[0001] 本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种能够在体外长期维持肝脏祖细胞稳定的自我更新培养体系及培养方法和应用。

[0002] 肝脏是维持体内稳态的核心器官，发挥着诸如代谢、糖原贮存、药物解毒、多种血浆蛋白合成以及胆汁分泌等广泛的作用。全球每年约有200万人死于肝病。对于终末期肝病，肝移植是唯一的治疗方法，然而，供体器官短缺和终生需要免疫抑制严重限制了该治疗手段的临床应用。肝细胞移植是治疗某些肝代谢紊乱和肝慢性损伤的有效方法，与实体器官移植相比具有侵入性小、成本低、可多次输入、并发症少等优点。自1992年开展第一例人肝细胞移植治疗肝硬化以来，目前已经有超过100例临床报道，特别是用来治疗肝代谢紊乱，肝细胞移植显示了良好的患者耐受性和不同程度的患者治疗获益，甚至长期的疾病缓解。

[0003] 肝细胞移植可以延长患者生命、降低肝脏器官移植等待期的死亡率，对治疗急性肝衰竭具有重要的临床价值。但是利用肝细胞移植治疗肝脏疾病也存在一系列瓶颈问题亟待解决。目前临床研究使用的肝细胞通常来自不适合器官移植的肝脏，肝细胞的来源和质量都严重限制了该治疗手段的系统评价和应用。实现肝脏祖细胞的自我更新将为肝脏疾病的细胞治疗提供稳定的细胞来源，并且因肝脏祖细胞具有肝细胞分化潜能，自我更新的肝脏祖细胞使得在体外大量制备功能性肝细胞成为可能，功能性肝细胞不仅可以作为细胞治疗的种子细胞，也可以用于制备体外人工肝支持系统，以及用于体外药物研发和毒理学评价。因此建立肝脏祖细胞的扩增体系、实现肝脏祖细胞的体外稳定自我更新具有重要的意义。

[0027] 现结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

[0028] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0029] 实施例1：小鼠肝脏祖细胞的获取

[0030] 选取SPF级孕12天左右的C57BL/6J(上海SLAC实验室)小鼠，以脊椎脱臼法处死孕鼠；于超净台中分离取出胚胎置于PBS中洗涤，用注射器针头剥离并挑出红色胎肝；将胎肝转移到1mL Accutase消化酶中(美国Invitrogen公司)，用针头将组织离散后37℃消化10分钟；过滤掉结缔组织，离心收集细胞，用7SCLS培养基重悬细胞，每只胚胎分得的胎肝细胞均匀铺到Matrigel基质胶包被的各个孔内；接种后2小时换液，去除含血细胞在内的大部分悬浮细胞；经2‑3次传代后，肝脏祖细胞因生长优势被逐步纯化。随后通常每3‑4天按1：6比例使用Accutase细胞消化液传代。

[0031] 实施例2：7SCLS培养条件可维持小鼠肝脏祖细胞的稳定自我更新

[0032] 1、肝脏祖细胞的鉴定及增殖情况分析

[0033] 通过与实施例1一致的方法分离得到Rosa26loxP‑mTom‑stop‑loxP–mGFP(mTmG)报告小鼠(Jackson Laboratory，Cat#007576)的肝脏祖细胞，进行相应的实验和分析。

[0034] 在7SCLS培养基中扩增至第5代的mTmG小鼠(该小鼠的所有细胞都组成性表达膜定位的红色荧光蛋白mTomato)肝脏祖细胞。肝脏祖细胞呈典型的铺路石样上皮细胞形态(图1A)，相对均一的表达mTomato(图1B，1C)和肝脏祖细胞标志分子甲胎蛋白(α1‑fetoprotein，AFP)和HNF4A(图1D‑1F)。

[0035] 小鼠肝脏祖细胞在7SCLS条件下通常每3‑4天按1：6比例使用Accutase传代。细胞可稳定传代超过20代，图4显示了小鼠肝脏祖细胞扩增至第15代时细胞的免疫荧光染色结果。细胞表达肝脏祖细胞的标志分子如AFP(图2A)、HNF4A(图2B)、角蛋白19(cytokeratin19，CK19)和DLK1(delta like non‑canonical Notch ligand 1)(图2C，2D)，上皮细胞标志E‑Cadherin和细胞增殖标志Ki‑67(图2E，2F)。生长曲线分析显示7SCLS培养条件与项目组前期研究ESCLS培养条件(EGF、SB431542、CHIR99021、LPA和S1P的蛋白和小分子组合)下的小鼠肝脏祖细胞有类似的细胞增殖过程(图3A)，染色体分析显示7SCLS条件下的肝脏祖细胞在第15代时仍然维持了正常的染色体数目(图3B)。上述结果表明了7SCLS可以维持小鼠肝脏祖细胞的稳定自我更新。

[0036] 2、740Y‑P维持肝脏祖细胞自我更新能力的机制分析

[0037] 通过与实施例1一致的方法分离得到C57BL/6小鼠的肝脏祖细胞，进行相应的实验和分析。

[0038] 740Y‑P是一种化学合成的PI3K激动剂，接下来对740Y‑P是否是通过PI3K信号通路维持肝脏祖细胞自我更新进行了验证。LY294002是一种PI3K的抑制剂，将LY294002加入7SCLS条件可显著降低肝脏祖细胞中Ki‑67的阳性率，将740Y‑P从培养基中去除(SCLS)同样导致Ki‑67的阳性率下降(图4A‑4D)；Western Blot证明了740Y‑P可以激活PI3K/AKT信号通路，且该作用可以被LY294002阻断(图4E)。上述结果验证了740Y‑P可通过激活PI3K信号通路维持肝脏祖细胞的自我更新。

[0039] 实施例3：7SCLS培养条件可以扩增人多能干细胞来源的肝脏祖细胞

[0040] 1、人肝脏祖细胞的获取

[0041] 首先将胚胎干细胞(H1和HUES9细胞系)诱导分化为人肝脏祖细胞，然后用7SCLS条件进行扩增培养。胚胎干细胞向肝脏祖细胞的诱导分化过程参照图5A所示：人胚胎干细胞(H1和HUES9细胞系)依次经过原条、内胚层、原始肠管等阶段，分化为肝脏祖细胞(各阶段分化培养体系详见实验材料与方法部分)；图5B显示了HUES9细胞(OCT4/SSEA4阳性)依次分化为原条(TBXT阳性)、内胚层(CXCR4/SOX17阳性)，最终在第11天分化为AFP和HNF4A阳性的肝脏祖细胞。

[0042] 2、7SCLS培养条件下人肝脏祖细胞的鉴定及增殖情况分析

[0043] 使用7SCLS条件扩增人多能干细胞来源的肝脏祖细胞，发现7SCLS同样可以有效的维持人胚胎干细胞来源的人肝脏祖细胞自我更新。图6显示了使用该培养条件传代至第10代的人肝脏祖细胞，细胞表达肝脏祖细胞的标志分子如AFP/HNF4A(图6A)、DLK1(图6B)、EpCAM(图6C)、上皮细胞标志分子E‑Cadherin(图6D)、细胞增殖标志Ki‑67和干细胞标志CD133(图6E)，β‑Catenin的表达也具有上皮细胞的特征性(图6F)。以上表明7SCLS培养基可以稳定扩增人多能干细胞来源的肝脏祖细胞。

[0044] 3、7SCLS培养条件下人肝脏祖细胞分化潜能分析

[0045] 利用包含HGF、OSM、Dex、SB431542和Compound E的诱导条件(简称为HOD培养基)诱导肝脏祖细胞向肝细胞分化。7SCLS扩增的小鼠肝脏祖细胞在HOD条件下诱导两周后可分化为ALB、CYP3A4阳性的肝细胞，而诱导前的小鼠肝脏祖细胞基本不表达上述肝细胞功能分子(图7A)。定量PCR分析证实了肝脏祖细胞经HOD诱导后肝细胞功能基因Alb、Hnf4a和转甲状腺素蛋白(transthyretin，Ttr)的表达上调，但是这些基因的表达水平显著低于新分离的肝细胞(图7B)；YAP的活化会抑制肝细胞功能，定量PCR分析显示HOD诱导分化的肝细胞YAP下游靶基因结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，Ctgf)和半胱氨酸富集血管生成诱导因子61(cysteine‑rich angiogenic inducer 61，Cyr61)的表达水平显著高于新分离的肝细胞(图7B)。将7SCLS培养条件下的肝脏祖细胞消化为单细胞悬液，置于50％Matrigel中进行三维培养一周。肝脏祖细胞可形成类似胆管样结构(图7C)，免疫荧光染色显示三维培养一周后形成的管样结构表达胆管上皮的标志分子(图7C)，如CK19、Integrinα6、Integrinβ4。F‑actin主要分布于管状结构的内腔面，与天然胆管类似(图7C)。
上述结果表明7SCLS培养条件下的肝脏祖细胞具有向肝细胞和胆管上皮细胞分化的双向潜能。

[0046] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。