[0001] 本发明涉及对生物合成方法的改进，具体涉及改造人工“两步法”萜类生产途径及利用大肠杆菌高产drimane型萜类化合物。

[0002] 萜类化合物是部分来源于萜类途径的混合天然产物，主要存在于真菌、海洋生物和高等植物中，在细菌中的报道较少。其中，drimane‑type merosesquiterpenoids(DMTs)因其结构多样性和显著的生物特性而备受关注。迄今为止，已从天然资源中鉴定出500多种具有不同结构和强效生物活性的DMTs。DMTs结构的多样性赋予了它们广泛的生物活性。例如，具有drimane骨架的一系列代谢产物pyripyropenes A‑R，具有胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制活性。同时drimane型天然产物如水蓼二醛具有很好的抗真菌、抗病毒等活性，目前已经作为抗菌增强剂广泛应用。

[0003] 目前常用于合成DMTs的传统手性原料(如香紫苏内酯和香紫苏醇)面临着很大挑战，如合成路线复杂，产物收率较低以及降碳带来的原子不经济性。为了应对这些挑战，研究人员不断探索并发现了其他手性构建模块，如drimane型化合物drimenol和albicanol，它们作为DMT合成中的直接drimane核心具有更高的原子经济性。

[0004] 因此，提高drimenol和albicanol的产量，通过廉价的生产获得大量化合物对后续其功能产品开发具有重要推动作用。目前生产的drimenol和albicanol的方法有化学合成法，但是步骤繁琐，并且环境不友好。之前有研究通过异源表达获得drimenol和albicanol，如在烟叶中表达植物来源drimenol合酶PhDS，获得392μg/g鲜重产量，选择酿酒酵母作为底盘异源表达albicanol合酶AncC，4L发酵培养基96h只获得了8.3mg产物。萜类化合物生物合成途径有经典的MVA途径和MEP途径，近十年来，随着生物合成技术的发展，利用人工“两步法”合成萜类化合物逐渐受到人们的关注，“两步法”途径反应体系外源加入商业化的五碳醇化合物，经过两步磷酸化反应，即可生成萜类生物合成前体化合物异戊烯基焦磷酸DMAPP和IPP，相较于经典途径的优势在于：参与的酶少，反应过程好调控，更具工业化生产应用前景。同时，对于本研究选用的两步法途径的第一步酸性磷酸酶PhoN，作为一个催化可逆反应的磷酸酶，已有相关研究对其催化反应的动力学进行测定，发现其磷酸化反应的Km值远大于水解反应。

[0005] 基于现有“两步法”途径发酵生成drimenol产量较低，只有15mg/L，远远达不到工业化生产应用的水平。

[0006] 关于近年来优化“两步法”发酵生产萜类化合物的研究中，大多数集中在尝试替换不同来源的磷酸酶，比较产量最佳的磷酸酶，以及发酵条件的优化。目前还没有对两步法途径中的磷酸酶进行改造提高产量的研究。

[0030] 选择人工“两步法”途径生产萜类生产前体DMAPP和IPP，投入原料DMAA和ISO，在酸性磷酸水解酶PhoN和磷酸激酶IPK的作用下生成DMAPP和IPP。此外，此外还加入了异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)，以促进DMAPP和IPP之间的相互转化。接下来，在FPP合成酶IspA的作用下形成法尼基二磷酸(FPP)，并在细菌drimenol和albicanol合成酶SsDMS和AncC的作用下生成drimenol和albicanol。

[0031]

[0032] 本发明在实验室前期研究基础之上，首先构建三质粒生产drimenol体系，选择Shigella flexneri来源的酸性磷酸酶PhoN作为两步法途径的第一步磷酸激酶，选择Thermoplasmaacidophilum来源的磷酸激酶IPK作为第二步的酶，在发酵过程中投入五碳醇底物3‑甲基‑2‑丁烯‑1醇(DMAA)和3‑甲基‑3‑丁烯‑1醇(ISO)，经过连续两步磷酸化反应，得到萜类化合物生物合成前体DMAPP和IPP，进而在来源于E.coli的法尼基焦磷酸合成酶IspA的作用下生成法尼基焦磷酸FPP，同时引入异戊烯基焦磷酸异构酶IDI，再经过drimenol合酶SsDMS(氨基酸序列NCBI登录号为：A0A2P2GK84)的作用下环化生成补身基焦磷酸，之后在大肠杆菌内源性水解酶的作用下可以生成drimenol，质粒构建方法见实施例1。

[0033] 实施例1

[0034] 三质粒生产drimenol质粒的构建

[0035] pCDFDuet‑Ipk‑ispA‑IDI质粒构建，设计引物(Forward：TCATCACCACAGCCAGGATATGGACCCTTTTACCATGATGATT，Reverse：GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAA)从实验室原有质粒pLD10012中通过PCR克隆出ipk，ispA，idi基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：11～13所示)，BamHI和HindIII(Takara公司)双酶切pCDFDuet‑1载体并将合酶基因通过ClonExpress IIOne Step Cloning Kit同源重组到载体上，并转化到E.coli DH5α中，通过PCR鉴定挑选出阳性克隆，并通过测序鉴定(测序引物：ACYCDuetUP1：GGATCTCGACGCTCTCCCT，T7 terminator：GCTAGTTATTGCTCAGCGG)。

[0036] pRSFDuet‑PhoN质粒构建，设计引物(Forward：

[0037] TCATCACCACAGCCAGGATATGAA GCGCCAGCTGTTTAC，Reverse：GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTACTTTTTCTGATTAT TGGCAAATTC)从实验室原有质粒pLD10012中通过PCR克隆出phoN基因，BamHI和HindIII(Takara公司)双酶切pRSFDuet‑1载体并将合酶基因通过ClonExpress IIOne Step Cloning Kit同源重组到载体上，并转化到E.coli DH5α中，通过PCR鉴定挑选出阳性克隆，并通过测序鉴定(测序引物：DuetDOWN 1：GATTATGCGGCCGTGTACAA)。

[0038] pETDuet‑SsDMS质粒构建，设计引物(Forward：

[0039] GCGATCGCTGACGTCGGTACCGTGAACGCATCACCGACGC，Reverse：TTTACCAGACTCGAGGGTACCTCATCGGGAGCAGCCTTCG)从焦土链霉菌中通过PCR克隆出ssdms基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示)，KpnI(Takara公司)单酶切pETDuet‑1载体并将合酶基因通过ClonExpress IIOne Step Cloning Kit同源重组到载体上，并转化到E.coli DH5α中，通过PCR鉴定挑选出阳性克隆，并通过测序鉴定(测序引物：DuetDOWN1：GATTATGCGGCCGTGTACAA)。

[0040] 实施例2

[0041] 大肠杆菌体内发酵生产drimenol和albicanol及后处理方法

[0042] 发酵前，将待发酵菌株接种到5ml的含0.1％抗性的LB液体培养基的试管中，于37℃摇床中230rpm振荡培养12h作为种子液，之后将种子液按0.5％接种到50ml TB培养基的250ml三角锥形瓶中，并加入0.1％相应抗生素，TB培养基灭菌前添加2％的甘油。接种后放入37℃摇床中230rpm振荡培养约2.5～3h，至OD600达到1.3～1.4后迅速放入冰上冷却降温，之后于超净台中加入0.25mM的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂，放入18℃摇床中
200rpm培养72h。

[0043] 待发酵结束后，取两个ep管，其中一个用分析天平称取空管重量，将发酵液涡旋振荡混匀后分别取1ml加入到ep管中，使用eppendorf高速离心机12000rpm离心5min后，倒掉上清，称取重量的ep管放入60℃烘箱烘干至恒重，再次用分析天平称重，减去空管重量即为1 ml发酵液的干重(DCW)。另一个ep管倒出上清后加入500ml丙酮，将菌体沉淀与丙酮涡旋振荡混匀后超声4h，超声频率40kHz，功率200W。之后于高速离心机12000rpm离心20min后，取上清丙酮层过有机滤膜后用HPLC分析，每次进样量5μ L，根据峰面积计算发酵产量，计算得三质粒生产drimenol产量为14.7mg/L。

[0044] 实施例3

[0045] drimenol合酶融合水解酶表达质粒构建

[0046] 目前构建的生产体系是依赖大肠杆菌内源性的水解酶发作用，为了增加drimenol发酵产量，考虑引入外源的水解酶，如图1A所示，于是对焦土链霉菌(Streptomyces showdoensis)中drimenol合酶SsDMS周

[0047] 围基因进行分析，在其上游存在一个功能注释为水解酶的SsNDH蛋白(氨基酸序列NCBI登录号为A0A2P2GK86，核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示)，将其和SsDMS构建到同一个质粒上进行表达，每个基因前面都有一个T7启动子，发酵得到drimenol产量为63.0 mg/L，比不加入外源水解酶产量提高了4.3倍，证实了内源性水解酶催化效率不足的猜测。之后，为进一步提高产量，尝试将水解酶和环化酶进行融合表达。通过AlphaFold2预测融合蛋白，附图如图1C，水解酶的C末端和环化酶的N末端都有一段无序的loop结构域，这一段无序loop的存在使得水解酶的活性口袋靠近环化酶活性口袋βγ结构域的上方，使得环化反应的产物补身基焦磷酸更快速地到达水解反应的催化中心。于是构建融合表达质粒，两蛋白直接融合时产量为99.7mg/L，比不融合表达提高了1.6倍。之后，为了延长融合蛋白中间的无序loop区域，参考萜类合酶和p450氧化酶融合表达的方法，加入灵活的Gly‑Ser‑Gly(GSG)linker，并探究重复序列的最适长度，结果表明当(GSG)nlinker的n＝3时，产量最高，为110.8mg/L，比不加linker的产量略有提高，比不引入水解酶的发酵产量提高7.5倍，说明融合水解酶对产量提高具有显著的意义，发酵数据如图1B，因此后续研究选择加入(GSG)3linker的融合表达蛋白进行后续优化。

[0048] 具体操作方法：

[0049] pETDuet‑Hydro‑SsDMS质粒构建(不融合表达)：设计引物(Forward：TCATCACCACAGC CAGGATGTGACGGCGCACGAAACG，Reverse：GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTCACGTCGGACGGGTGGT)从Streptomycesshowdoensis基因组组中PCR出水解酶A0A2P2GK86，对pETDuet‑SsDMS质粒BamHI和HindIII双酶切，并将水解酶基因同源重组到载体上，并转化到E.coli DH5α中，通过PCR鉴定挑选出阳性克隆，并通过测序鉴定(测序引物：DuetDOWN1：
GATTATGCGGCCGTGTACAA)。

[0050] pETDuet‑Hydro‑SsDMS(R)质粒构建(融合表达)：设计引物对(Forward：TCATCACCACAGCCAGGATGTGACGGCGCACGAAACG，Reverse：TGATGCGTTCATCGTCGGACGGGTGGTGGG)和(Forward：GTCCGACGATGAACGCATCACCGACGC，Reverse：GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTCATCGGGAGCAGCCTTCG)从pETDuet‑Hydro‑SsDMS质粒中分别PCR出水解酶SsNDH和drimenol合酶SsDMS，对pETDuet‑1质粒BamHI和HindIII双酶切，并将水解酶基因同源重组到载体上，并转化到E.coli DH5α中，通过PCR鉴定挑选出阳性克隆，并通过测序鉴定(测序引物：DuetDOWN1：GATTATGCGGCCGTGTACAA，pET Upstream Primer：ATGCGTCCGGCGTAGA)。

[0051] 表1不同长度的linker的引物对应表

[0052]

[0053] 在融合蛋白基础上加入不同长度的GSG linker，构建方法同融合质粒pETDuet‑Hydro‑SsDMS(R)的构建，区别在于不同长度的linker更换对应的SsNDH的Forward引物和SsDMS的Reverse引物，引物序列表如表1。

[0054] 实施例4

[0055] AlphaFold2预测水解酶和环化酶融合蛋白

[0056] 使用AlphaFold2在线网站(https：//colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFoldblob/main/AlphaFold2.ipynb#scrollTo＝6xbvRNrwnJqj)预测水解酶融合drimenol合酶，同时连接处有(GSG)3linker的蛋白结构进行预测，预测得到融合蛋白的pdb文件，用PyMol展示如图1C。

[0057] 实施例5

[0058] SWISS‑MODEL同源建模确定活性口袋

[0059] 为确定蛋白PhoN与配体相互作用的活性口袋，对PhoN进行同源建模，使用SWISS‑MODEL(https：//swissmodel.expasy，org/)网站，输入蛋白PhoN的fasta格式的序列文件，寻找模板，找到了序列相似度高达84.4％的同源蛋白1D2T，通过对1D2T的活性口袋残基和保守基序残基与PhoN进行比对分析，从而确定蛋白PhoN的保守残基和活性口袋。

[0060] 确定活性口袋。对AlphaFold2在线网站模拟PhoN结构，同时再利用SWISS‑MODEL同源建模找到PhoN同源蛋白1D2T，序列相似度79.9％。通过可视化软件PyMol比较两个蛋白发现模拟出来的PhoN蛋白和1D2T高度相似，RMSD值为 据文献报道1D2T蛋白的磷酸水解酶保守基序KX6RP‑PSGH‑SRX5HX3D分别为115K，122R，123P，147P，148S，149G，150H，182S，183R，189H，193D，对应到PhoN蛋白的保守基序分别为133K，140R，141P，165P，166S，167G，
168H，200S，201R，207H和211D。同时，1D2T的活性位点为115K，122R，148S，149G，150H，183R，
189H和193D，对映到PhoN的活性位点为133K，140R，166S，167G，168H，201R，207H和211D，为一步确定保守位点选择的准确性，分别将这8个位点突变成A，突变构建方法见实施例6，通过体内发酵比较产量变化，发现突变株活性几乎丧失，验证了这些位点为活性口袋，发酵结果见图2B。

[0061] 实施例6

[0062] 突变体构建方法

[0063] 在pRSFDuet‑PhoN质粒构建的基础上，设计突变体中间引物，上游引物正向引物统一为TCATCACCACAGCCAGGATATGAA GCGCCAGCTGTTTAC，上游反向引物和下游正向引物根据不同突变株不同，如表2，下游反向引物统一为GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTACTTTTTCTGATTAT TGGCAAATTC，先分别用上下游两对引物进行PCR，PCR产物片段作为模板再选用上游正向引物和下游反向引物进行一次PCR，获得全长的突变体PhoN片段，BamHI和HindIII(Takara公司)双酶切pRSFDuet‑1载体，并将合酶基因通过ClonExpress IIOne Step Cloning Kit同源重组到载体上，并转化到E.coli DH5α中，通过PCR鉴定挑选出阳性克隆，并通过测序鉴定(测序引物：DuetDOWN1：GATTATGCGGCCGTGTACAA)。

[0064] 表2.突变体引物表

[0065]

[0066]

[0067] 实施例7

[0068] 分子对接确定活性口袋残基

[0069] 使用AutodockTools‑1.5.7进行对接，选择带一个焦磷酸基团的催化产物DMAP与PhoN进行对接，对接盒子大小为46*46*46，格点间距为 盒子的中心为默认受体活性中心，坐标值为(x＝5.983，y＝3.649，Z＝‑0.559)。配体构象搜索过程使用GeneticAlgorithm遗传算法，算法对接的轮数(number of GA runs)设为100，对接结束后取结合能最低的配体构象作为最佳构象，通过分子对接确定活性口袋及与配体DMAP相互作用的残基，除去保守残基，剩下的口袋附近残基有122E，125G，158R和171R。

[0070] 对接结果的能量为‑5.95，图2A。其中与DMAP有氢键相互作用的残基有133K，140R，165P，166S，167G，168H和207H，如图2A，均为保守基序，不设计突变位点。除了保守基序外，与底物距离 的以内的位点还有122E，125G，158L，171I，如图2A，这四个残基位于底物异戊烯基疏水链周围，同时也是活性口袋外侧的残基，对底物进入活性空腔具有重要影响作用。

[0071] 实施例8

[0072] 设计将122，125，158和171位分别突变成带正电荷碱性残基，由于组氨酸侧链的咪唑环对空间位阻影响较大且碱性比精氨酸和赖氨酸稍弱，于是考虑将122，125，158和171位残基分别突变成精氨酸和赖氨酸，模拟突变后活性口袋电荷变化，方法见实施例8，模拟结果见图2C，其中野生型中的“#”代表活性口袋所在的位置，圆圈框选出来的位置为各突变位点所在的位置。根据模拟结果，E122R/K突变体不仅多出的精氨酸的侧链附近正电荷明显增加，还使得活性口袋周围正电荷显著增加，符合突变设计的预期，125G位突变成R/K后发现多出的侧链不仅对口袋正电荷增加效果较差，反而对口袋造成一定的阻挡，影响底物的进入，而158L和171I由于不处于蛋白的表面，因此突变成对口袋附近的表面正电荷增加影响较小。对于上述推测，通过体内发酵实验对这4个突变体的drimenol产量进行验证，发酵结果见图2D，其中E122R突变株的drimenol产量达到177.6mg/L，比野生型菌株110.8mg/L增加1.6倍，说明增加口袋正电荷对提高磷酸化反应确有增加效果，而125G突变成R和K后产量明显下降，仅为17.1mg/L和8.8mg/L，也符合模拟结果中G125R/K突变体对口袋造成阻碍的推测，而L158R/K和I171R/K突变体产量明显降低，考虑到两位点不位于蛋白表面，仅从电荷角度考虑无法解释其产量降低的现象，推测突变对底物与蛋白之间的相互作用力造成不利影响。

[0073] 突变体模拟电荷变化

[0074] 将蛋白PhoN的pdb文件在PyMOL中显示，使其产生真空静电荷(vacuum electrostatics)的蛋白接触电位(protein contact potential)，蛋白显示出表面电荷，红色代表负电荷、蓝色代表正电荷，颜色越红(蓝)代表负(正)电荷聚集越多。

[0075] 模拟不同突变体对活性口袋表面电荷的影响，先选择PyMOL工具栏的Wizard选项下的Mutagenesis‑protein选项，对122E，125G，158R和171R残基分别模拟突变成碱性残基精氨酸和酪氨酸，分析比较突变残基对活性口袋表面电荷的影响，并进行实验验证。

[0076] 实施例9

[0077] PhoN家族蛋白保守性分析

[0078] 使用ConSurf WEB SERVER进行保守性分析(https：//consurf.tau.ac.il/consurf_index.php)，选择氨基酸保守性分析，上传蛋白PhoN预测的pdb文件，同源蛋白比对选择PSI‑BLAST，迭代次数(Number of iterations)选1，E‑value值设置为0.0001，蛋白数据库选择SWISS‑PROT；选择500条需要分析的序列，多序列比对的方法选择MUSCLE，计算进化保守性的方法选择Bayesian，进化模型选择Best model，之后提交分析任务。

[0079] 分析结果根据保守度分成9个等级，如图2E，红色代表保守，绿色代表不保守，结合实施例7中的活性口袋附近在进化中高度保守，在活性口袋附近 距离内，存在90S、135Y、153K、157T、160R、222I，6个位置的不保守残基，作为目标突变位点。统计这些位点出现高频次的氨基酸残基，统计结果见图2F。进一步设计S90A、S90G、Y135K、Y135H、K153T、T157K、R160K、R160T、I222V、I222A十个突变体，将三质粒体系中的pRSFDuet‑PhoN质粒换成突变不同突变位点的PhoN进行共表达发酵，发酵结果如图2G，其中S90G、T157K和R160K三个突变株的drimenol产量分别为125.8、134.8和135.4mg/L，比野生型菌株110.8mg/L的产量有小幅度的提高，说明将磷酸酶PhoN朝着家族蛋白进化的保守残基方向突变有利于提高酶的催化效率，推测与漫长的蛋白家族进化过程中，酶总是朝着更稳定、更高效等有益的方向进化一致，利用该策略改造酶用于提高酶的催化效率、进而实现高产方案具有可行性。

[0080] 实施例10

[0081] 组合突变

[0082] 将上述依据保守性突变选择的优势突变株S90G、T157K和R160K三个突变位点先进行两两组合，构建方法同实施例6，结果如图3A所示，双突变株S90G/T157K、S90G/R160K、T157K/R160K产量分别为162.1、150.0和162.7mg/L，比野生型110.8分别提高了1.5、1.4和1.5倍，但是三个突变株组合的效果却非常低，仅为7.9mg/L。之后将依据活性口袋电荷分布筛选出的优势突变位点E122R和根据保守性改造筛选出的突变位点S90G、T157K和R160K分别进行三突变位点组合，结果如图3A所示，三种组合方式的三突变位点产量都比单独的三三
E122R突变以及保守组合突变明显提高，其中E122R/T157K/R160K 位点突变组合产量达到了398.4mg/L，比单位点的E122R突变株产量提高了2.2倍，比依据保守设计的T157K组合R160K双突变株产量提高了2.4倍，比野生型菌株产量提高了3.6倍，这说明了两种策略设计的突变位点在酶改造提高产量上起到了累加效果。其中E122R的位点的设计是使得酸性磷酸酶PhoN在“磷酸化‑水解”可逆反应中，提高磷酸化的催化效率从而提高产量，而T157K/R160K双突变的筛选是依据保守性分析筛选出来的突变株，推测是提高了磷酸酶PhoN的稳定性，于是使用Expasy对突变株等电点的变化进行预测，方法见实施例11，预测结果见表3，野生型PhoN等电点为6.08Mw，E122R突变株等电点明显提高，为6.88Mw，与增加活性口袋附近的正电荷相关，T157K/R160K双突变的等电点为6.42Mw，说明保守性突变将蛋白整体从酸性向中性变化，蛋白稳定性增加，而最佳三突变株的等电点为7.72Mw，使蛋白整体变成了碱性，说明增加碱性可以提高PhoN的磷酸化活性，与之前的推测增加正电荷可以提高与焦磷酸基团的相互作用增加磷酸化活性一致。

[0083] 实施例11

[0084] 等电点预测

[0085] 于是使用Expasy对突变株等电点的变化进行预测，输入不同突变体的氨基酸序列，预测结果见表3，野生型PhoN等电点为6.08Mw，E122R突变株等电点明显提高，为6.88Mw，与增加活性口袋附近的正电荷相关，T157K组合R160K等电点为6.42Mw，说明保守性突变将蛋白整体从酸性向中性变化，蛋白稳定性增加，而最佳三突变株的等电点为7.72Mw使蛋白整体变成了碱性，说明增加碱性可以提高PhoN的磷酸化活性，与之前的推测增加正电荷可以提高与焦磷酸基团的相互作用增加磷酸化活性一致。

[0086] 表3突变株等电点的变化与补身醇产量关系

[0087]

[0088]

[0089] 实施例12

[0090] 蛋白表达与纯化

[0091] 将含有PhoNE122R/T157K/R160K的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。菌株在1L LB中培养，37℃，230转/分振荡，直到OD600达到0.6。将培养物冷却至4℃，加入0.25mM IPTG诱导。细胞在18℃、200rpm的振荡条件下生长20小时。在4℃下以4000rpm离心15分钟收获细胞后，将细胞重悬于裂解缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，含500mM NaCl和10％甘油)中，超声裂解，然后在4℃下以15000rpm离心20分钟。含有可溶性PhoN的上清液通过配备HisTrap色谱柱的FPLC系统(GE HealthcareBiosciences)进行镍亲和层析纯化。使用PD‑10脱盐柱(GE Healthcare Biosciences)脱盐，并使用Amicon Ultra‑15浓缩器(Millipore)在50mM Tris，pH 7.5，含100mMNaCl和10％甘油的条件下浓缩，得到带有N端His6标记的蛋白质。进行蛋白质结晶(图3B)。

[0092] 实施例13

[0093] 蛋白质结晶和结构测定

[0094] PhoNE122R/T157K/R160K蛋白经过初筛和优化，在0.1M三水醋酸钠(pH＝4.0)、0.2M二水甲酸镁和18％PEG 4000溶液中观察到适合结构测定的矩形晶体，获得了2.7A分辨率的晶体结构。为了收集X射线数据，将晶体迅速浸入含有15％甘油的缓冲液中，取出后立即在液氮E122R/T157K/R160K中速冻。PhoN 的X‑ray衍射数据在上海同步辐射中心(上海光源)的BL02U1光束线上采集。衍射数据使用iMosflm进行处理，相位则在PHASER5中通过分子置换进行。分子置换实验以AlphaFold2模拟的PhoN蛋白结构为起始模型。ARP/wARP中的warpNtrace例程用于初始模型的自动构建。随后在COOT中进行手动建模。模型细化(包括TLS)在PHENIX6中进行。
E122R/T157K/R160K
最终解析出的蛋白质结构为三聚体，单体结构见图3C。比较PhoN 与野生型PhoNE122R/T157K/R160K
的结构差异，三个突变残基在位置上有微小的差别，见图3D；PhoN 与野生型
E122R
PhoN分别与配体DMAP进行100ns的分子动力学模拟，蓝色线与黑色线分别代表PhoN/T157K/R160K
与野生型PhoN模拟结果，结果见图3E，突变体延长了酶与配体稳定相互作用的时间。

[0095] 表4 PhoNE122R/T157K/R160K晶体结构收集与优化

[0096]

[0097]

[0098] 实施例14

[0099] albicanol发酵条件优化

[0100] 为了进一步提高大肠杆菌发酵albicanol的产量，探究了最适五碳醇添加浓度和添加方式，IPTG添加量，甘油添加量以及发酵时间，图4，经过实验验证，添加30mM ISO，2％甘油，0.05mM IPTG以及发酵4天获得最佳产量，为1804.9mg/L。

[0101] 实施例15

[0102] 发酵罐生产albicanol

[0103] 鉴于albicanol在摇瓶生产中已经获得了克级产量，为了优化albicanol的生产，我们扩大进行发酵罐生产，以获得更多的albicanol。在早期发酵阶段，通过控制搅拌和通气将溶解氧水平保持在30％。通过自动添加NH3‑H2O，pH值保持在7.0。当初始D‑葡萄糖耗尽时，通过添加补料培养基补充D‑葡萄糖，使D一葡萄糖浓度保持在0.1克/升‑1克/升之间。由于异戊烯基醇的毒性，我们采用了分阶段投料的方法，以尽量减少对菌株生长的不利影响。第一阶段，当OD600达到30时，发酵罐温度降至18℃，加入IPTG进行诱导。同时加入8克DMAA和
0.1mM IPTG。在第二阶段，albicanol产量在34小时时达到1.6g/L。此时，再加入8克DMAA，以确保前体供应充足。最终，albicanol的最高产量53小时达到3.5g/L，图5。这意味着激酶PhoN的工程化获得了通用化。