[0001] 本发明涉及一种适用于高密度发酵产酶的枯草芽孢杆菌底盘细胞，属于微生物学领域。

[0002] 微生物细胞工厂的催化生产核心是底盘细胞，它是合成生物学的重要的功能元件。其中枯草芽孢杆菌是工业发酵常用的模式菌株，它是被美国食品和药物管理局认可的Generally recognized as safe(GRAS)菌株，遗传背景清晰，具有良好的可操作性和安全性。

[0003] 传统的L‑谷氨酰胺酶生产方法存在一系列挑战。其中最值得关注的是底盘细胞的选择和构建，它们承担着合成L‑谷氨酰胺酶的任务。在许多情况下，选择适当的底盘细胞对于高效生产L‑谷氨酰胺酶至关重要。然而，传统的底盘细胞通常着重于产物代谢通路的改造，细胞自身具有生长速度慢、自溶和产量低等不足之处，制约了L‑谷氨酰胺酶的大规模生产。

[0004] 其次底盘细胞中与L‑谷氨酰胺酶生产无关的基因可能会竞争有限的细胞资源，降低了L‑谷氨酰胺酶的合成速率，因此底盘细胞的非必需生长代谢需要被优化，以促进L‑谷氨酰胺酶的合成，从而提高生产效率。

[0005] 为了解决这些问题，本发明提供了一种创新的底盘细胞构建方法，其中包括寿命工程以提高细胞的生物量、缓解发酵后期细胞自溶以保证延长高产期，cre‑lox基因组编辑以精简非必要代谢通路，以及遗传工程以增强L‑谷氨酰胺酶的产量。这一综合性的方法可显著提高L‑谷氨酰胺酶的生产效率，为广泛的应用领域提供了高质量的酶制备。

[0006] 与已有的研究只是通过单一代谢通路改造或表达元件改造来提高L‑谷氨酰胺酶的生产量，但它们忽视了底盘细胞自身生理性质在工业生产中的重要性与普适性。因此，对枯草芽孢杆菌底盘细胞的改造将是本发明的研究重点。

[0036] 下述实施例中涉及的培养基如下：

[0037] (1)LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

[0038] (2)LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

[0039] (3)TB培养基：酵母粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油5g/L，K2HPO412.54 g/L,KH2PO42.31g/L。

[0040] 下述实施例中涉及的检测方法如下：

[0041] L‑谷氨酸酶发酵过程和重组菌株的酶活测定方法：

[0042] 对于摇瓶阶段，将重组菌株接种到含有适当抗生素的LB培养基中，并在30℃孵育30小时。中期的实验在5‑L生物反应器中进行，采用DO‑stat喂养策略进行发酵。L‑谷氨酰胺酶活性是通过在55℃孵育5分钟后，加入80μL 20％三氯乙酸终止反应来测定的。反应混合物(1毫升)包含900μL 200mmol/L L‑谷氨酰胺和20μL L‑谷氨酰胺酶。在离心后获得的上清液中的L‑谷氨酸浓度由生物传感器分析仪(济南岩科仪器有限公司)测定。L‑谷氨酰胺酶的‑1
酶活性的一个单位(U)定义为每分钟产生1μmolL 谷氨酸所需的酶量。L‑谷氨酰胺酶的单位‑1
细胞酶活性一个单位(U/OD600)定义为每分钟产生1μmolL 谷氨酸所需的酶量/菌体OD600的数值。

[0043] 实施例1：基因的无痕敲除方法

[0044] NCBI中检索目的基因的碱基序列，并获取目的基因前后各800bp的碱基序列，设计引物。以基因mraZ为例，以B.subtilis 168基因组为模板，PCR扩增获得基因组上mraZ的上下游同源臂。从质粒p7Z6中扩增获得抗性筛选标记表达盒lox71‑zeo‑lox66片段。

[0045] 用重叠延伸PCR技术将三段DNA片段融合成一条DNA长片段，该方法分为三步进行：第一步，以B.subtilis 168基因组为模板，PCR扩增获得目的基因的上下游同源臂，以质粒p7Z6为模板，PCR扩增获得抗性筛选标记片段1ox71‑zeo‑lox66。

[0046] 表1第一步PCR反应体系

[0047]

[0048] PCR仪设置：95℃预变性5min,95℃变性30s，退火45s(退火温度由引物决定)，72℃延伸30s(延伸时间由基因大小决定，30s/kb)，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物中加入适量Goldview核酸染色液，点胶后跑核酸电泳，取出核算胶放置凝胶成像仪中观察并记录结果。切割核酸条带放置1.5mL EP管中，参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的说明书回收DNA产物，获得上游同源臂片段、1ox71‑zeo‑lox66片段和下游同源臂片段。

[0049] 表2第二步PCR反应体系

[0050]

[0051] PCR仪设置：95℃预变性5min,95℃变性30s，退火45s(退火温度由引物决定)，72℃延伸80s，15个循环,72℃延伸10min，4℃保存。第二步为三条DNA片段的预融合，产物跑验证胶，验证成功后直接作为第三步扩增反应的模板使用。

[0052] 表3第三步PCR反应体系

[0053]

[0054] 扩增条件与第一步相同。PCR产物经过纯化后，获得上游同源臂、1ox71‑zeo‑lox66和下游同源臂三段重组片段。

[0055] 设计的引物序列如表4所示。

[0056] 表4引物序列

[0057]

[0058]

[0059] 将三条DNA片段重叠延伸成一条2.2kb左右的重组DNA片段序列SEC ID NO.5；将该重组DNA片段导入B.subtilis 168感受态细胞中，具体步骤为：

[0060] (1)将保藏的B.subtilis 168划线于LB平板上，放置37℃培养箱中过夜培养12h。挑取平板中B.subtilis 168的单菌落至10mL LB培养基中，放置37℃、200r/min的摇床中培养12h。

[0061] (2)转接200μL活化好的菌液至10mL SPI培养基中，放置37℃、200r/min的摇床中培养4.5h。吸取1mL菌液转接至10mL SPII培养基中，继续放置37℃、200r/min的摇床中培养1.5‑2h。

[0062] (3)快速取出培养瓶，添加100μL 100×EGTA溶液，放置37℃、200r/min的摇床中培养10min。再次取出培养瓶，分装500μL菌液至1.5mL无菌EP管中。

[0063] (4)加入适量质粒或DNA片段(10μL)，轻轻混匀后放置37℃、200r/min的摇床中培养2h。

[0064] (5)以5000r/min离心菌体5min，弃除上清液，剩余约100μL上清重悬菌体，涂布于r涂布于含有30mg/L Zeo的LB抗性平板上，于37℃培养箱中培养16h，获得敲除目的基因的r
Zeo转化子。

[0065] 温敏型质粒pDG148中含有Cre重组酶，lox71位点和lox66位点在Cre重组酶的作用r下能够发生重组，进而将抗性基因zeo切除。因此，将pDG148转入Zeo 转化子的感受态细胞r r
中，涂布于含有50mg/L Kan的LB抗性平板上，获得无Zeo的转化子；再将所得到的转化子挑到无抗LB平板中，51℃培养48h，除去pDG148，获得无抗的目的基因敲除菌株BS3。

[0066] 实施例2：单敲除与多敲除基因菌株的构建

[0067] 按照实施例1的方法，构建敲除了枯草芽孢杆菌lytC基因的菌株BS1，敲除了枯草芽孢杆菌sigD基因的菌株BS2，敲除了枯草芽孢杆菌mraZ基因的菌株BS3，敲除了枯草芽孢杆菌sigE基因的菌株BS4。并在菌株BS1的基础上继续敲除基因sigD、sigE、mraZ得到菌株BS5。采用菌落或菌液PCR的方法验证基因的敲除，反应体系见表4。

[0068] 表4菌落及菌液PCR反应体系

[0069]

[0070] 扩增条件：95℃预变性15min,95℃变性30s，退火30s(退火温度由引物决定)，72℃延伸1min(延伸时间由基因大小决定，1min/kb)，28个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶跑胶验证。

[0071] 实施例3：Lactobacillus reuteri来源的L‑谷氨酰胺酶基因工程菌的构建[0072] 用于表达L‑谷氨酰胺酶载体的质粒是pMA5,带有启动子PipaII(SEQ ID NO.6所示)。以罗伊氏乳杆菌基因组为模板，扩增glsA基因(SEQ ID NO.7所示)。用引物P1/P2和P3/P4PCR扩增出带有15bp同源序列的载体片段和基因片段，再用In‑Fusion HD Cloning Plus kit连接酶连接，连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，经37℃培养8h,挑转化子在含有100mg/L氨苄霉素液体的LB中振荡培养，提取质粒，测序验证得到表达质粒pMA5‑glsA。

[0073] PCR反应体系为：

[0074] 5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus)10mL；

[0075] dNTP(10mmol/1)4μL；

[0076] 模板(50pmol/I)0.5μL；

[0077] PCR引物1 0.5μL；

[0078] PCR引物2 0.5μL；

[0079] PrimeSTAR HSDNA Polymerase 0.5μL；

[0080] ddH2O将体系补足50μL。

[0081] 反应程序如下：

[0082] 94℃预变性4min,98℃10s,55℃10s,72℃1.5min,进行30个循环,72℃延伸10min,降温至4℃。

[0083] 表5引物序列

[0084]

[0085] 将质粒pMA5‑glsA分别转化至实施例1～2构建的菌株BS1～BS5中，将转化子于含卡那霉素(50mg/L)的LB平板上，37℃培养8h。挑单菌落至液体LB中，37℃培养过夜，验证正确的菌株保存甘油管，分别命名为BS1‑glsA～BS5‑glsA。

[0086] 实施例4：基因工程菌摇瓶发酵生产L‑谷氨酰胺酶

[0087] 对实施例3构建的L‑谷氨酰胺酶重组菌进行摇瓶培养，检验L‑谷氨酰胺酶表达情况，培养过程如下：吸取10μL的甘油管菌液接种于装有10mL LB培养基的50mL三角瓶中，37℃,200rpm培养8‑10h。将上述培养以5％(v/v)的接种量接入装有50mL TB的250mL三角瓶中发酵，30℃,200rpm培养36h，测定胞内L‑谷氨酰胺酶酶活。得出以B.subtilis 168为宿主菌时酶活为16.79U/mL,以BS1为宿主菌时酶活为20.43U/mL,以BS2为宿主菌酶活为24.17U/mL，以BS3为宿主菌酶活为23.28U/mL,BS4为宿主菌酶活为14.17U/mL，BS5为宿主菌酶活为34.17U/mL。B.subtilis 168单位细胞酶活2.83U/mL,BS1单位细胞酶活2.94U/mL。BS2单位细胞酶活3.17U/mL,B.subtilis 168单位细胞酶活3.24U/mL。BS4单位细胞酶活2.08U/mL，BS5单位细胞酶活4.56U/mL

[0088] 结果表明，敲除基因lytC、sigD、mraZ对B.subtilis 168产酶有上升影响，BS4稍有下降，四个基因的组合敲除对B.subtilis 168产酶有着极大幅度的提升。

[0089] 实施例5:以枯草芽孢杆菌突变体为宿主的基因工程菌5‑L罐发酵

[0090] 将实施例3构建的5种L‑谷氨酰胺酶重组菌进行进行5‑L发酵培养，检验L‑谷氨酰胺酶的表达情况及重组菌生长和自溶情况。培养过程如下：吸取200μL的甘油管菌液接种于装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，37℃,200rpm，接种量100mL，培养8‑10h,将上述培养液接入装液量为1.5L的5L发酵罐，接种后初始OD600为1.41。以氨水和20％磷酸控制pH7.0,培养温度30℃,通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30％左右，当发酵对数生长期溶解氧含量高于40％时，以15mL/h的速度开始进料，当溶解氧含量再次开始增加时，进料流量增加，当L‑谷氨酰胺酶酶活下降时结束培养。

[0091] 发酵培养基：酵母粉15g/L,玉米浆25g/L,葡萄糖12g/L，柠檬酸氢二铵1g/L,Na2SO32g/L,(NH4)2SO4 2.68g/L,K2HPO4·3H2O 19.2g/L,NaH2PO4·H2O 4g/L,MgSO4·7H2O 1g/L，金属离子PTM溶液3ml/L。

[0092] 补料液培养基：葡萄糖500g/L,MgSO4·7H2O 7.89g/L,(NH4)2HPO4 63.36g/L,金属离子PTM溶液40mL/L。

[0093] 金属离子PTM溶液：：CuSO4·5H2O 6g/L,KI 0.08g/L,MnSO4·H2O 0.5g/L,Na2MoO3·2H2ON 0.2g/L,H3BO30.02g/L,CoCl20.5g/L,ZnCl220g/L,FeSO4·7H2O 65g/L，生物素0.2g/L,H2SO4 5.0g/L。

[0094] 以B.subtilis 168为宿主菌时发酵培养72h,L‑谷氨酰胺酶的酶活为1422.9U/mL。以BS1为宿主菌时发酵培养72h,L‑谷氨酰胺酶的酶活为1955.5U/mL。以BS2为宿主菌时发酵培养72h,L‑谷氨酰胺酶的酶活为1684.5U/mL,以BS3为宿主菌时发酵培养72h,L‑谷氨酰胺酶的酶活为1870.7U/mL。以BS4为宿主菌时发酵培养72h,L‑谷氨酰胺酶的酶活为1885.6U/mL。以BS5为宿主菌时发酵培养72h,L‑谷氨酰胺酶的酶活为2817.4U/mL。

[0095] 发酵过程中，记录菌株的生长和耗糖，发酵结束后记录最高单位细胞酶活。B.subtilis 168单位细胞酶活14.8U/mL,BS1单位细胞酶活15.1U/mL。BS2单位细胞酶活
15.7U/mL,B.subtilis 168单位细胞酶活16.2U/mL。BS4单位细胞酶活16.8U/mL，BS5单位细胞酶活19.6U/mL

[0096] 对比例1：

[0097] 具体实施方式同实施例1～4，区别在于，将lytC替换为肽聚糖水解酶相关基因xpF基因(SEQ ID NO.8所示)，结果显示重组菌株在发酵后期生物量下降明显，OD600降低15％。

[0098] 对比例2：

[0099] 具体实施方式同实施例1～4，区别在于，将mraZ替换为细胞分裂相关基因yluC(SEQ ID NO.9所示)，结果显示重组菌株发酵后期生物量下降明显，OD600降低18％。

[0100] 对比例3：

[0101] 具体实施方式同实施例1～4，区别在于，将sigE替换为芽孢生成相关基因spo0A基因(SEQ ID NO.10所示)，结果显示重组菌株生长缓慢，生长速率降低20％。

[0102] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。