技术领域
[0001] 本发明属于NK细胞培养技术领域，尤其涉及一种NK细胞培养体系及培养方法。
相关背景技术
[0002] NK细胞即为自然杀伤细胞，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质；
[0003] 目前，临床上获得NK的方法主要是从病人或者健康供者外周血中分离PBMC，利用包括IL‑2，IL‑15，IL‑21等在内的多种细胞因子进行诱导，扩增，使NK细胞在体外扩增到一定数量后回输给患者，达到治疗的目的。但是，依然有诸多障碍阻碍了NK的临床应用：NK体外扩增效率低，增殖能力较弱；培养后的NK细胞纯度不高；NK细胞在体外培养过程中无法得到充分的刺激与活化，导致其进入体内后对肿瘤细胞的杀伤效率低下。
具体实施方式
[0023] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请；本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。
[0024] 在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
[0025] 实施例1
[0026] 本发明实施例提供了一种NK细胞培养方法，如图1所示，包括如下步骤：
[0027] 分离单个核细胞，所述单个核细胞来源于外周血；
[0028] 按照接种密度2×106个/mL，细胞接种体积为10mL，取培养瓶并加入NK细胞培养体系，将所述单个核细胞加入所述培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，接种当天为细胞培养第0天，其中，所述NK细胞培养体系包括无血清培养基、NK细胞激活因子、丝素蛋白50μg/ml、儿茶素50μg/ml、改性聚乙烯醇3mg/ml、三磷酸腺甘二钠8ng/ml，所述无血清培养基为SCGM，其浓度为80％，所述NK细胞激活因子包括IL‑2、IL‑7、IL‑15和IFN‑alpha，所述IL‑2的终浓度为100IU/ml，所述IL‑7的终浓度为100IU/ml，所述IL‑15的终浓度为100IU/ml，所述IFN‑alpha的终浓度为200IU/ml；
[0029] 培养第4天，在原培养瓶换液；
[0030] 培养第6天，转移细胞至培养袋中，加入NK细胞培养体系，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
[0031] 培养12天，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得NK细胞。
[0032] 本实施例中，所述改性聚乙烯醇的制备方法如下：按重量份计，取10份聚乙烯醇置于5倍重量的去离子水中，加热至65℃，待冷却后，加入1份壳聚糖，搅拌均匀获得混合液，将混合液于搅拌条件下辐照处理3min，辐照剂量为40kGy，真空脱泡后于‑20℃下冷冻并冻干，得到改性聚乙烯醇。
[0033] 实施例2
[0034] 本发明实施例提供了一种NK细胞培养方法，如图1所示，包括如下步骤：
[0035] 分离单个核细胞，所述单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞；
[0036] 按照接种密度2×106个/mL，细胞接种体积为10mL，取培养瓶并加入NK细胞培养体系，将所述单个核细胞加入所述培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，接种当天为细胞培养第0天，其中，所述NK细胞培养体系包括无血清培养基、NK细胞激活因子、丝素蛋白60μg/ml、儿茶素60μg/ml、改性聚乙烯醇3.5mg/ml、三磷酸腺甘二钠10ng/ml，所述无血清培养基为SCGM，其浓度为80％，所述NK细胞激活因子包括IL‑2、IL‑7、IL‑15和IFN‑alpha，所述IL‑2的终浓度为300IU/ml，所述IL‑7的终浓度为200IU/ml，所述IL‑15的终浓度为200IU/ml，所述IFN‑alpha的终浓度为300IU/ml；
[0037] 培养第4天，在原培养瓶换液；
[0038] 培养第6天，转移细胞至培养袋中，加入NK细胞培养体系，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
[0039] 培养12天，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得NK细胞。
[0040] 本实施例中，所述改性聚乙烯醇的制备方法如下：按重量份计，取10份聚乙烯醇置于5倍重量的去离子水中，加热至65℃，待冷却后，加入1份壳聚糖，搅拌均匀获得混合液，将混合液于搅拌条件下辐照处理3min，辐照剂量为40kGy，真空脱泡后于‑20℃下冷冻并冻干，得到改性聚乙烯醇。
[0041] 实施例3
[0042] 本发明实施例提供了一种NK细胞培养方法，如图1所示，包括如下步骤：
[0043] 分离单个核细胞，所述单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞；
[0044] 按照接种密度2×106个/mL，细胞接种体积为10mL，取培养瓶并加入NK细胞培养体系，将所述单个核细胞加入所述培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，接种当天为细胞培养第0天，其中，所述NK细胞培养体系包括无血清培养基、NK细胞激活因子、丝素蛋白75μg/ml、儿茶素65μg/ml、改性聚乙烯醇4mg/ml、三磷酸腺甘二钠12ng/ml，所述无血清培养基为SCGM，其浓度为80％，所述NK细胞激活因子包括IL‑2、IL‑7、IL‑15和IFN‑alpha，所述IL‑2的终浓度为500IU/ml，所述IL‑7的终浓度为400IU/ml，所述IL‑15的终浓度为300IU/ml，所述IFN‑alpha的终浓度为400IU/ml；
[0045] 培养第4天，在原培养瓶换液；
[0046] 培养第6天，转移细胞至培养袋中，加入NK细胞培养体系，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
[0047] 培养12天，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得NK细胞。
[0048] 本实施例中，所述改性聚乙烯醇的制备方法如下：按重量份计，取12份聚乙烯醇置于5.5倍重量的去离子水中，加热至70℃，待冷却后，加入1.5份壳聚糖，搅拌均匀获得混合液，将混合液于搅拌条件下辐照处理5min，辐照剂量为50kGy，真空脱泡后于‑30℃下冷冻并冻干，得到改性聚乙烯醇。
[0049] 实施例4
[0050] 本发明实施例提供了一种NK细胞培养方法，如图1所示，包括如下步骤：
[0051] 分离单个核细胞，所述单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞；
[0052] 按照接种密度2×106个/mL，细胞接种体积为10mL，取培养瓶并加入NK细胞培养体系，将所述单个核细胞加入所述培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，接种当天为细胞培养第0天，其中，所述NK细胞培养体系包括无血清培养基、NK细胞激活因子、丝素蛋白90μg/ml、儿茶素70μg/ml、改性聚乙烯醇4.5mg/ml、三磷酸腺甘二钠14ng/ml，所述无血清培养基为SCGM，其浓度为80％，所述NK细胞激活因子包括IL‑2、IL‑7、IL‑15和IFN‑alpha，所述IL‑2的终浓度为800IU/ml，所述IL‑7的终浓度为600IU/ml，所述IL‑15的终浓度为400IU/ml，所述IFN‑alpha的终浓度为500IU/ml；
[0053] 培养第4天，在原培养瓶换液；
[0054] 培养第6天，转移细胞至培养袋中，加入NK细胞培养体系，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
[0055] 培养12天，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得NK细胞。
[0056] 本实施例中，所述改性聚乙烯醇的制备方法如下：按重量份计，取14份聚乙烯醇置于6倍重量的去离子水中，加热至75℃，待冷却后，加入2份壳聚糖，搅拌均匀获得混合液，将混合液于搅拌条件下辐照处理7min，辐照剂量为60kGy，真空脱泡后于‑40℃下冷冻并冻干，得到改性聚乙烯醇。
[0057] 实施例5
[0058] 本发明实施例提供了一种NK细胞培养方法，如图1所示，包括如下步骤：
[0059] 分离单个核细胞，所述单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞；
[0060] 按照接种密度2×106个/mL，细胞接种体积为10mL，取培养瓶并加入NK细胞培养体系，将所述单个核细胞加入所述培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，接种当天为细胞培养第0天，其中，所述NK细胞培养体系包括无血清培养基、NK细胞激活因子、丝素蛋白100μg/ml、儿茶素80μg/ml、改性聚乙烯醇5mg/ml、三磷酸腺甘二钠16ng/ml，所述无血清培养基为SCGM，其浓度为80％，所述NK细胞激活因子包括IL‑2、IL‑7、IL‑15和IFN‑alpha，所述IL‑2的终浓度为1000IU/ml，所述IL‑7的终浓度为800IU/ml，所述IL‑15的终浓度为500IU/ml，所述IFN‑alpha的终浓度为600IU/ml；
[0061] 培养第4天，在原培养瓶换液；
[0062] 培养第6天，转移细胞至培养袋中，加入NK细胞培养体系，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
[0063] 培养12天，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得NK细胞。
[0064] 本实施例中，所述改性聚乙烯醇的制备方法如下：按重量份计，取14份聚乙烯醇置于6倍重量的去离子水中，加热至75℃，待冷却后，加入2份壳聚糖，搅拌均匀获得混合液，将混合液于搅拌条件下辐照处理7min，辐照剂量为60kGy，真空脱泡后于‑40℃下冷冻并冻干，得到改性聚乙烯醇。
[0065] 实施例6(与实施例3相比，所述NK细胞培养体系还包括质量分数为0.3％的细菌纤维素)
[0066] 本发明实施例提供了一种NK细胞培养方法，如图1所示，包括如下步骤：
[0067] 分离单个核细胞，所述单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞；
[0068] 按照接种密度2×106个/mL，细胞接种体积为10mL，取培养瓶并加入NK细胞培养体系，将所述单个核细胞加入所述培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，接种当天为细胞培养第0天，其中，所述NK细胞培养体系包括无血清培养基、NK细胞激活因子、质量分数为0.2‑0.4％的细菌纤维素、丝素蛋白75μg/ml、儿茶素65μg/ml、改性聚乙烯醇4mg/ml、三磷酸腺甘二钠12ng/ml，所述无血清培养基为SCGM，所述NK细胞激活因子包括IL‑2、IL‑7、IL‑15和IFN‑alpha，所述IL‑2的终浓度为500IU/ml，所述IL‑7的终浓度为400IU/ml，所述IL‑15的终浓度为300IU/ml，所述IFN‑alpha的终浓度为400IU/ml；
[0069] 培养第4天，在原培养瓶换液；
[0070] 培养第6天，转移细胞至培养袋中，加入NK细胞培养体系，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
[0071] 培养12天，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得NK细胞。
[0072] 本实施例中，所述改性聚乙烯醇的制备方法如下：按重量份计，取12份聚乙烯醇置于5.5倍重量的去离子水中，加热至70℃，待冷却后，加入1.5份壳聚糖，搅拌均匀获得混合液，将混合液于搅拌条件下辐照处理5min，辐照剂量为50kGy，真空脱泡后于‑30℃下冷冻并冻干，得到改性聚乙烯醇。
[0073] 对比例1：与实施例3相比，将儿茶素替换为等量无血清培养基。
[0074] 对比例2：与实施例3相比，将改性聚乙烯醇替换为普通聚乙烯醇
[0075] 对比例3：与实施例3相比，将儿茶素替换为等量无血清培养基并将将改性聚乙烯醇替换为普通聚乙烯醇。
[0076] 对比例4：与实施例3相比，所述NK细胞培养体系为一种市售培养基。
[0077] 试验：
[0078] 一、分别取实施例1‑5、对比例1‑4的方法培养得到的NK细胞，采用台盼兰染色，细胞计数板计数及活率计算，结果如表1所示：
[0079] 表1
[0080]组别 初始细胞数 总细胞数 活率％ 增值倍数
7 9
实施例1 2×10 3.16×10 99.2 158
7 9
实施例2 2×10 3.19×10 99.3 159.5
7 9
实施例3 2×10 3.23×10 99.5 161.5
7 9
实施例4 2×10 3.21×10 99.4 160.5
7 9
实施例5 2×10 3.17×10 99.3 158.5
7 9
实施例6 2×10 3.45×10 99.6 172.5
7 9
对比例1 2×10 2.11×10 97.5 105.5
7 9
对比例2 2×10 2.05×10 97 102.5
7 9
对比例3 2×10 1.36×10 96.5 68
7 9
对比例4 2×10 1.33×10 96 66.5
[0081] 从以上结果可以看出，本发明NK细胞培养体系具有良好的促增殖作用，尤其儿茶素与改性聚乙二醇具有协同增效作用，能够显著提高NK细胞的扩增能力，通过加入细菌纤维素，能够进一步提高NK细胞的扩增能力。
[0082] 二、分别取实施例1和2、对比例1和2的方法培养得到的NK细胞，采用流式检测仪进行细胞纯度检测，结果如表2所示：
[0083] 表2
[0084]组别 CD3‑CD56+(％)
实施例1 94.0
实施例2 94.2
实施例3 94.3
实施例4 94.1
实施例5 94.0
实施例6 95.6
对比例1 67.5
对比例2 69.4
对比例3 49.3
对比例4 48.4
[0085] 从以上结果可以看出，本发明培养的NK细胞纯度高。
[0086] 三、采用乳酸脱氢酶法检测，K562为靶细胞，取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比20:1、10:1、5:1、1:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100μL；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清
100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)；按下式计算NK细胞杀伤活性：NK细胞杀伤活性(％)＝(反应孔OD－自然释放孔OD)/(最大释放孔OD－自然释放孔OD)×100％，结果如表3所示：
[0087] 表3
[0088]
[0089]
[0090] 从以上结果可以看出，本发明制备NK细胞对K562细胞的杀伤活性随效靶比的增高而增强，通过实施例组和对比例组比较，可以知道儿茶素与改性聚乙二醇具有协同增效作用，能够显著提高NK细胞的杀伤活性。
[0091] 需要说明的是，对于前述的各实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可能采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，涉及的动作和模块并不一定是本发明所必须的。
[0092] 本申请所提供的几个实施例中，应该理解到，所揭露的装置，可通过其他的方式实现。例如，以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，例如上述单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或通信连接可以是通过一些接口，装置或单元之间的间接耦合或通信连接，可以是电信或者其它的形式。
[0093] 上述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部单元来实现本实施例方案的目的。
[0094] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对发明的保护范围进行限制。显然，所描述的实施例仅仅是本发明部分实施例，而不是全部实施例。基于这些实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明所要保护的范围。尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域普通技术人员依然可以在不冲突的情况下，不作出创造性劳动对本发明各实施例中的特征根据情况相互组合、增删或作其他调整，从而得到不同的、本质未脱离本发明的构思的其他技术方案，这些技术方案也同样属于本发明所要保护的范围。
