[0001] 本发明属于基因工程制药技术领域，具体涉及一种细胞色素P450酶、核酸分子、甘草次酸衍生物及其应用，特别涉及其在制备新颖甘草次酸衍生物中的应用。

[0002] 甘草次酸是一种常见的齐墩果烷型五环三萜天然产物。目前对甘草次酸母核进行结构修饰获得的一系列甘草次酸衍生物在抗炎，抗肿瘤，抗病毒，神经保护等方面表现出广泛的药理活性。传统有机合成手段主要包括两种：基于甘草次酸骨架上A环的羟基，C环的共轭烯酮和E环的C30位羧基进行衍生化；或者基于导向基团策略活化附近的C‑H键并进行衍3
生化，进而改善其药理活性。但是由于甘草次酸B环和D环上多为化学环境相似的sp杂化的惰性C‑H键，缺乏导向基团，目前，无法通过有机合成方法实现甘草次酸B/D环的选择性C‑H活化。

[0003] 细胞色素P450酶(简称CYP450s)是一类以亚铁‑卟啉作为催化中心的金属酶，以分子氧作为氧化剂可催化底物的单加氧反应。同时酶活性口袋中的不同氨基酸残基与底物发生相互作用形成的微环境赋予了CYP450s独特的区域和立体选择性。对于结构复杂且含有多个化学环境相似的惰性C‑H键的天然产物，如甘草次酸，CYP450s是实现选择性C‑H键活化并羟基化的理想催化剂。

[0004] 通常CYP450s发生单加氧反应需要有还原蛋白辅助电子转移以及充足的NADPH供应。其中，天然融合的P450RHF具有高效的电子传递链，其融合的还原蛋白P450RHFRed与许多CYP450s适配性高，形成的人工融合酶CYP450‑RHFRed催化效率高，表达和使用方便。+
Opt13是一种亚磷酸脱氢酶，在温和的水体系中，利用Na2HPO3就能将NADP 高效转化成昂贵的NADPH辅因子并实现循环，在CYP450s的催化转化中广泛使用。

[0005] 目前，已报道的利用酶催化甘草次酸的选择性C‑H键羟基化主要通过全细胞转化的方式，利用微生物如细菌Bacillus megaterium本身的酶进行催化，这种方式通常产物背景杂，给分离纯化带来了一定的困难。尽管利用体外酶进行催化的产物谱干净，便于大规模推广，但尚未有用于甘草次酸选择性C‑H键羟基化的细菌CYP450基因被鉴定并克隆的报道。

[0088] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0089] 实施例1CYP161H12‑RHFRed在大肠杆菌中异源表达与发酵

[0090] 1、获得pET28a‑CYP161H12‑RHFRed重组表达载体

[0091] CYP161H12来源于放线菌Amycolatopsis pretoriensis，氨基酸序列Uniprot号为A0A1H5RFX8，针对大肠杆菌密码子偏好对CYP161H12进行优化得到序列为SEQ ID NO：2。以pET28a‑RHFRed质粒为表达载体，将核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的CYP161H12插入到限制性核酸内切酶酶切位点分别为NdeI和BamHI的pET28a‑RHFRed质粒上，由安徽通用生物公司合成直接获得重组载体pET28a‑CYP161H12‑RHFRed。

[0092] 其中，pET28a‑RHFRed的合成过程如下：RHFRed根据2020年文献报道的氨基酸序列，RHFRed插入到限制性核酸内切酶酶切位点分别为BamHI和XhoI的pET28a上，由安徽通用生物股份公司进行合成，获得载体pET28a‑RHFRed。RHFRed氨基酸序列为SEQ NO：3，基因序列为SEQ NO：4。

[0093] 2、pET28a‑CYP161H12‑RHFRed的异源表达与发酵

[0094] 将pET28a‑CYP161H12‑RHFRed转化至大肠杆菌BL21中，将异源表达的BL21单克隆接种至5mLLB培养基中，在37℃，220rpm下培养10h，此为种子液。往灭菌的TB培养基中以0.3％接种量加入种子液，同时往其中加入50μg/mL卡那霉素和1mL/L微量金属盐溶液(成分包括50mM FeCl3,20mM CaCl2,10mM MnSO4,10mM ZnSO4,2mM CoSO4,2mM CuCl2,2mM NiCl2,
2mM Na2MoO4,2mM H3BO3)。在37℃，220rpm下培养至OD值为0.8。在冰水浴中冷却20min后往其中加入0.1mM异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)和0.5mM 5‑氨基乙酰丙酸盐酸盐(5‑ALA)诱导菌体表达CYP161H12‑RHFRed融合蛋白，在18℃，200rpm下诱导培养20h。3750rpm离心
5min收集CYP161H12‑RHFRed蛋白表达菌体用于体外催化反应。

[0095] 实施例2亚磷酸脱氢酶opt13在大肠杆菌中表达与发酵

[0096] 1、构建pRSFDuet‑opt13重组表达载体

[0097] 以pETDuet质粒(购买于安徽通用生物股份有限公司)为载体。opt13基因(opt13基因的氨基酸和基因序列如SEQ NO 5和SEQ NO 6所示，安徽通用生物股份有限公司合成)插入载体的限酶性核酸内切酶酶切位点PstI和HindIII两端，引物为正向：TCGAGCTCGGCGCGCCTGCAGCTGCCGAAACTCGTTATAACTCAC；反向：GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTATCAGTCTGCGGCAGGATTG。将酶切线性化的载体和PCR克隆得到的基因按1：2比例混合后，在同源重组酶的作用下连接到一起，转化至大肠杆菌DH5α中表达。在LB固体培养基中培养单克隆，对单克隆进行培养，提质粒，测序获得构建正确的pETDuet‑opt13重组表达载体。

[0098] 2、pRSFDuet‑opt13的异源表达与发酵

[0099] 将pETDuet‑opt13重组表达载体转化至大肠杆菌BL21中，将异源表达的BL21单克隆接种至5mLLB培养基中，在37℃，220rpm下培养10h，此为种子液。往灭菌的TB培养基中以0.3％接种量加入种子液，同时往其中加入100μg/mL氨苄青霉素。在37℃，220rpm下培养至OD值为0.8。在冰水浴中冷却20min后往其中加入0.1mM异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)诱导菌体表达蛋白opt13，在18℃，200rpm下诱导培养20h。3750rpm离心5min收集opt13蛋白表达菌体用于体外催化反应。

[0100] 实施例3构建CYP161H12无细胞催化体系

[0101] 将实施例1收集的CYP161H12‑RHFRed菌体和实施例2收集的opt13菌体分别于0.1M，pH＝7.0kpi缓冲液中重悬至OD600＝30后超声破碎，分别得到CYP161H12‑RHFRed和opt13的细胞裂解液，两者按照体积比为CYP161H12‑RHFRed:opt13＝2:1进行混合构成了无细胞催化体系。其中CYP161H12‑RHFRed为反应催化剂。

[0102] 实施例4初步筛选评价CYP161H12对不同底物的催化能力

[0103] 将3.33mL的实施例3的CYP161H12‑RHFRed细胞裂解液和1.67mL的opt13细胞裂解液混合加入玻璃管，往其中加入预先溶于5％(v/v)DMSO的底物(甘草次酸，3‑羟基甘草次酸，3‑乙酰基甘草次酸，3‑丙酰基甘草次酸，3‑丁酰基甘草次酸，3‑氧代甘草次酸，3‑氧代‑+1‑烯甘草次酸，A环为七元内酯环的甘草次酸衍生物)(2mM,1.0equiv.)，NADP(0.5equiv.)和Na2HPO3·5H2O(50equiv.)。在23℃，220rpm下反应20h后，用1mL乙酸乙酯萃取后在
10000rpm下离心3min，取上清除去有机溶剂，将剩余样品溶于甲醇后进行液相分析。此反应‑3
中CYP161H12‑RHFRed的蛋白的浓度是3.68×10 mM，则催化剂的用量为0.18mol％。

[0104] 实施例5大规模制备酶催化氧化产物

[0105] 实施例4中经过初步筛选发现有氧化产物产生的底物进行放大反应，按照实施例3的方法，CYP161H12‑RHFRed为2L TB培养基获得的发酵菌体，opt13菌体为1L TB培养基获得的发酵菌体，将它们混合获得用于大规模制备的无细胞催化体系。在无细胞催化体系中加+入预先溶于DMSO的1equiv.底物，50equiv.Na2HPO3·5H2O和0.5equiv.NADP ，在23℃，
220rpm下反应20h后反应产物用乙酸乙酯萃取3次，浓缩，分离纯化得到氧化产物。具体催化实验参见以下实施例。

[0106] 其中，TB培养基的配方是：2.2g KH2PO4和12.3gK2HPO4·3H2O溶于0.05L蒸馏水，121℃高压灭菌20分钟作为磷源。11.8g胰蛋白胨，23.6g酵母提取物，4mL甘油中溶于入0.95L蒸馏水，121℃高压灭菌20分钟后冷却至60℃，往其中加入0.05L灭菌磷源得到1LTB培养基。

[0107] 实施例6体外酶催化转化制备甘草次酸氧化产物

[0108] 按照实施例4的方法，确定CYP161H12催化底物1的产率高达100％。羟基化产物1a：1b为39：61。按照实施例5的方法，以1g的甘草次酸制备获得1a和1b。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0109]

[0110] 化合物1a:1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δH 5.43(1H,s,H‑12),3.87(1H,dd,J＝10.7,4.7Hz,H‑3),3.01(1H,dd,J＝4.5,11.4Hz,H‑7),2.26(1H,s,H‑9),1.39,1.10,1.02,1.00,
13
0.91,0.76,0.68(s,3H×7)；C NMR(100MHz,DMSO‑d6)δC 199.1,178.2,170.2,127.9,
77.0,71.2,61.8,51.3,50.4,49.2,44.8,43.6,41.3,38.9,37.9,37.1,36.7,32.0,30.8,+
30.0,28.9,28.8,28.6,28.3,27.5,26.6,23.6,16.5,16.4,12.7；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C30H47O5 487.3423,found 487.3438。

[0111] 化合物1b:1H NMR(300MHz,Pyridine‑d5)δH 6.18(1H,s,H‑12),4.68(1H,m,H‑15),13
4.51(1H,m,H‑7),3.51(1H,m,H‑3),1.74,1.46,1.42,1.35,1.28,1.09,0.89(s,3H×7)；C NMR(75MHz,Pyridine‑d5)δC198.8,179.0,170.2,129.1,77.5,71.4,66.4,62.4,51.9,
51.7,50.3,49.7,43.9,41.3,39.4,39.4,37.9,37.7,35.9,32.2,31.3,29.2,28.6,28.5,+
28.0,27.8,18.7,16.5,16.4,13.2；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C30H47O6 503.3373,found 503.3408。

[0112] 实施例7酶催化结合有机催化合成2a和2b

[0113] 步骤A：合成底物2

[0114] 取0.5g(1equiv.)甘草次酸溶于10mL乙酸酐，在130℃加热回流1h，随后往其中加入5mL乙酸，待反应液冷却后，往其中加入冰水淬灭反应，抽滤，滤饼干燥后得到得到0.45g的底物2(白色固体，产率82％)。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0115]

[0116] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δH 5.74(1H,s,H‑12),4.53(1H,dd,J＝4.8,11.6Hz,H‑3),2.39(1H,s,H‑9),2.08(3H,s,CH3C＝O),1.38,1.25,1.18,1.15,0.90,0.90,0.86(3H,s,CH3
13
×7)；C NMR(101MHz,CDCl3):δC 200.4,181.8,171.1,169.6,128.4,80.6,61.7,55.0,
48.3,45.5,43.8,43.2,40.8,38.8,38.1,37.7,36.9,32.7,31.9,30.9,28.6,28.5,28.1,+
26.5,26.4,23.6,23.4,21.4,18.7,17.4,16.7,16.4；HRESIMS(m/z)[M+H] calculated C32H49O5 513.3580,found 513.3584。

[0117] 步骤B：酶催化合成2a和2b

[0118] 按照实施例4的方法，确定CYP161H12催化底物2的产率为92％。羟基化产物2a：2b为91：9。按照实施例5的方法，以0.2g底物2制备获得2a和2b。其中，化合物2a经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。化合物2b在本发明中首次被报道。

[0119]

[0120] 化合物2a:1H NMR(400MHz,CDCl3):δH 5.78(1H,s,H‑12),4.52(1H,dd,J＝4.9,11.4Hz,H‑3),4.10(1H,dd,J＝4.9,10.8Hz,H‑7),2.34(1H,s,H‑9),2.07(3H,s,CH3C＝O),
13
1.46,1.25,1.18,1.16,0.91,0.89,0.86(3H,s,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3):δC 199.3,
181.7,171.1,169.3,128.6,80.3,72.4,61.9,51.7,50.5,48.8,44.5,43.9,41.0,38.4,
37.8,37.6,37.0,31.8,30.9,30.1,28.7,28.5,28.5,28.0,26.6,23.7,23.5,21.3,16.7,+
16.1,12.3；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C32H49O6 529.3529,found 529.3533。化合物
1
2b：H NMR(400MHz,Pyridine‑d5):δH 6.13(1H,s,H‑12),4.76(1H,dd,J＝5.2,10.9Hz,H‑
3),4.66(1H,m,H‑15),4.44(1H,m,H‑7),2.55(1H,s,H‑9),2.04(3H,s,CH3C＝O),1.73,
13
1.41,1.34,1.33,0.93,0.93,0.88(3H,s,CH3×7)；C NMR(101MHz,Pyridine‑d5)δC 
198.5,179.1,170.3,170.3,129.0,80.1,71.1,66.4,62.1,51.7,51.6,50.3,49.7,43.8,
41.3,38.6,37.9,37.8,37.4,35.9,32.2,31.3,29.1,28.5,27.9,27.3,23.8,20.9,18.7,+
16.8,16.2,13.2；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C32H49O7 545.3478,found 545.3478。

[0121] 实施例8酶催化结合有机催化合成3a

[0122] 步骤A：合成底物3

[0123] 取0.5g(1equiv.)甘草次酸溶于15mL无水吡啶，往其中加入(1.2equiv.)丙酸酐和(0.2equiv.)DMAP。在100℃加热回流3h后待反应液冷却后，加冰水淬灭反应，抽滤，滤饼干燥后得到0.56g底物3(白色固体，产率99％)。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0124]

[0125] 1H NMR(300MHz,CDCl3):δH 5.73(1H,s,H‑12),4.54(1H,dd,J＝5.0,11.4Hz,H‑3),13
1.39,1.24,1.18,1.14,0.89,0.88,0.84(3H,s,CH3×7)；C NMR(75MHz,CDCl3):δC 200.4,
181.7,174.4,169.6,128.4,80.3,61.7,55.0,48.2,45.5,43.8,43.2,40.9,38.7,38.1,
37.7,36.9,32.7,31.9,31.0,28.5,28.5,28.1,28.1,26.5,26.4,23.6,23.4,18.7,17.4,+
16.7,16.4,9.4；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C33H51O5 527.3736,found527.3710。

[0126] 步骤B：酶催化合成3a

[0127] 按照实施例4的方法，确定CYP161H12催化底物3的产率为61％。羟基化产物为3a。按照实施例5的方法，以0.1g底物3制备获得3a。化合物3a在本发明中首次被报道。

[0128]

[0129] 化合物3a:1H NMR(300MHz,MeOD):δH 5.65(1H,s,H‑12),4.53(1H,dd,J＝4.7,11.6Hz,H‑3),4.07(1H,dd,J＝5.0,10.8Hz,H‑7),2.47(1H,s,H‑9),1.19,1.19,1.15,1.15,
13
0.94,0.94,0.86(3H,s,CH3×7)；C NMR(75MHz,MeOD)δC 200.3,179.5,174.6,171.5,
127.6,80.3,71.5,61.7,51.4,50.4,49.2,44.6,43.5,41.3,38.0,37.6,37.5,36.8,31.5,
30.7,29.7,27.9,27.8,27.5,27.4,27.1,26.3,23.1,22.6,15.8,15.3,11.6,8.3；HRESIMS+
(m/z)[M+H]calculated C33H51O6 543.3686,found 543.3724。

[0130] 实施例9酶催化结合有机催化合成4a

[0131] 步骤A：合成底物4

[0132] 取0.5g(1equiv.)甘草次酸溶于15mL无水吡啶，往其中加入(1.2equiv.)正丁酸酐和(0.2equiv.)DMAP。在100℃加热回流3h后待反应液冷却后，加冰水淬灭反应，抽滤，滤饼干燥后得到0.33g底物4(白色固体，产率78％)。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0133]

[0134] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δH 5.73(1H,s,H‑12),4.55(1H,dd,J＝4.8,11.6Hz,H‑3),2.39(1H,s,H‑9),1.39,1.24,1.18,1.14,0.89,0.89,0.85(3H,s,CH3×7),0.97(3H,t,J＝
13
7.4Hz,CH3CH2CH2C＝O)；C NMR(101MHz,CDCl3):δC 200.5,182.1,173.6,169.6,128.4,
80.3,61.7,55.0,48.2,45.5,43.8,43.2,40.8,38.8,38.1,37.7,36.9,36.8,32.7,31.9,
30.9,28.6,28.5,28.1,26.5,26.4,23.6,23.4,18.7,18.7,17.4,16.8,16.4,13.8；HRESIMS+
(m/z)[M+H]calculated C34H53O5:541.3893,found:541.3894。

[0135] 步骤B：酶催化合成4a

[0136] 按照实施例4的方法，确定CYP161H12催化底物4的产率为23％。羟基化产物为4a。按照实施例5的方法，以0.1g底物4制备获得了4a。化合物4a在本发明中首次被报道。

[0137]

[0138] 化合物4a:1H NMR(400MHz,DMSO‑d6):δH 5.44(1H,s,H‑12),4.45(1H,dd,J＝4.4,11.8Hz,H‑3),3.90(1H,dd,J＝4.8,10.7Hz,H‑7),1.40,1.06,1.00,0.96,0.83,0.82,0.73
13
(3H,s,CH3×7),0.89(3H,t,J＝7.3Hz,CH3CH2CH2C＝O)；C NMR(101MHz,DMSO‑d6):δC 
199.0,179.9,172.9,170.4,127.8,79.8,70.8,61.5,50.8,50.4,49.3,44.8,43.6,41.2,
38.02,37.9,37.8,37.0,36.3,32.0,30.8,30.0,28.8,28.6,28.3,28.1,26.6,23.8,23.5,+
18.6,17.1,16.4,13.9,12.7；HRESIMS(m/z)[M+H] calculated C34H53O6:557.3842,found:
557.3872。

[0139] 实施例10酶催化结合有机催化合成5a和5b

[0140] 步骤A：合成底物5

[0141] 取0.5g(1mmol,1equiv.)1溶于5mL THF，冰浴，往其中滴加1.5mL琼斯试剂，搅拌1.5h后，反应液由红棕色变澄清，其中有墨绿色固体块状物。冰水淬灭，抽滤，干燥后得到
0.45g底物5(白色固体，产率90％)。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0142]

[0143] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δH 5.77(1H,s,H‑12),2.47(1H,s,H‑9),1.40,1.30,1.25,13
1.19,1.13,1.09,0.88(s,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3):δC 217.3,199.7,181.8,
169.9,128.4,61.1,55.4,48.3,47.8,45.3,43.8,43.3,40.9,39.7,37.7,36.7,34.3,32.1,‑
31.9,30.9,28.6,28.5,26.5,26.4,26.4,23.4,21.5,18.8,18.5,15.7；LC‑MS:[M‑H] :
467.4。

[0144] 步骤B：酶催化合成5a和5b

[0145] 按照实施例4的方法，确定CYP161H12催化底物5的产率为87％。羟基化产物5a：5b为76：24。按照实施例5的方法，以0.5g底物5制备获得了5a和5b。其中，化合物5a经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。化合物5b在本发明中首次被报道。

[0146]

[0147] 化合物5a:1H NMR(400MHz,CDCl3):δH 5.80(1H,s,H‑12),4.13(1H,t,J＝7.9Hz,H‑13
7),2.42(1H,s,H‑9),1.46,1.29,1.24,1.20,1.12,1.07,0.87(s,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3):δC 216.8,198.8,182.0,170.0,128.5,72.0,61.1,52.2,50.3,48.9,47.4,44.7,
43.9,41.0,39.3,37.6,36.7,34.2,31.8,30.9,30.1,29.9,28.6,28.5,26.6,26.3,23.59,+
21.45,15.4,12.2；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C30H45O5 485.3267,found 485.3224。

[0148] 化合物5b:1H NMR(400MHz,Pyridine‑d5):δH 6.14(1H,s,H‑12),4.64(1H,dd,J＝5.0,11.4Hz,H‑15),4.44(1H,dd,J＝5.6,9.8Hz,H‑7),2.64(1H,s,H‑9),1.69,1.41,1.41,
13
1.34,1.18,1.07,0.88(s,CH3×7)；CNMR(101MHz,Pyridine‑d5)δC 215.3,198.1,178.9,
170.6,128.9,70.6,66.5,61.4,51.8,51.5,50.3,49.7,47.3,43.8,41.3,39.4,37.9,37.0,‑
35.9,34.3,32.2,31.3,29.1,28.5,26.2,21.4,18.7,15.5,13.1；HRESIMS(m/z)[M‑H]calculated C30H43O6 499.3060,found 499.3060。

[0149] 实施例11酶催化结合有机催化合成6a和6b

[0150] 步骤A：合成底物6

[0151] 取2g(4.2mmol,1equiv.)化合物1溶于60mL DMSO，加入(4equiv.)2‑碘酰基苯甲酸，80℃回流反应4h后冷却至室温，5％NaHCO3淬灭反应，乙醚萃取3次，合并有机层，分别用水，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，除去有机溶剂，用200‑300目硅胶柱层析(CH2Cl2:MeOH＝20：1)洗脱得到1.77g底物6(白色固体，产率89％)。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0152]

[0153] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δH 7.76(1H,d,J＝10.2Hz,H‑1),5.84(1H,d,J＝10.2Hz,13
H‑2),5.83(s,1H,H‑12),1.44,1.42,1.26,1.21,1.18,1.13,0.89(CH3×7). C NMR(101MHz,CDCl3):δC 204.7,199.2,182.2,170.8,161.7,128.2,124.6,55.6,52.8,48.4,
45.6,44.8,43.9,43.5,40.9,38.8,37.7,32.1,31.9,30.9,28.6,28.5,27.6,26.5,26.3,+
23.4,21.6,20.1,19.0,18.2.LC‑MS:[M+H]:465.2。

[0154] 步骤B：酶催化合成6a和6b

[0155] 按照实施例4的方法，确定CYP161H12催化底物6的产率为81％。羟基化产物6a：6b为76：24。按照实施例5的方法，以0.2g底物6制备获得了6a和6b。化合物6a和6b在本发明中首次被报道。

[0156]

[0157] 化合物6a:1H NMR(400MHz,MeOD):δH 7.75(1H,d,J＝10.2Hz,H‑1),5.79(1H,d,J＝10.2Hz,H‑2),5.75(1H,s,H‑12),4.13(1H,m,H‑7),2.83(1H,s,H‑9),1.52,1.43,1.21,
13
1.20,1.18,1.13,0.88(s,CH3×7)；C NMR(101MHz,MeOD)δC 205.3,199.0,179.1,172.5,
162.3,127.4,124.0,70.9,55.7,50.5,49.4,49.0,44.9,44.1,43.6,41.1,38.7,37.6,
31.5,30.6,29.7,28.6,27.9,27.4,26.6,26.3,22.5,20.7,19.2,12.0；HRESIMS(m/z)[M‑H]‑calculated C30H41O5 481.2954,found 481.2964。

[0158] 化合物6b:1H NMR(400MHz,MeOD):δH 7.74(1H,d,J＝10.3Hz,H‑1),5.80(1H,d,J＝10.4Hz,H‑2),5.82(1H,s,H‑12),4.34(1H,dd,J＝5.2,11.7Hz,H‑15),4.17(1H,dd,J＝5.2,
13
9.9Hz,H‑7),2.79(1H,s,H‑9),1.46,1.43,1.23,1.21,1.19,1.15,0.91(s,CH3×7)；C NMR(75MHz,MeOD)δC 205.2,198.4,179.0,171.9,162.2,128.0,124.0,70.3,66.3,55.6,51.2,
50.0,49.6,48.8,44.1,38.7,37.3,34.6,31.7,30.5,30.4,29.4,28.4,27.3,26.8,26.7,
20.6,19.3,17.2,12.2；HRESIMS(m/z)[M‑H]‑calculated C30H41O6 497.2903,found 
497.2924。

[0159] 实施例12酶催化结合有机催化合成7a和7b

[0160] 步骤A：合成底物7

[0161] 取0.5g(1mmol，1equiv.)化合物5溶于30mL无水CH2Cl2，加入(0.175mmol)间氯过氧苯甲酸，(3.5equiv.)碳酸锂，室温搅拌12h后用5％Na2SO3淬灭反应，CH2Cl2萃取三次，合并有机层，分别用水，饱和NaHCO3溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，除去有机溶剂，用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2：1)洗脱得到0.24g底物7(白色固体，产率46％)。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0162]

[0163] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6):δH 5.46(1H,s,H‑12),1.41,1.38,1.34,1.26,1.10,13
1.07,0.77(CH3×7). CNMR(101MHz,DMSO‑d6):δC 198.5,178.2,175.0,170.5,127.9,
85.5,61.2,52.5,49.0,48.5,45.3,43.6,43.5,41.1,39.5,38.0,32.5,32.0,31.8,31.4,
30.8,28.9,28.3,26.6,26.5,26.2,23.3,22.1,18.3,18.0.LC‑MS:[M‑H]‑:483.3。

[0164] 步骤B：酶催化合成7a和7b

[0165] 照实施例4的方法，确定CYP161H12催化底物7的转化率为87％。羟基化产物7a：7b为47：53。按照实施例5的方法，以0.2g底物7制备获得了7a和7b。化合物7a和7b在本发明中首次被报道。

[0166]

[0167] 化合物7a：1H NMR(300MHz,MeOD):δH 5.70(1H,s,H‑12),4.10(1H,dd,J＝4.4,11.0Hz,H‑7),5.75(1H,s,H‑12),2.73(1H,s,H‑9),1.53,1.53,1.46,1.39,1.19,1.18,0.87
13
(s,CH3×7)；C NMR(75MHz,MeOD)δC 199.1,179.2,176.8,171.3,127.9,85.5,70.5,61.9,
50.3,49.9,49.4,44.9,43.6,41.2,39.4,39.2,37.5,32.5,31.7,31.6,30.6,30.2,29.7,‑
27.8,27.4,26.3,25.5,22.1,17.1,10.8；HRESIMS(m/z)[M‑H] calculated C30H43O6 
499.3060,found 499.3060。

[0168] 化合物7b：1H NMR(300MHz,MeOD):δH 5.77(1H,s,H‑12),4.28(1H,dd,J＝4.4,11.0Hz,H‑15),4.14(1H,dd,J＝5.2,11.6Hz,H‑7),2.70(1H,s,H‑9),1.54,1.48,1.46,
13
1.39,1.20,1.20,0.90(s,CH3×7)；C NMR(101MHz,MeOD)δC 198.40,178.9,176.8,170.8,
128.5,85.4,69.4,66.2,61.7,51.2,50.1,49.5,43.5,40.8,39.5,39.3,37.2,34.7,31.8,
31.7,30.8,30.5,30.2,29.4,28.3,27.3,25.5,17.1,16.9,11.0；HRESIMS(m/z)[M‑H]‑calculated C30H43O7 515.3009,found 515.3019。

[0169] 实施例13酶催化结合有机催化法合成8a和8b

[0170] 步骤A：合成底物8

[0171] 取0.5g(1mmol，1equiv.)化合物2溶于8mLDMF，加入(3equiv.)碳酸钾在室温下搅拌0.5h后，滴加(2equiv.)溴化苄，100℃回流3h冷却后加水淬灭反应，抽滤，滤饼烘干得到0.53g白色固体8‑S1。将8‑S1溶于8mL甲酸乙酯，加入(16equiv,)氢化钠，室温搅拌10min后加甲醇淬灭反应，用CH2Cl2:Et2O为1:2的混合有机溶剂萃取三次，合并有机层，分别用5％ HCl，饱和NaHCO3溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂，用200‑
300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)洗脱得到0.47g 8‑S2(白色固体，两步反应总产率79％)。将0.47g(0..8mmol,1equiv.)8‑S2溶于10mL THF，往其中加入0.09g 10％Pd‑C，在氢气环境中室温搅拌8h后，用硅藻土过滤除去Pd‑C，旋蒸除去有机溶剂，用200‑300目硅胶柱层析(CH2Cl2:MeOH＝30：1)洗脱得到0.22g 8‑S3(白色固体，产率56％)。将0.22g(0.44mmol,1equiv.)8‑S3溶于5mL醋酸，往其中加入(5equiv.)NH2OH·HCl和(0.5equiv.)无水醋酸钠，在60℃下搅拌0.5h后冷却至室温，加入冰水淬灭反应析出白色固体，抽滤，将滤饼烘干后用200‑300目硅胶柱层析(CH2Cl2:MeOH＝20：1)洗脱得到0.17g底物8(白色固体，产率78％)。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0172]

[0173] 1H NMR(300MHz,CDCl3):δH 8.04(1H,s,‑CH＝N‑),5.82(1H,s,H‑12),2.57(s,1H,13
H‑9),1.42,1.35,1.27,1.27,1.21,1.13,0.89(CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3):δC 199.7,
182.2,172.3,170.2,150.4,128.5,109.1,60.1,53.3,48.2,45.3,43.9,43.4,41.0,38.4,
37.7,36.0,34.8,31.9,31.8,30.9,28.9,28.6,28.5,26.6,26.4,23.3,21.6,18.3,18.1,
15.8；LC‑MS:[M‑H]‑:492.3。

[0174] 步骤B：酶催化合成8a和8b

[0175] 照实施例4的方法，确定CYP161H12催化底物8的产率为97％。羟基化产物8a：8b为19：81。按照实施例5的方法，以0.2g底物8制备获得了8a和8b。化合物8a和8b在本发明中首次被报道。

[0176]

[0177] 化合物8a:1H NMR(300MHz,CDCl3):δH 8.03(1H,s,‑CH＝N‑),5.85(1H,s,H‑12),4.20(1H,dd,J＝4.7,10.7Hz,H‑7),2.52(1H,s,H‑9),1.49,1.33,1.25,1.25,1.22,1.12,
13
0.88(s,CH3×7)；C NMR(75MHz,CDCl3)δC 198.7,182.0,171.9,170.0,150.3,128.6,
109.2,71.9,60.1,50.4,50.3,48.9,44.7,43.9,41.1,38.4,37.6,35.6,34.6,31.8,30.9,
30.2,29.2,28.8,28.6,28.5,26.6,23.5,21.6,15.5,11.9；HRESIMS(m/z)[M‑H]‑calculated C31H42NO5 508.3063,found 508.3064。

[0178] 化合物8b:1H NMR(300MHz,MeOD):δH 8.15(1H,s,‑CH＝N‑),5.78(1H,s,H‑12),4.32(1H,dd,J＝4.2,11.7Hz,H‑15),4.17(1H,dd,J＝4.5,11.1Hz,H‑7),2.64(1H,s,H‑9),
13
1.47,1.36,1.27,1.22,1.20,1.12,0.90(s,CH3×7)；C NMR(101MHz,MeOD)δC 198.8,
178.8,172.0,171.1,150.1,128.4,109.4,70.1,66.3,59.8,51.1,50.0,49.7,49.5,43.5,
40.9,38.3,37.3,34.9,34.7,34.2,31.7,30.6,28.5,27.8,27.4,26.8,20.8,17.3,14.7,
11.6；HRESIMS(m/z)[M‑H]‑calculated C31H42NO6 524.3012,found 524.3023。

[0179] 实施例14：酶催化结合有机催化合成9a和9b

[0180] 步骤A：合成9a

[0181] 以实施例6中的酶催化产物1a作为原料，取0.05g(0.1mmol,1equiv.)1a溶于2mL DMF，往其中加入(4equiv.)碳酸钾在室温下搅拌30min，往反应液中加入(2equiv.)碘甲烷。在室温下搅拌2.5h加入水待析出大量白色固体，抽滤，收集滤饼烘干，滤饼用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)洗脱得到0.04g化合物9a(白色粉末，产率78％)。

[0182]

[0183] 化合物9a:1H NMR(300MHz,CDCl3):δH 5.72(1H,s,H‑12),4.06(1H,dd,J＝5.0,10.9Hz,H‑7),3.24(1H,t,J＝6.8Hz,H‑3),3.70(3H,s,CH3),2.55(1H,s,H‑9),1.45,1.16,
13
1.15,1.15,1.03,0.82,0.82(s,CH3×7)；C NMR(75MHz,CDCl3)δC 199.3,177.0,169.1,
128.6,78.5,72.5,61.9,51.8,51.6,50.4,49.0,44.5,44.1,41.2,38.9,38.8,37.6,37.1,
31.8,31.1,30.1,28.9,28.5,28.4,28.1,27.3,26.6,23.7,16.0,15.6,12.2；HRESIMS(m/z)+
[M+H]calculated C31H49O5 501.3580,found 501.3545。

[0184] 步骤B：合成9b

[0185] 以实施例6中的1b作为原料，按照实施例14步骤A中的酯化方法获得9b(白色粉末，产率49％)。

[0186]

[0187] 化合物9b:1H NMR(400MHz,pyridine‑d5):δH 6.06(1H,s,H‑12),4.64(1H,dd,J＝5.0,11.5Hz,H‑15),4.49(1H,dd,J＝4.5,10.8Hz,H‑7),3.66(3H,s,OCH3),3.51(1H,dd,J＝
4.5,11.6Hz,H‑3),2.48(1H,s,H‑9),1.67,1.44,1.41,1.27,1.15,1.08,0.86(s,CH3×7)；
13
C NMR(101MHz,pyridine‑d5)δC 198.7,176.6,169.6,129.1,77.5,71.4,66.3,62.4,
51.8,51.6,51.5,50.3,49.7,44.0,40.9,39.3,39.3,37.6,37.6,35.8,32.1,31.0,29.1,
28.5,28.0,27.9,27.8,18.6,16.5,16.4,13.2；HRESIMS(m/z)[M‑H]‑calculated C31H47O6515.3373,found 515.3387。

[0188] 实施例15酶催化结合有机催化合成10a和10b

[0189] 步骤A：合成10a

[0190] 以实施例6中的化合物1a作为原料，取0.04g(0.8mmol,1equiv.)1a溶于2mL DMF，往其中加入(3equiv.)碳酸钾在室温下搅拌30min，往反应液中加入(1.5equiv.)6‑溴‑1‑己烯。在室温下搅拌2.5h后加入水待析出大量白色固体，抽滤，收集滤饼烘干，滤饼用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)洗脱得到0.035g化合物10a(白色粉末，产率75％)。

[0191]

[0192] 化合物10a:1H NMR(400MHz,MeOD):δH 5.04(1H,dd,J＝1.7,17.1Hz,CH2＝CHCH2‑),4.98(1H,d,J＝10.2Hz,CH2＝CHCH2‑),4.05(1H,dd,J＝5.0,11.0Hz,H‑7),3.19(1H,dd,J＝4.5,11.7Hz,H‑3),2.42(1H,s,H‑9),1.50,1.17,1.16,1.14,1.03,0.85,0.8313
(s,CH3×7)；C NMR(101MHz,MeOD):δC 200.3,176.7,170.9,138.1,127.8,114.0,77.8,
71.7,64.1,62.0,51.5,50.4,49.2,44.6,43.9,41.1,38.6,38.6,37.5,36.9,33.0,31.5,
30.6,29.6,28.2,27.9,27.8,27.3,27.2,26.5,26.3,25.2,22.6,15.3,15.0,11.6；HRESIMS+
(m/z)[M+H]calculated C36H57O5 569.4206,found 569.4190。

[0193] 步骤B：合成10b

[0194] 以实施例6中的化合物1b作为原料，按照实施例15步骤A中的酯化方法获得化合物10b(白色粉末，产率43％)。

[0195]

[0196] 化合物10b:1H NMR(300MHz,CDCl3):δH 5.04(1H,m,CH2＝CHCH2‑),4.97(1H,m,CH2＝CHCH2‑),4.31(1H,dd,J＝4.2,11.8Hz,H‑15),4.07(1H,dd,J＝4.9,11.2Hz,H‑7),3.21(1H,dd,J＝4.6,11.8Hz,H‑3),2.37(1H,s,H‑9),1.43,1.18,1.16,1.16,1.04,0.88,0.8313
(s,CH3×7)；C NMR(101MHz,MeOD)δC 199.5,176.6,170.3,138.1,128.4,114.0,77.7,
71.0,66.2,64.1,61.8,51.3,51.2,49.8,49.5,43.8,40.7,38.6,38.6,37.2,37.1,34.7,
33.0,31.7,30.5,28.3,27.9,27.2,27.2,26.5,26.4,25.2,17.2,15.3,15.0,11.8；HRESIMS+
(m/z)[M+H]calculated C36H57O6 585.4155,found 585.4154。

[0197] 实施例16本发明产物的药理作用研究

[0198] 体外抗肿瘤活性筛选实验

[0199] 步骤A：细胞培养

[0200] 人肝癌细胞HepG2和人结肠癌细胞SW480培养于含有10％(v/v)经加热灭活的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的高糖DMEM培养液配制而成的完全培养基中，所有实验用的细胞均于37℃培养箱，5％ CO2饱和湿度培养箱中培养。

[0201] 步骤B：不同浓度化合物溶液配制

[0202] 所有化合物均用DMSO溶解最终配制成浓度为20mM的化合物母液。

[0203] 200μM化合物溶液为1mL完全培养基中，加入10μL化合物母液；

[0204] 80μM化合物溶液为1mL完全培养基中，加入4μL化合物母液；

[0205] 40μM化合物溶液为0.5mL完全培养基中，加入0.5mL 80μM化合物溶液；

[0206] 20μM化合物溶液为0.5mL完全培养基中，加入0.5mL 40μM化合物溶液；

[0207] 10μM化合物溶液为0.5mL完全培养基中，加入0.5mL 20μM化合物溶液；

[0208] 5μM化合物溶液为0.5mL完全培养基中，加入0.5mL 10μM化合物溶液；

[0209] 步骤C：细胞生长抑制活性初步筛选

[0210] 化合物对肿瘤细胞的抑制作用采用CCK8法考察。将一定密度的细胞悬液(5×104/mL细胞)接种于96孔板中，其中96孔板最外围36个孔加入200μL 0.01M，pH＝7.4PBS缓冲液，内部60个孔作为药物组，空白组和阴性对照组。每组均进行三次平行实验。

[0211] 药物组：每孔加入100μL细胞悬液，于培养箱孵育24h，加入100μL 80μM化合物溶液(化合物1加入100μL 200μM化合物溶液)共同孵育48h后每孔加入20μLCCK‑8继续孵育2h，用酶标仪检测450nm处吸光度。

[0212] 空白组：每孔加入100μL完全培养基，于培养箱孵育24h，加入100μL完全培养基孵育48h后每孔加入20μLCCK8继续孵育2h，用酶标仪检测450nm处吸光度。

[0213] 阴性对照组：每孔加入100μL细胞悬液，于培养箱孵育24h，加入100μL含有0.4μL DMSO的完全培养基共同孵育48h后每孔加入20μLCCK8继续孵育2h，用酶标仪检测450nm处吸光度。

[0214] 细胞生长抑制率按照以下公式进行计算：

[0215]

[0216] IR：Inhibitory Ratio细胞生长抑制率

[0217] ODpositive：药物组的吸光度

[0218] ODblank：空白组的吸光度

[0219] ODnegetive：阴性对照组的吸光度

[0220] 步骤D：化合物对肿瘤细胞HepG2和SW480半数生长抑制浓度IC50测定

[0221] 对于在40μM浓度下肿瘤细胞抑制率高于50％的化合物分别测试在80μM，40μM，20μM，10μM，5μM浓度梯度下的细胞生长抑制率，每个浓度设置三组平行，根据在不同浓度下的细胞抑制率，用GraphPad Prism9求得半数生长抑制浓度IC50。

[0222] 表1化合物对HepG2和SW480的IC50(μmol/L)列表

[0223]

[0224] 本发明提供的一系列含有B环和/或者D环羟基的甘草次酸衍生物体外抗肿瘤活性筛选实验显示，化合10a对于人结肠癌细胞比母体化合物1甘草次酸的活性提高两倍以上；化合物10b对于人肝癌细胞和人结肠癌细胞比母体化合物1甘草次酸的活性均提高两倍以上，以上结果表明利用本发明提供的细胞色素P450酶‑CYP161H12获得的甘草次酸结构骨架中C7β和C15α位点发生选择性C‑H键羟基化产物具有潜在抗肿瘤活性，有望基于羟基化位点进行衍生化制备结构新颖的抗肿瘤活性药物。