[0001] 本发明涉及一种细胞色素P450酶突变体及其在催化甘草次酸中的应用，属于突变体领域。

[0002] 甘草次酸是一种常见的五环三萜类天然产物，目前对其C3‑OH、C30‑COOH及不饱和烯酮位点的化学修饰，已成功获得多种具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等广泛药理活性的甘草次酸衍生物。然而，由于甘草次酸结构中大量存在惰性C‑H键，传统有机合成方法难以实现惰性C‑H键的高效选择性活化，化学空间有待进一步开发。

[0003] 细胞色素P450酶在温和条件下能够高效选择性氧化多种复杂的天然产物，展示出绿色环保和高效催化的显著优势，尤其在惰性C‑H键的选择性活化方面具有独特的应用潜力。细胞色素P450酶的催化依赖于高活性中间体I的生成，该中间体通过血红素中心和酶活性空腔的协同作用，实现底物惰性C‑H键的选择性活化。从放线菌Amycolatopsis pretoriensis中分离到的细胞色素P450酶ApPT可以用于甘草次酸惰性C‑H键选择性活化，然而，在此反应过程中，除了生成7β‑羟基甘草次酸产物外，还会同时生成7β，15α‑二羟基甘草次酸产物，具有较差的区域选择性，增加了分离纯化的难度。

[0004] 鉴于此，对ApPT活性空腔进行改造，用于甘草次酸区域选择性羟基化生成7β‑羟基甘草次酸，提高催化选择性，有利于简化工艺过程中的分离操作，易于工程化实施，为甘草次酸的结构修饰提供更加有效的工具。

[0027] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

[0028] 实施例1模板pET28a‑ApPT‑RHFRed的合成和重组表达

[0029] 将细胞色素P450酶基因CYP161H12(氨基酸序列UniProt号为A0A1H5RFX8，下称：ApPT)作为亲本模板进行模板pET28a‑ApPT‑RHFRed的合成和重组表达；亲本模板ApPT的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ApPT插入到限制性核酸内切酶酶切位点分别为NdeI和BamHI的pET28a‑RHFRed质粒上，由通用生物(安徽)股份有限公司合成直接获得重组载体pET28a‑ApPT‑RHFRed。其中，pET28a‑RHFRed的合成过程如下：RHFRed根据2020年文献报道的氨基酸序列，将RHFRed插入到限制性核酸内切酶酶切位点分别为BamHI和XhoI的pET28a上，由通用生物(安徽)股份有限公司进行合成，获得载体pET28a‑RHFRed。RHFRed氨基酸序列为SEQ ID NO.3，基因序列为SEQ ID NO.4。利用热激法将pET28a‑ApPT‑RHFRed重组质粒转化到E.coli BL21感受态细胞，在LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)上筛选阳性转化子；挑取单克隆到5mL的灭菌LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)，在37℃，220rpm下培养10h，得到pET28a‑ApPT‑RHFRed重组菌液。

[0030] 往50mL灭菌的TB培养基中以0.4％接种量加入上述重组菌液，同时往其中加入终浓度50μg/mL卡那霉素和终浓度1mL/L微量金属盐溶液(成分包括50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnSO4，10mM ZnSO4，2mM CoSO4，2mM CuCl2，2mM NiCl2，2mM Na2MoO4，2mM H3BO3)。在37℃，220rpm下培养至OD600值为0.6‑0.8。在冰水浴中冷却20min后往其中加入终浓度0.1mM异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)溶液和终浓度0.5mM 5‑氨基乙酰丙酸盐酸盐(5‑ALA)溶液诱导菌体表达pET28a‑ApPT‑RHFRed融合蛋白，在18℃，200rpm下诱导培养20h。3750rpm离心
15min收集菌体。

[0031] 实施例2细胞色素P450酶突变体的构建

[0032] 依据ApPT与底物甘草次酸的分子对接结构，对ApPT的邻近催化残基的T291、T288、S289、G290这4个残基进行突变，构建突变体。以pET28a‑ApPT‑RHFRed质粒为模板，发生以下氨基酸突变中的任意一种：T291I、T291V、T291S、T291F、T291I、T291L、T291C、T288A、T288V、T291I‑T288A、T291I‑T288G、T291I‑T288A‑G290E、T291I‑T288G‑S289Q、T291I‑T288A‑S289Q‑G290E、T291I‑T288G‑S289Q‑G290E。当有多个突变位点时，需分次进行，每次仅对一个位点进行突变。

[0033] 每次突变包括以下步骤：以pET28a‑ApPT‑RHFRed质粒为模板，设计突变引物，需要突变的碱基放在引物中间；第一次PCR扩增体系：2×Phanta Max Buffer 25μL，10mM dNTPs 1μL，50μM上下游引物各5μL，100ng/μLDNA模板1μL，高保真聚合酶(Phanta Max Super‑Fidelity DNA Polymerase)1μL，DMSO 2.5μL，ddH2O补足至50μL；第一次PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，72℃退火15s，72℃延伸1min，反应30个循环，最后72℃延伸
10min。其中，突变位点前半段基因克隆上游引物为ApPT‑F，下游引物为对应位点‑R；突变位点后半段基因克隆上游引物为对应位点‑F，下游引物为ApPT‑R。对第一次PCR克隆得到的基因进行第二次PCR，第二次PCR扩增体系：2×Phanta Max Buffer 25μL，10mM dNTPs 1μL，50μM上下游引物各5μL，DNA模板为突变位点前半段基因和突变位点后半段基因各20ng，高保真聚合酶(Phanta Max Super‑Fidelity DNA Polymerase)1μL，DMSO 2.5μL，ddH2O补足至
50μL；第二次PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，63℃退火15s，72℃延伸1min，反应30个循环，最后72℃延伸10min。其中，第二次PCR上游引物为ApPT‑F，下游引物为ApPT‑R。

[0034] 其中，本实施例采用的上下游突变引物的序列如下表1所示：

[0035] 表1上下游突变引物的序列

[0036]

[0037]

[0038] 将质粒pET28a‑RHFRed用NdeI和BamHI进行酶切，酶切体系：100ng/μL质粒pET28a‑RHFRed 1μg，10×QuickCut Buffer2μL，NdeI 1μL，BamHI 1μL，ddH2O补足至20μL，反应条件为37℃1.5h。将酶切线性化的载体和PCR扩增得到的基因利用C112同源重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)完成同源重组，转化到E.coli DH5α感受态细胞，在LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)上筛选阳性转化子；挑取单克隆菌落至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基进行培养，然后进行测序。利用SnapGene软件将测序结果与野生型ApPT的基因序列进行比对，并对测序正确的菌株提取质粒，得到细胞色素P450酶突变体重组质粒。利用热激法将细胞色素P450酶突变体重组质粒转化到E.coli BL21感受态细胞，在LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)上筛选阳性转化子；挑取单克隆到5mL的灭菌LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)，在37℃，220rpm下培养10h，得到细胞色素P450酶突变体重组菌液。其中，细胞色素P450酶突变体在大肠杆菌中表达与上述模板的表达方法一致。

[0039] 实施例3亚磷酸脱氢酶pRSFDuet‑opt13构建和重组表达

[0040] 将opt13基因(公开该基因的文章：Further Improvement of Phosphite Dehydrogenase Thermostability by Saturation Mutagenesis，DOI 10.1002/bit.21546)作为模板进行质粒pRSFDuet‑opt13的合成和重组表达，opt13基因由通用生物(安徽)股份有限公司直接合成，而后设计引物，PCR扩增该基因。PCR扩增体系：2×Phanta Max Buffer 25μL，10mM dNTPs 1μL，50μM上下游引物各5μL，100ng/μLDNA模板1μL，高保真聚合酶(Phanta Max Super‑Fidelity DNA Polymerase)1μL，DMSO 2.5μL，ddH2O补足至50μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，72℃退火15s，72℃延伸1min，反应30个循环，最后72℃延伸10min。

[0041] 其中，上下游引物的序列如下表2所示：

[0042] 表2opt13上下游引物的序列

[0043]

[0044] 将购买于通用生物(安徽)股份有限公司的质粒pRSFDuet，用PstI和HindIII进行酶切，酶切体系：100ng/μL质粒pRSFDuet 1μg，10×QuickCut Buffer2μL，PstI 1μL，HindIII 1μL，ddH2O补足至20μL，反应条件为37℃1.5h。将酶切线性化的pRSFDuet载体和PCR扩增得到的基因利用C112同源重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)完成同源重组，转化到E.coli DH5α感受态细胞，在LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)上筛选阳性转化子；挑取单克隆菌落至5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基进行培养，然后进行测序。对测序正确的菌株提取质粒，利用热激法将细胞色素P450酶突变体重组质粒转化到E.coli BL21感受态细胞，在LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)上筛选阳性转化子；挑取单克隆到5mL的灭菌LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)，在37℃，220rpm下培养10h，得到pRSFDuet‑opt13重组菌液。

[0045] 往50ml灭菌的TB培养基中以0.4％接种量加入上述重组菌液，同时往其中加入终浓度50μg/mL卡那霉素。在37℃，220rpm下培养至OD600值为0.6‑0.8。在冰水浴中冷却20min后往其中加入终浓度0.1mM异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)诱导菌体表达蛋白opt13，在18℃，200rpm下诱导培养20h。3750rpm离心15min收集菌体。

[0046] 实施例4细胞色素P450酶突变体的活性和/或选择性筛选

[0047] 本实施例以甘草次酸为底物，测定细胞色素P450酶突变体相较于亲本模板P450的催化活性和选择性；

[0048] 亲本模板P450、细胞色素P450酶突变体和opt13菌体分别于0.1M,pH＝7.0kpi缓冲液中重悬至OD600＝30后超声破碎，分别得到亲本模板P450，细胞色素P450酶突变体和opt13的细胞裂解液，其中细胞色素P450酶为反应催化剂。

[0049] 将1.33mL的亲本模板P450、1.33mL细胞色素P450酶突变体的细胞裂解液分别和0.66mL的opt13细胞裂解液混合加入48深孔板，往其中加入预先溶于5％(v/v)DMSO的底物甘草次酸(4mM,1.0equiv.)，NaNADP(0.5equiv.)and Na2HPO3·5H2O(50equiv.)。在23℃，
220rpm下反应20h后，加入2mL乙酸乙酯充分萃取反应液，13000rpm高速离心10min，取1mL有机相至1.5mL EP管中，氮气吹干，加入1mL色谱甲醇用微孔滤膜(0.22μm)过滤，滤液装入干净液相分析样品瓶中，采用HPLC进行含量检测，检测条件：20％乙腈‑100％乙腈梯度洗脱
5min，100％乙腈5min，流速为0.8ml/min，检测波长为254nm。得到的有效突变体为T291A、T291V、T291S、T291F、T291I、T291L、T291C、T288A、T288V、T291I‑T288A、T291I‑T288G、T291I‑T288G‑S289Q、T291I‑T288A‑G290E、T291I‑T288G‑S289Q‑G290E和T291I‑T288A‑S289Q‑G290E。其中，亲本或部分变体催化甘草次酸生成的产物7β‑羟基甘草次酸和7β，15α‑二羟基甘草次酸的HPLC图见图1。突变体的活性和选择性测试结果如下表3所示：

[0050] 表3突变体的活性和选择性测试结果

[0051]

[0052]

[0053] 注：表3的测试结果是在同样反应条件下进行三次平行反应后得出。其中，选择性的定义为：7β‑羟基甘草次酸/(7β‑羟基甘草次酸+7β，15α‑二羟基甘草次酸)×100％；细胞色素P450酶突变体催化甘草次酸1生成7β‑羟基甘草次酸1a的反应路线图可参照：

[0054]

[0055] 其中，突变体T291A：将亲本(ApPT)第291位氨基酸由T突变为A；突变体T291V：将亲本(ApPT)第291位氨基酸由T突变为V；突变体T291S：将亲本(ApPT)第291位氨基酸由T突变为S；突变体T291F：将亲本(ApPT)第291位氨基酸由T突变为F；突变体T291I：将亲本(ApPT)第291位氨基酸由T突变为I；突变体T291L：将亲本(ApPT)第291位氨基酸由T突变为L；突变体T291C：将亲本(ApPT)第291位氨基酸由T突变为C；突变体T288A：将亲本(ApPT)第288位氨基酸由T突变为A；突变体T288V：将亲本(ApPT)第288位氨基酸由T突变为V；突变体T291I‑T288A：将突变体T291I第288位氨基酸由T突变为A；突变体T291I‑T288G：将突变体T291I第288位氨基酸由T突变为G；突变体T291I‑T288G‑S289Q：将突变体T291I‑T288G第289位氨基酸由S突变为Q；突变体T291I‑T288A‑G290E：将突变体T291I‑T288A第290位氨基酸由G突变为E；突变体T291I‑T288G‑S289Q‑G290E：将突变体T291I‑T288G‑S289Q第290位氨基酸由G突变为E；突变体T291I‑T288A‑S289Q‑G290E：将突变体T291I‑T288A‑G290E第289位氨基酸由S突变为Q。

[0056] 根据表3的测试结果，本实施例在模板(P450)的基础上对关键活性位点进行突变改造，得到对催化甘草次酸7β羟基化反应的活性和/或选择性明显提高的突变体。

[0057] 本实施例提供的突变体可以单独提高甘草次酸生成7β‑羟基甘草次酸的选择性，可以单独提高甘草次酸生成7β‑羟基甘草次酸的活性，亦或是同时提高甘草次酸生成7β‑羟基甘草次酸的选择性和产率。由此，克服了现有技术中细胞色素P450酶(如模板ApPT)存在选择性较差的问题。

[0058] 进一步结合表3和图1可知，组合突变T291I+T288G+S289Q+G290E不仅表现出更优的催化活性，并且选择性也显著提升，产率从74.56％提高到85.12％，选择性从67.72％提高到>99％。

[0059] 实施例5大规模制备酶催化氧化产物

[0060] 基于实施例4的测试结果，本实施例以突变体T291I+T288G+S289Q+G290E为示例性突变体(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，大规模制备酶催化氧化产物7β‑羟基甘草次酸。

[0061] 将从实施例4中得到的突变体T291I+T288G+S289Q+G290E在2L TB培养基进行发酵诱导表达，opt13为1L TB培养基发酵诱导表达，分别获得突变体T291I+T288G+S289Q+G290E和opt13发酵菌体，表达方法与实施例1一致。菌体分别于0.1M,pH＝7.0kpi缓冲液中重悬后超声破碎，分别得到突变体

[0062] T291I+T288G+S289Q+G290E和opt13的细胞裂解液。将突变体

[0063] T291I+T288G+S289Q+G290E细胞色素P450酶突变体细胞裂解液和opt13细胞裂解液混合，往其中加入预先溶于5％(v/v)DMSO的底物甘草次酸(1g,1.0equiv.)，NaNADP(0.5equiv.)and Na2HPO3·5H2O(50equiv.)。在23℃，220rpm下反应20h后，将反应液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，最后合并有机溶剂，用旋转蒸发仪旋干有机溶剂后，得到氧化产物7β‑羟基甘草次酸，产率为88.93％。