠杆菌DH5a提取质粒，获得pLDL0017质粒。该质粒示意图如图13所示，该质粒控制基因表达的为kasO启动子，质粒复制子为P15A复制子。

[0097] 表2质粒对应表

[0098]

[0099] 实施例2高产不同类型的萜类的重组菌株的构建

[0100] (1)将构建好的重组质粒转化至E.coli ET12567(pUZ8002)感受态细胞中，将验证正确的含有重组质粒的E.coil ET12567(pUZ8002)接入5mL含有0.1％的安普霉素、卡那霉素以及氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，225rpm恒温振荡摇床中振荡培养12h‑18h。

[0101] (2)取上述培养好的50uLE.coil ET12567(pUZ8002)菌液至10mL含有0.1％的安普霉素、卡那霉素以及氯霉素的LB液体培养基中，于37℃，225rpm恒温振荡摇床中振荡培养至[0102] OD600＝0.3‑0.5。培养完成的菌液转移至灭菌的15ml离心管中于3500rpm，4℃条件下离心10min收集菌体，弃上清。用1mL LB液体培养基重悬菌体后再次离心。重复操作三次，去除大肠杆菌表面的抗生素。最后加入400μL LB液体培养基重悬，用于后续操作。

[0103] (3)在培养E.coil ET12567(pUZ8002)至相应OD600期间，进行链霉菌处理操作。于洁净超净台中，使用棉签或牙签将生长状况良好的白色链霉菌孢子从固体培养基平板上转移至灭菌的1.5mL离心管中离心，再用无菌水重悬，反复三次，去除菌丝体。最后加入500μL[0104] 2×YT培养基，重悬均匀并50℃热激10min。将热激完成的链霉菌孢子静置冷却至室温后于28℃恒温振荡摇床中预萌发1‑2h。

[0105] (4)将预萌发完成的链霉菌孢子离心后重新加入500μL 2×YT培养基进行重悬，再与处理好的加入400uL LB液体培养基的大肠杆菌混合均匀并在含有20mM MgCl2的ISP4固体培养基上涂布均匀。在培养基干燥后于28℃恒温培养箱中培养18‑20h。

[0106] (5)18‑20h后，将25μL萘啶酮酸以及30μL安普霉素加入600μL无菌水混合均匀后均匀涂布至平板上，晾干后继续置于28℃恒温培养箱中培养4‑6天。

[0107] (6)4‑6天后用牙签将平板上的链霉菌单克隆菌落挑取至含有0.1％安普霉素的固体培养基上(每种单克隆挑取3‑4个)，28℃恒温培养箱中培养3‑4天。

[0108] (7)3‑4天后将含有抗性的固体培养基上的菌落挑至含有0.1％安普霉素的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，于28℃恒温振荡摇床中培养2‑3天。

[0109] (8)将试管中培养的链霉菌离心后用1mL超纯水重悬，100℃煮沸10min，释放基因组。随后以其为模板进行菌液PCR验证，筛选阳性单克隆菌落进行发酵实验。得到的阳性验证结果的菌株即为成功将我们所构建的质粒整合到链霉菌体内从而获得重组菌株。即得到生产不同类型萜类的菌株L1‑L4。获得菌株L1‑L4示意图如表3所示。

[0110] 表3各菌株详细信息

[0111]

[0112]

[0113] 实施例3发酵菌株L1‑L4的方法及产物鉴定

[0114] 将接合转移筛选出来的阳性单克隆菌落转移到新的固体培养基上进行培养，待3‑4天长出孢子后即获得含有目标质粒的重组菌株,随后将新鲜孢子接种到装有玻璃珠和
50ml胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基的250ml三角振荡瓶中，并加入50μL安普霉素，28℃，
250rpm恒温振荡摇床培养48h。48h后将培养好的菌液转移到灭菌的基础培养基中(转接量为4％，培养基为上述A,B,D,E,F,G,GYE,XTM,PTMM培养基)，再次于28℃，250rpm恒温振荡摇床培养7天，即完成发酵。随后将发酵液于3750rpm，4℃，离心20min，分别获得上清和菌体沉淀，上清用乙酸乙酯进行三次萃取获得粗提物，沉淀用等体积丙酮浸泡于玻璃烧杯放入KQ5200DE型数控超声波清洗器中超声三次，每次超声2‑4小时，离心获得上清然后将丙酮吹干，水相用乙酸乙酯进行三次萃取后获得粗提物，最后合并上清和沉淀的粗提物经硅胶柱和制备型高效液相分离获得目标产物，并通过核磁进行鉴定(图19‑22)，其产量如图19‑22所示。

[0115] 通过将产半日花酸的菌株(L1)用A,B,D,E,F,G,GYE,XTM,PTMM培养基发酵，按照上述步骤后处理获得含产物的粗品，经分离确定目标分子结构后定量其最大产量为1204mg/L(B培养基)；

[0116] 通过将产贝壳杉烯的菌株(L2)用A,B,D,E,F,G,GYE,XTM,PTMM培养基发酵，按照上述步骤后处理获得含产物的粗品，经分离确定目标分子结构后定量其最大产量为1353mg/L(E培养基)；

[0117] 通过将产红没药醇的菌株(L3)用A,B,D,E,F,G,GYE,XTM,PTMM培养基发酵，按照上述步骤后处理获得含产物的粗品，经分离确定目标分子结构后定量其最大产量为1153mg/L(B培养基)；

[0118] 通过将产阿替生酸的菌株(L4)用A,B,D,E,F,G,GYE,XTM,PTMM培养基发酵，按照上述步骤后处理获得含产物的粗品，经分离确定目标分子结构后定量其最大产量为1052mg/L(PTMM培养基)。

[0119] A培养基:可溶性淀粉20g/L,葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L,NaCl 4g/L,K2HPO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,CaCO32 g/L,PH＝7.0。

[0120] B培养基:糊精40g/L，蕃茄膏7.5g/L，水解酪素2.5g/L，酵母提取物5g/L,PH＝7.0。

[0121] D培养基:葡萄糖20g/L，可溶性淀粉60g/L,大豆粉15g/L,酵母提取物5g/L,麦芽提取物5g/L,碳酸钙2g/L,NaCl 2g/L,PH＝7.2。

[0122] E培养基:酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L,葡萄糖10g/L，PH＝7.2。

[0123] F培养基:蔗糖20g/L,葡萄糖10g/L,酪蛋白氨基酸0.1g/L,酵母提取物5g/L,MOPS 5g/L,K2SO40.25 g/L,MgCl·6H2O 1g/L,微量元素盐溶液：10ml/L,PH＝7.2。微量元素盐溶液：ZnCl240mg/L,FeCl3·6H2O 200mg/L,CuCl210 mg/L,MnCl2·4H2O 10mg/L,Na2B4O7·
10H2O 10mg/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 10mg/L。

[0124] G培养基:葡萄糖31g/L,大豆粉22g/L,K2HPO4·3H2O 1.6g/L,PH＝7.2。

[0125] GYE培养基:葡萄糖15g/L,酵母提取物5g/L，CaCl2·2H2O 0.2g/L,PH＝7.2。

[0126] XTM培养基:酵母提取物10g/L,麦芽提取物10g/L,麦芽糖10g/L,微量元素盐溶液：

[0127] 10ml/L,PH＝7.2。

[0128] PTMM培养基:糊精40g/L，乳糖40g/L，酵母提取物5g/L,MOPS20g/L，微量元素盐溶液：10ml/L,PH＝7.3。

[0129] MS培养基:黄豆粉20g/L，甘露醇20g/L，CaCO33 g/L,PH＝7.2。