[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及结构中含有多个迈克尔反应受体模块的新颖五环三萜衍生物及其化学酶合成方法和应用。

[0002] 近年来，共价抑制剂在药物开发中越来越受到关注。共价抑制剂在体内与生物靶点结合之后，由结构中的亲电弹头与靶蛋白的亲核残基结合发挥定位作用进而产生治疗作用，在常用的以半胱氨酸为靶标的共价抑制剂中，最常用的亲电弹头是迈克尔受体。迈克尔反应受体是一种烯烃或者炔烃与吸电子基团共轭相连形成的官能团，含有这种官能团的化学分子被称为迈克尔反应受体分子，容易和亲核试剂发生迈克尔反应。这类分子在生理过程中对含有半胱氨酸的蛋白具有抑制作用，因此被认为是一种重要的生理活性分子，参与体内许多生命过程，同时对体内多种信号通路起着调节作用。

[0003] 甲基巴多索隆(以下简称为CDDO‑Me)及其衍生物就是著名的共价抑制剂五环三萜分子，此类分子具有强大的抗肿瘤作用和抗炎作用，能够作用于体内多种信号通路。构效关系研究表明，其分子结构中存在的两个迈克尔受体：A环的α‑氰基烯酮和C环的烯酮是其发挥活性的重要药效官能团。因此，目前模仿CDDO‑Me系列化合物的药效官能团进行结构修饰并探究衍生物的潜在药理活性是五环三萜类化合物的研究热点。

[0004] 五环三萜分子之间的结构骨架相似度高，由五个环己烷和/或者环戊烷相互稠和而成。其中C3位的羟基，结构骨架上的烯烃和羧基是结构修饰中常用的化学手柄。尽管为五环三萜的骨架分子安装更多的迈克尔反应受体对于提高其药理活性具有重要意义，但是，由于其骨架上大量存在的惰性C‑H键缺乏有效的有机合成方法进行位点和区域选择性地C‑H键活化，限制了结构中含有多迈克尔反应受体模块五环三萜分子(多迈克尔反应受体五环三萜分子)在天然产物药物化学中的研究。以甘草次酸为例，其结构中B环和D环上的惰性C‑H键化学环境相似，缺乏有机合手段实现选择性的C‑H活化。所以目前的结构修饰大多局限于A环的C3位羟基，C环的11氧代‑12烯迈克尔反应受体和C30位羧基，其B环和D环上的结构修饰和构效关系研究仍有待开发。
发明内容：

[0005] 发明目的：基于前期发现的细胞色素氧化酶CYP161H12可以选择性地在甘草次酸C7β和C15α位引入的羟基官能团的功能，本发明所要解决的技术问题是提供了一种制备合成得到的新颖的多迈克尔反应受体五环三萜分子。

[0006] 本发明还要解决的技术问题是提供了用化学酶法对甘草次酸的B环和D环进行结构修饰合成五环三萜衍生物或其可药用的盐的方法。

[0007] 本发明最后要解决的技术问题是提供了多迈克尔反应受体五环三萜分子在制备治疗/预防肿瘤药物中的应用。

[0008] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种通式I所示的五环三萜衍生物或其可药用的盐：

[0009]

[0010] 其中：A为C或CH；B为C或CH；C为C或CH；D为C或CH；E为C或CH；F为C或CH；R1为H，I或CN；R2为O，OH或乙酰氧基；R3为O，H或OH；R4为O，H或OH。

[0011] 作为优选，其结构式如下所示：

[0012]

[0013] 其中，A为C或CH；B为C或CH；R1为H，I或CN；R2为OH或乙酰氧基。

[0014] 其中，所述衍生物或其可药用的盐包括立体异构体、水合物、代谢产物、氘代物、溶剂化物或药学上可接受的盐或共晶。

[0015] 其中，本发明特别优选具有如下结构的化合物：

[0016] 分子中含有两个迈克尔反应受体的化合物结构为：

[0017] 3，7，11，15‑四氧代‑18β‑齐墩果烷‑1，12‑二烯‑30‑羧酸甲酯(实施例5)[0018] 2‑碘代‑3，7，11，15‑四氧代‑18β‑齐墩果烷‑1，12‑二烯‑30‑羧酸甲酯(实施例6)[0019] 2‑氰基‑3，7，11，15‑四氧代‑18β‑齐墩果烷‑1，12‑二烯‑30‑羧酸甲酯(实施例7)[0020] 7，11‑二氧代‑3β‑乙酰氧基‑18β‑齐墩果烷‑5，12‑二烯‑30‑羧酸甲酯(实施例11)[0021] 7，11‑二氧代‑3β‑乙酰氧基‑齐墩果烷‑5，12，18‑三烯‑30‑羧酸甲酯(实施例12)[0022] 7，11‑二氧代‑3β‑羟基‑齐墩果烷‑5，12，18‑三烯‑30‑羧酸甲酯(实施例13)[0023] 分子中含有三个迈克尔反应受体的化合物结构为：

[0024] 3，7，11‑三氧代‑齐墩果烷‑1，5，12，18‑四烯‑30‑羧酸甲酯(实施例14)[0025] 2‑碘代‑3，7，11‑三氧代‑齐墩果烷‑1，5，12，18‑四烯‑30‑羧酸甲酯(实施例15)[0026] 2‑氰基‑3，7，11‑三氧代‑齐墩果烷‑1，5，12，18‑四烯‑30‑羧酸甲酯(实施例16)[0027] 本发明内容还包括所述的化学‑酶法制备五环三萜衍生物的方法，所述制备方法如下：

[0028]

[0029] 其中：A为C或CH；B为C或CH；C为C或CH；D为C或CH；E为C或CH；F为C或CH；R1为H，I或CN；R2为O，OH或乙酰氧基；R3为O，H或OH；R4为O，H或OH。

[0030] 本发明提供了利用化学‑酶法合成式I化合物的方法，有以下三条合成路线。

[0031] 其中，合成路线一：

[0032]

[0033] 具体步骤为：

[0034] 步骤a：将底物1，氧化酶，辅因子，辅酶再生体系混合进行酶促反应；

[0035] 步骤b：将底物2，碳酸钾，碘甲烷和溶剂混合反应，得到甲酯产物；

[0036] 步骤c：将底物3，2‑碘酰基苯甲酸和溶剂混合反应，得到氧化产物；

[0037] 步骤d：将底物4，碘单质，4‑二甲氨基吡啶和溶剂混合反应，得到碘取代产物；

[0038] 步骤e：将底物5，碘化钾，氰化亚铜和溶剂混合，在保护气氛下反应，得到氰基取代产物。

[0039] 合成路线二：

[0040]

[0041] 具体包括如下步骤：所述步骤包括所述的步骤a和步骤b，还包括以下步骤：

[0042] 步骤f：将底物9，琼斯试剂和溶剂混合反应，得到氧化产物；

[0043] 步骤g：将底物10，溴单质，溴化氢和溶剂混合反应的得到混合中间体；

[0044] 步骤h：将步骤g的混合物中间体与可立丁混合发生消除反应得到产物。

[0045] 合成路线三：

[0046]

[0047] 所述步骤包括所述的步骤a、步骤b和步骤f、所述的步骤c、步骤d和步骤e，还包括以下步骤：

[0048] 步骤i：将底物11，三溴化吡啶鎓和溶剂混合反应得到氧化产物。

[0049] 步骤j：将底物12，氢氧化钾和溶剂混合反应得到脱乙酰基和部分脱甲酯产物混合物。

[0050] 其中，作为优选地，步骤a所述的底物1包括化合物1或化合物7；所述氧化酶为CYP161H12‑RHFRed；所述辅因子为NADP+和Na2HPO3；所述辅酶再生体系为亚磷酸脱氢酶。

[0051] 作为优选地，步骤a所述的氧化酶‑CYP161H12‑RHFRed以细胞裂解液的形式参与反应，用量为1～4L TB培养基发酵所得菌体，具体制备方法见实施例1，所述的辅酶再生体系‑亚磷酸脱氢酶以细胞裂解液的形式用量为0.5～2L TB培养基发酵所得菌体，具体制备方法见实施例2，所述的底物1、NADP钠盐和Na2HPO3的摩尔质量比为1：0.5：50；所述的酶促反应温度为20℃；所述的酶促反应时间为20h。

[0052] 其中，步骤b所述的底物2包括化学物2或化合物8或步骤j中脱乙酰基和部分脱甲酯产物混合物，所述的底物2、碳酸钾和碘甲烷的摩尔比为1：3～4：1.3～2，所述的溶剂为4～10mL N,N‑二甲基甲酰胺，所述的反应温度为18～35℃，所述的反应时间为2～3h；

[0053] 作为优选地，步骤c所述的底物3包括化合物3或化合物10或化合物13，所述的底物3和2‑碘酰基的摩尔比为1：4～8，所述的溶剂为2～15mL二甲基亚砜，所述的反应温度为100～110℃，所述的反应时间为10h～15h；

[0054] 作为优选地，步骤d所述的底物4包括化合物4或化合物14，所述的底物、碘单质和4‑二甲氨基吡啶的摩尔比为1：3：0.1～0.2，所述的溶剂为吡啶和四氯化碳体积比为1：1的混合溶剂，所述的反应温度为90～100℃，所述的反应时间为12～15h；

[0055] 作为优选地，步骤e所述的底物5包括化合物5和化合物15，所述的底物、碘化钾和氰化亚铜的摩尔比为1：0.2：1.5～2，所述的保护气氛氮气或氩气，所述的反应温度为120℃，所述的反应时间为3.5h；

[0056] 作为优选地，步骤f的底物9和琼斯试剂的摩尔体积比为0.33mmol：0.4～0.5mL，所述的溶剂为4～5mL，所述的反应温度为0℃～35℃，所述的反应时间为1～2h；

[0057] 作为优选地，步骤g所述的底物10为化合物10，所述的底物10、溴单质和溴化氢的摩尔比为1：10：1.8～2，所述的溶剂为3～4mL N,N‑二甲基甲酰胺，所述的反应温度为18～35℃，

[0058] 作为优选地，步骤i所述的底物11为化合物10，所述的底物11和三溴化吡啶鎓的摩尔比为1：2～3，所述的溶剂为2～3mL乙腈，所述的反应温度为37～40℃，所述的反应时间为36～48h；

[0059] 作为优选地，步骤j所述的底物12为化合物12，所述的底物12和氢氧化钾的摩尔比为1：85～100，所属的溶剂为8～10mL甲醇，所述的反应温度为18～35℃，所述的反应时间为2～3h。

[0060] 本发明内容还包括所述的五环三萜衍生物或其可药用的盐在制备治疗/预防肿瘤药物中的应用。

[0061] 对于特别优选的式I所示的多迈克尔反应受体五环三萜分子，本发明进行体外活性筛选，发现多迈克尔反应受体五环三萜分子表现出明显的抗肿瘤活性，其中A环含有碘代烯酮结构，B环和C环具有不饱和烯酮的含有三个迈克尔反应受体的五环三萜分子(实施例
14)和A环具有含氰基烯酮结构，C环具有不饱和烯酮的含有两个迈克尔反应受体的五环三萜分子(实施例5)具有较好的抗肿瘤活性。另外A环具有氰基烯酮结构，B环和C环具有不饱和烯酮的含有三个迈克尔反应受体的五环三萜分子(实施例15)的抗肿瘤活性最为显著，具有作为药物先导化合物的潜力。

[0062] 有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明借助细胞色素CYP161H12对甘草次酸的选择性C‑H键羟基化作用，合成了利用传统化学合成无法获得的B环C7β和/或者D环C15α羟基化的甘草次酸衍生物后，首次利用羟基对甘草次酸的B环和/或者D环进行进一步结构衍生化；本发明以合成亲电弹头作为甘草次酸衍生化的依据，合成了新颖的多迈克尔反应受体五环三萜分子；通过对本发明中的新颖化合物进行细胞毒筛选，发现了对人前列腺癌细胞PC‑3,人乳腺癌细胞MCF‑7，人结肠癌细胞SW480，人宫颈癌细胞Hela均具有良好抑制作用的药物先导化合物。

[0087] 实施例1CYP161H12‑RHFRed的细胞裂解液制备

[0088] 制备CYP161H12‑RHFRed细胞裂解液，将从安徽通用生物股份有限公司合成的重组表达载体pET28a‑CYP161H12‑RHFRed(将pET28a与CYP161H12‑RHFRed核苷酸序列相连即可，其中CYP161H12‑RHFRed的氨基酸序列和核苷酸序列如SEC ID NO 1和SEQ ID NO 2所示)转化到大肠杆菌BL21中，异源表达的BL21接种至5mL LB培养基中，在37℃，220rpm下培养10h，此为种子液。往灭菌的TB培养基中以0.3％(v/v)接种量加入种子液，同时往其中加入0.1％(v/v)50mg/mL卡那霉素和0.1％(v/v)微量金属盐溶液(成分包括50mM FeCl3、20mM CaCl2、10mM MnSO4、10mM ZnSO4、2mM CoSO4、2mM CuCl2、2mM NiCl2、2mM Na2MoO4、2mM H3BO3)。在37℃，220rpm下培养至OD值为0.8。在冰水浴中冷却20min后往其中加入0.01％(v/v)1M异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)和0.1％(v/v)0.5M 5‑氨基乙酰丙酸盐酸盐(5‑ALA)诱导菌体表达CYP161H12‑RHFRed融合蛋白，在18℃，200rpm下诱导培养20h。3750rpm离心15min收集菌体，用磷酸缓冲液重悬至OD600＝30，60％功率超声破碎5min(1s on/5s off)。

[0089] 其中TB培养基的配方为：11.8g胰蛋白胨，23.6g酵母提取物，4mL甘油中溶于入0.95L蒸馏水，121℃高压灭菌20分钟后冷却至60℃，往其中加入0.05L灭菌磷源得到1LTB培养基；其中，灭菌磷源包括：2.2g KH2PO4和12.3gK2HPO4·3H2O溶于0.05L蒸馏水，121℃高压灭菌20分钟即得；

[0090] 其中磷酸缓冲液的配方为：14.25gK2HPO4·3H2O和5.1gKH2PO4溶于1L蒸馏水得到pH＝7，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液。

[0091] 实施例2亚磷酸脱氢酶的细胞裂解液制备

[0092] 制备亚磷酸脱氢酶细胞裂解液，将从安徽通用生物将从安徽通用生物股份有限公司合成的重组表达载体pETDuet‑opt13(pETDuet和opt13基因相连即得，opt13的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示)转化到大肠杆菌BL21中，异源表达的BL21接种至5mLLB培养基中，在37℃，220rpm下培养10h，此为种子液。往灭菌的TB培养基中以0.3％(v/v)的接种量加入种子液，同时往其中加入0.1％(v/v)100mg/mL氨苄青霉素。在37℃，220rpm下培养至OD600值为0.8。在冰水浴中冷却20min后往其中加入0.01％(v/v)
1M异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)诱导菌体表达opt13蛋白，在18℃，200rpm下诱导培养
20h。3750rpm离心15min收集菌体，用磷酸缓冲液重悬至OD600＝30，60％功率超声破碎5min(1s on/5s off)。

[0093] 实施例3酶催化制备单一氧化产物：11‑氧代‑3β，7β，15α‑三羟基‑18β‑齐墩果烷‑12‑烯‑30‑羧酸

[0094]

[0095] 本实施例需要经过两次连续的酶促才可得到单一的氧化产物11‑氧代‑3β，7β，15α‑三羟基‑18β‑齐墩果烷‑12‑烯‑30‑羧酸。

[0096] 第一次酶催化反应将1.00g(2.13mmol)的甘草次酸溶于5％(v/v)DMSO，加入0.80g(0.5equiv.)NADP钠盐和22.87g(50equiv.)Na2HPO3·3H2O于0.1M pH＝7的磷酸缓冲液中。在此无细胞催化体系中催化剂为实施例1制备方法得到的CYP161H12‑RHFRed的2L TB培养基所获得的菌体，用磷酸缓冲液重悬至OD600＝30，实施例2得到的亚磷酸脱氢酶opt13为1L TB培养基所获得的菌体用磷酸缓冲液重悬至OD600＝30，其中催化剂的用量是0.18mol％。
在23℃，转速为220rpm下反应20h，用乙酸乙酯萃取酶反应液，除去有机溶剂后，用200‑300目硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50：1)洗脱得到0.48g中间体和0.50g的化合物2。

[0097] 第二次酶催化反应将0.48g(1mmol)中间体作为原料，溶于5％v/v DMSO中，实施例1方法制备得到的催化剂CYP161H12‑RHFRed为1LTB培养基所获得的菌体，实施例2的方法制备得到的亚磷酸脱氢酶opt13为0.5LTB培养基所获得的菌体。其余反应条件均与第一次酶催化条件一致。用乙酸乙酯萃取酶反应液，除去有机溶剂后，用200‑300目硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50：1)洗脱得到0.42g化合物1b，经过两次酶催化，最终获得0.92g化合物2(白色粉末，产率：85％)。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0098] 1H NMR(300MHz,Pyridine‑d5)δH 6.18(s,1H,H‑12),4.68(m,1H,H‑15),4.51(m,13
1H,H‑7),3.51(m,1H,H‑3),1.74,1.46,1.42,1.35,1.28,1.09,0.89(s,3H×7)；C NMR
(75MHz,Pyridine‑d5)δC 198.8,179.0,170.2,129.1,77.5,71.4,66.4,62.4,51.9,51.7,
50.3,49.7,43.9,41.3,39.4,39.4,37.9,37.7,35.9,32.2,31.3,29.2,28.6,28.5,28.0,
+
27.8,18.7,16.5,16.4,13.2；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C30H47O6 503.3373,found 
503.3408。

[0099] 实施例4合成11‑氧代‑3β，7β，15α‑三羟基‑18β‑齐墩果烷‑12‑烯‑30‑羧酸甲酯[0100]

[0101] 将0.37g化合物2(0.74mmol)溶于10mL DMF，往其中加入0.41g(4equiv.)碳酸钾在室温下搅拌30min，往反应液中加入93μL(2equiv.)碘甲烷，在室温下反应2.5h后旋蒸，加入水待析出大量白色固体，抽滤，收集滤饼烘干，得到0.36g化合物3(白色粉末，产率94％)。

[0102] 1H NMR(400MHz,pyridine‑d5)δH 6.06(s,1H,H‑12),4.64(dd,J＝11.5,5.0Hz,1H,H‑15),4.49(dd,J＝10.8,4.5Hz,1H,H‑7),3.66(s,3H,OCH3),3.51(dd,J＝11.6,4.5Hz,1H,13
H‑3),1.67,1.44,1.41,1.27,1.15,1.08,0.86(s,3H,CH3)；C NMR(101MHz,pyridine‑d5)δC 198.7,176.6,169.6,129.1,77.5,71.4,66.3,62.4,51.8,51.6,51.5,50.3,49.7,43.9,
40.9,39.3,39.3,37.6,37.6,35.8,32.1,31.2,29.1,28.5,28.0,27.9,27.8,18.6,16.5,
‑
16.4,13.2.HRESIMS(m/z)[M‑H]calculated C31H47O6 515.3373,found 515.3387。

[0103] 实施例5合成3，7，11，15‑四氧代‑18β‑齐墩果烷‑1，12‑二烯‑30‑羧酸甲酯[0104]

[0105] 将0.36g化合物3(0.58mmol)溶于15mL DMSO，往其中加入1.56g(8equiv.)二碘酰基苯甲酸，在100℃下回流10h，待反应液冷却，往其中加入5％ NaHCO3淬灭反应，得到白色悬浊液。用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用水，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)洗脱得到0.27g化合物4(白色固体，产率76％)。

[0106] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 7.58(d,J＝10.2Hz,1H,H‑1),5.94(s,1H,H‑12),5.83(d,J＝10.2Hz,1H,H‑2),3.71(s,3H,OCH3),1.76,1.61,1.46,1.21,1.12,1.11,0.74(s,3H,13
CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 205.9,205.3,202.7,195.2,176.3,167.4,158.9,
128.0,125.3,58.2,57.5,57.0,52.4,52.1,49.5,45.0,43.9,43.6,40.9,39.3,36.8,36.7,+
35.6,31.3,28.7,28.1,27.2,22.5,21.4,20.2,17.8；HRESIMS(m/z)[M+H] calculated 
C31H41O6 509.2903,found 509.2907。

[0107] 实施例6合成2‑碘代‑3，7，11，15‑四氧代‑18β‑齐墩果烷‑1，12‑二烯‑30‑羧酸甲酯[0108]

[0109] 将0.19g化合物4(0.39mmol)，0.30g(3equiv)碘单质和0.095g(0.2equiv.)4‑二甲氨基吡啶溶于4mL吡啶和CCl4(1：1)的混合液中，在90℃回流12h，待反应液冷却，旋蒸除去有机溶剂后往其中加入20％硫代硫酸钠溶液淬灭反应，得到金黄色液体。用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用水，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)洗脱得到0.15g化合物5(淡黄色固体，产率61％)。

[0110] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 8.41(s,1H,H‑1),6.00(s,1H,H‑12),3.75(s,3H,OCH3),13
1.81,1.67,1.50,1.26,1.21,1.21,0.78(s,3H,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 205.3,
205.2,196.0,194.9,176.4,167.8,166.8,127.9,101.6,58.2,57.4,56.5,52.1,52.1,
49.6,45.4,43.9,43.6,43.6,40.9,36.8,36.7,35.6,31.4,28.7,28.3,28.2,22.5,22.0,
+
20.0,17.9；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C31H39IO6 635.1870,found 635.1872。

[0111] 实施例7合成2‑氰基‑3，7，11，15‑四氧代‑18β‑齐墩果烷‑1，12‑二烯‑30‑羧酸甲酯[0112]

[0113] 将63.0mg化合物5(0.1mmol)溶于2mL DMF，往其中加入3.3mg(0.2equiv.)碘化钾，17.8mg(2equiv.)氰化亚铜，将回流反应体系内的气体与氮气进行置换，在氮气保护下，120℃回流3.5h后，待反应液冷却，用水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用水，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)洗脱得到34.7mg化合物6(淡黄色固体，产率65％)。

[0114] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 8.41(s,1H,H‑1),6.01(s,1H,H‑12),3.74(s,3H,OCH3),13
1.79,1.69,1.51,1.25,1.23,1.19,0.77(s,3H,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 205.2,
204.7,196.1,194.6,176.3,169.8,168.4,127.7,114.4,114.1,58.2,57.5,55.7,52.1,
51.2,49.6,45.3,43.9,43.6,40.9,40.0,36.8,36.3,35.6,31.3,28.7,28.1,27.2,22.4,
+
21.4,19.8,18.0；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C32H40NO6534.2586,found 534.2975。

[0115] 实施例8酶催化制备11‑氧代‑3β‑乙酰氧基‑7β‑羟基‑18β‑齐墩果烷‑12‑烯‑30‑羧酸

[0116]

[0117] 将1.25g(2.44mmol)的3β‑乙酰氧基甘草次酸溶于5％(v/v)DMSO，按照实施例1的方法制备得到的催化剂CYP161H12‑RHFRed为4L TB培养基所获得的菌体，按照实施例2的方法制备得到亚磷酸脱氢酶opt13为2LTB培养基所获得的菌体，其中催化剂的用量为0.34mol％。其余反应条件均与实施案例3第一次酶催化条件一致。用乙酸乙酯萃取酶反应液，除去有机溶剂后，用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：丙酮＝2：1)洗脱得到1.12g化合物8(白色固体，产率87％)。经质谱，核磁共振氢谱和碳谱检测，获得的结构数据与已报道的结构数据一致。

[0118] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 5.78(s,1H,H‑12),4.52(dd,J＝11.4,4.9Hz,1H,H‑3),4.10(dd,J＝10.8,4.9Hz,1H,H‑7),2.07(s,3H,CH3C＝O),1.46,1.25,1.18,1.16,0.91,
13
0.89,0.86(s,3H,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 199.3,181.7,171.1,169.3,128.6,
80.3,72.4,61.9,51.7,50.5,48.8,44.5,43.9,41.0,38.4,37.8,37.6,37.0,31.8,30.9,
+
30.1,28.7,28.5,28.5,28.0,26.6,23.7,23.5,21.3,16.7,16.1,12.3；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C32H49O6 529.3529,found 529.3533。

[0119] 实施例9合成11‑氧代‑3β‑乙酰氧基‑7β‑羟基‑18β‑齐墩果烷‑12‑烯‑30‑羧酸甲酯[0120]

[0121] 将0.20g化合物8(0.38mmol)溶于4mL DMF，往其中加入0.21g(4equiv.)碳酸钾在室温下搅拌30min，往反应液中加入47μL(2equiv.)碘甲烷，在室温下反应2.5h后旋蒸，加入水待析出大量白色固体，抽滤，收集滤饼烘干，滤饼用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：丙酮＝5：1)洗脱得到0.18g化合物9(白色粉末，产率88％)

[0122] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 5.70(s,1H,H‑12),4.50(dd,J＝11.5,4.9Hz,1H,H‑3),4.06(dd,J＝10.8,4.9Hz,1H,H‑7),3.68(s,3H,OCH3),2.05(s,3H,CH3C＝O),1.43,1.16,
13
1.15,1.14,0.89,0.88,0.81(s,3H,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 199.1,176.9,
171.0,169.2,128.6,80.3,72.3,61.9,51.8,51.7,50.4,49.0,44.5,44.1,41.2,38.4,
37.8,37.6,36.9,31.8,31.1,30.0,28.7,28.5,28.3,28.0,26.6,23.6,23.5,21.3,16.7,
+
16.1,12.2；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C33H51O6 543.3686,found 543.3688。

[0123] 实施例10合成7，11‑二氧代‑3β‑乙酰氧基‑18β‑齐墩果烷‑12‑烯‑30‑羧酸甲酯[0124]

[0125] 0.18g化合物9(0.33mmol)溶于4mL四氢呋喃，在冰浴下加入0.42mL琼斯试剂，移除冰浴，在室温下反应1h，加水淬灭得到墨绿色悬浊液，抽滤，收集滤饼烘干，滤饼用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：丙酮＝10：1)洗脱得到0.14g化合物10(白色粉末，产率77％)。

[0126] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 5.74(s,1H,H‑12),4.55(dd,J＝11.3Hz,5.0Hz,1H,H‑3),3.70(s,3H,OCH3),2.07(s,3H,CH3C＝O),1.39,1.35,1.32,1.17,0.91,0.86,0.80(s,3H,
13
CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 213.1,197.8,176.9,170.8,167.2,128.1,79.9,61.7,
59.0,51.8,51.1,50.3,44.6,44.1,40.1,37.8,37.7,37.4,37.2,36.4,32.2,31.0,28.4,
+
28.4,27.7,27.4,26.3,23.5,23.3,21.2,17.6,15.9,15.7；HRESIMS(m/z)[M+H]
calculated C33H49O6 541.3529,found 541.3532。

[0127] 实施例11合成7，11‑二氧代‑3β‑乙酰氧基‑18β‑齐墩果烷‑5，12‑二烯‑30‑羧酸甲酯

[0128]

[0129] 将0.14g化合物10(0.24mmol)溶于3mL乙酸，往其中滴入18.2μL(0.44equiv.)HBr和29.1μL(2.4equiv.)溴单质，37℃反应24小时后，加入20％硫代硫酸钠溶液淬灭，旋蒸除去乙酸后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，依次用水，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：丙酮＝10：1)纯化，得+到在高分辨质谱中分子量[M+H] 为619.2634的C6位发生溴代的混合物，通过制备高效液相
90％乙腈水等度洗脱，得到96.8mg C6位溴代产物‑1，44.3mg化合物C6位溴代产物‑2(均为白色固体，产率96％)。

[0130] 将35.5mg C6位溴代产物‑2(0.06mmol)溶于1mL collidine，在80℃下回流2h，加入2N盐酸淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，分别用2N盐酸，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)纯化，得到30.6mg化合物11(白色固体，产率99％)。

[0131] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.09(s,1H,H‑6),5.80(s,1H,H‑12),4.67(dd,J＝11.8,4.4Hz,1H,H‑3),3.71(s,3H,OCH3),2.10(s,3H,CH3C＝O),1.54,1.35,1.30,1.23,1.17,
13
1.15,0.85(s,3H,CH3×7)；CNMR(101MHz,CDCl3)δC 207.5,197.7,177.0,171.0,166.3,
128.5,79.4,59.5,58.7,58.7,51.8,49.8,49.6,45.6,44.0,40.2,39.3,38.6,37.6,35.4,
32.5,31.0,30.3,28.4,28.2,27.5,26.2,25.7,22.9,21.2,20.8,17.14,16.9；HRESIMS(m/+
z)[M+H]calculated C33H47O6 539.3373,found 539.3375。

[0132] 实施例12合成7，11‑二氧代‑3β‑乙酰氧基‑齐墩果烷‑5，12，18‑三烯‑30‑羧酸甲酯[0133]

[0134] 将0.2g化合物10(0.37mmol)溶于3mL乙腈，往其中加入0.24mg(2equiv.)PyHBr3，在37℃反应36h后，加入20％硫代硫酸钠溶液淬灭，旋蒸除去乙酸后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，依次用水，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：丙酮＝10：1)纯化，再进行制备高效液相85％乙腈水等度洗脱，得到0.12g化合物12(为白色固体，产率60％)。

[0135] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.06(s,1H,H‑6),5.81(s,1H,C‑12),5.74(s,1H,C‑19),4.65(dd,J＝11.8,4.4Hz,1H,H‑3),3.70(s,3H,OCH3),3.14(s,1H,C‑9),2.10(s,3H,CH3C＝
13
O),1.58,1.38,1.31,1.23,1.14,1.08,0.89(s,3H,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 
202.6,198.1,176.8,174.7,170.6,162.0,143.1,130.4,125.4,123.9,77.4,58.0,52.3,
52.3,46.1,44.3,41.5,37.8,35.7,35.7,35.3,34.6,27.9,27.1,26.0,25.2,24.5,24.2,
+
23.7,22.8,21.2,18.4,16.7；HRESIMS(m/z)[M+H]calculated C33H47O6 537.3216,found 
537.3222。

[0136] 实施例13合成7，11‑二氧代‑3β‑羟基‑齐墩果烷‑5，12，18‑三烯‑30‑羧酸甲酯[0137]

[0138] 将101mg化合物12(0.19mmol)溶于10mL甲醇，往其中加入650mg氢氧化钾，室温下搅拌2h后，旋蒸除去有机溶剂，用10％盐酸调节pH至4‑5，用二氯甲烷/乙酸乙酯＝1：4萃取，合并有机层，分别用饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后得到白色粗品。将上述粗品和100mg(4equiv.)碳酸钾溶于2mLDMF，室温搅拌30min，往其中加入24μL碘甲烷，在室温下反应2.5h后旋蒸，加入水待析出大量白色固体，抽滤，收集滤饼烘干，滤饼用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)洗脱得到89mg化合物13(白色粉末，产率88％)。

[0139] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 6.10(s,1H,H‑6),5.82(s,1H,H‑12),5.73(s,1H,H‑19),3.71(s,3H,OCH3),3.43(dd,J＝11.7,4.4Hz,1H,H‑3),3.12(s,1H,C‑9),1.57,1.39,1.31,
13
1.27,1.16,1.00,0.99(s,3H,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 202.8,198.3,176.8,
176.0,162.0,143.3,130.3,125.3,123.9,76.1,58.1,52.3,52.2,46.1,44.3,42.9,37.9,
36.1,35.7,35.3,34.7,27.9,27.2,26.4,26.1,25.2,24.5,23.6,22.9,18.4,16.7；HRESIMS+
(m/z)[M+H]calculated C31H43O5 495.3110,found 495.3092。

[0140] 实施例14合成3，7，11‑三氧代‑齐墩果烷‑1，5，12，18‑四烯‑30‑羧酸甲酯[0141]

[0142] 将62mg化合物13(0.12mmol)溶于2mL DMSO，往其中加入275mg(8equiv.)二碘酰基苯甲酸，在100℃下回流10h，待反应液冷却，往其中加入5％ NaHCO3淬灭反应，得到白色悬浊液。用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用水，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)洗脱得到50mg化合物14(白色固体，产率81％)。

[0143] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 7.53(d,J＝10.4Hz,1H,H‑1),6.11(s,1H,H‑6),5.99(d,J＝10.4Hz,1H,H‑2),5.89(s,1H,H‑12),5.76(s,1H,H‑19),3.71(s,3H,OCH3),3.31(s,1H,13
H‑9),1.83,1.48,1.46,1.40,1.30,1.08,1.01(s,3H,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 
205.9,205.3,202.7,195.2,176.3,167.4,158.9,128.0,125.3,58.2,57.5,57.0,52.4,
52.1,49.5,45.0,43.9,43.6,40.9,39.3,36.8,36.7,35.6,31.3,28.7,28.1,27.2,22.5,
+
21.4,20.2,17.8；HRMS(m/z)[M+H]calculated C31H41O6 491.2797,found491.2798。

[0144] 实施例15合成2‑碘代‑3，7，11‑三氧代‑齐墩果烷‑1，5，12，18‑四烯‑30‑羧酸甲酯[0145]

[0146] 将50.0mg化合物14(0.1mmol)，76.1mg(3equiv.)碘单质和2.4mg(0.2equiv.)4‑二甲氨基吡啶溶于1.6mL吡啶/CCl4＝1：1的混合液中，在90℃回流12h，待反应液冷却，旋蒸除去有机溶剂后往其中加入20％硫代硫酸钠溶液淬灭反应，得到金黄色液体。用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用水，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)洗脱得到47.5mg化合物15(淡1
黄色固体，产率74％)。H NMR(400MHz,CDCl3)δH 8.30(s,1H,H‑1),6.10(s,1H,H‑6),5.92(s,1H,H‑12),5.79(s,1H,H‑19),3.72(s,3H,OCH3),3.35(s,1H,H‑9),1.84,1.50,1.47,
13
1.46,1.31,1.08,1.00(s,3H,CH3×7)；C NMR(101MHz,CDCl3)δC 200.8,196.9,193.5,
176.6,167.7,163.2,159.9,142.9,131.2,125.7,123.5,99.2,53.6,53.4,52.3,49.4,
46.7,44.4,44.1,35.6,35.4,34.6,30.4,27.9,27.1,25.2,25.1,24.6,24.2,18.4,17.1；
+
HRMS(m/z)[M+H]calculated C31H38IO5 617.1764,found 617.1783。

[0147] 实施例16合成2‑氰基‑3，7，11‑三氧代‑齐墩果烷‑1，5，12，18‑四烯‑30‑羧酸甲酯[0148]

[0149] 将45.5mg化合物15(0.07mmol)溶于1.5mL DMF，往其中加入2.4mg(0.2equiv.)碘化钾，13.2mg(2equiv.)氰化亚铜，将回流反应体系内的气体与氮气进行置换，在氮气保护下，120℃回流3.5h后，待反应液冷却，用水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用水，饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后用200‑300目硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)洗脱得到25.1mg化合物16(淡黄色固体，产率66％)。

[0150] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 8.32(s,1H,H‑1),6.13(s,1H,H‑12),5.93(s,1H,H‑12),5.79(s,1H,H‑19),3.72(s,3H,OCH3),3.33(s,1H,H‑9),1.88,1.49,1.49,1.45,1.30,1.07,
13
1.01(s,3H,CH3×7)；CNMR(101MHz,CDCl3)δC 200.2,196.4,193.0,176.5,165.7,163.7,
163.2,142.7,131.5,126.4,123.2,113.7,113.2,53.7,53.0,52.3,49.2,46.8,44.4,40.5,+
35.5,35.4,34.6,29.9,27.9,27.1,25.1,24.8,24.6,22.9,18.4,17.2；HRMS(m/z)[M+H]
calculated C32H38NO5 516.2750,found 516.2770。

[0151] 实施例17多迈克尔反应受体五环三萜分子的药理作用研究

[0152] 采用CCK‑8法测定化合物对肿瘤细胞的抗增殖活性。CCK‑8检测细胞增殖抑制基于CCK‑8试剂盒中WST‑8可以在电子耦合试剂存在的情况下，被还原生成橙黄色水溶性的甲臜的特性进行实验。细胞增殖越多越快，颜色越深；反之则颜色越浅。在一定细胞数范围内，CCK‑8在450nm下的吸光度与活细胞数成正比，以此反映药物对细胞的增殖抑制作用。

[0153] 试剂：DMEM培养基(Glibco)、胎牛血清(BI)、胰蛋白酶(biosharp)、双抗(含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，biosharp)、PBS缓冲液(0.01M,pH＝7.4，biosharp)、DMSO(生工生物)、CCK‑8试剂盒(biosharp)。

[0154] 细胞株：人前列腺癌细胞PC‑3，人乳腺癌细胞MCF‑7、人结肠癌细胞SW480和人宫颈癌细胞Hela(均购买于中国科学院细胞库)

[0155] 配制不同浓度化合物溶液：称取一定量的化合物溶于DMSO配置成浓度为20mM的化合物母液。再用完全培养基对化合物母液进行稀释获得不同浓度的化合物溶液。本发明中化合物溶液浓度涉及200μM，80μM，40μM，20μM，10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.313μM。

[0156] 细胞培养：肿瘤细胞培养于含有10％(v/v)经加热灭活的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的高糖DMEM培养液配制而成的完全培养基中，所有实验用的细胞均于37℃培养箱，5％ CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞在培养皿中的密度为80％左右时处于指数生长期。

[0157] 细胞增殖抑制活性：将细胞以3000/孔细胞密度接种于96孔板中，每孔加入100μL含有细胞的完全培养基(另设三个孔作为空白组加入100μL不含细胞的完全培养基，三个孔作为阴性对照组正常加入100μL含有细胞的完全培养基)。于37℃，5％ CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后细胞贴壁，加入100μL配制好的化合物溶液(由于最终每孔体积为200μL，所以实测化合物浓度为所配制化合物溶液浓度的1/2)，每个化合物的每个浓度设置三个复孔。此时空白组和阴性对照组则加入100μL完全培养基。96孔板于37℃，5％ CO2饱和湿度培养箱中继续培养48小时后，避光条件下每孔加入20μL CCK‑8检测试剂，轻轻晃匀，37℃孵育
1.5h，用酶标仪检测450nm处每孔吸光度，并按照下列公式计算化合物对细胞的抑制率，三次初筛结果平均值为其最终抑制率，如表1所示。对于抑制率高于50％的化合物进一步进行浓度梯度筛选，用GraphPad Prism9求得半数生长抑制浓度IC50，3次重复实验结果为所测化合物的最终IC50值，如表2所示。

[0158] 细胞抑制率(Inhibition Rate；IR；％)＝[(阴性对照组OD值‑给药组OD值)]/[(阴性对照组OD值‑空白组OD值)]×100％

[0159] 首先，采用CCK‑8法检测40μM浓度下，分别评价阳性对照药甲基多巴索隆(由中国药科大学程莉课题组提供)，母体化合物1和本发明中特别优选的多迈克尔反应受体五环三萜分子化合物4、5、6、11、12、13、14、15和16对人宫颈癌细胞Hela的增殖抑制活性。根据表1中的结果，选择40μM浓度下肿瘤细胞抑制率>50％的化合物6，15和16进行下一步IC50值的测定，结果如表2所示，所选化合物的体外抗肿瘤活性均显著优于母体化合物1，且化合物16的抗肿瘤活性与阳性对照药CDDO‑Me相当。

[0160] 表1，化合物在40μM浓度下对Hela细胞的抑制作用

[0161]

[0162] 表2，化合物5，15，16和CDDO‑Me对四种人癌细胞株的体外抗增殖作用

[0163]

[0164] 由表1和表2可得出以下结论：

[0165] (1)整体来看，本发明涉及的结构新颖的多迈克尔反应受体五环三萜分子化合物4、5、6、13、14、15、16的抗肿瘤活性均优于母体化合物1。

[0166] (2)化合物6对SW480和Hela有显著的抗肿瘤活性，化合物15和16对PC‑3、MCF‑7、SW480和Hela肿瘤细胞株具有优异的抗增殖作用。

[0167] (3)结构中具有三个迈克尔反应受体分子的化合物16的抗肿瘤活性可以与阳性药物CDDO‑Me相当。

[0168] (4)对于同样含有氰基片段的化合物16和化合物6相比，结构中含有三个迈克尔反应受体模块的化合物16的抗肿瘤活性显著优于结构中含有两个迈克尔反应受体模块的化合物6。