[0001] 本发明属于生物技术、干细胞、肿瘤学领域，涉及采用凝集素用于啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的样品中识别、纯化干细胞的试剂盒。

[0002] “凝集素”这一术语最早在1888年出现，人们发现其具有凝集红细胞的特性。简单来说，凝集素也是一种蛋白质，广泛从植物、动物、真菌、细菌等中分离，具有结合糖脂或糖肽末端特异性碳水化合物的特性(SharonN等，Science，1972.177(53)：949-59；PusztaiA，植物凝集素，1991.剑桥：剑桥大学出版社)，且其唯一的特异性在于，它们是一组结构上有区别的蛋白质，且可特异性结合细胞膜上的碳水化合物，并进一步通过细胞膜表面寡糖基之间的交联实现对细胞的凝集(Pusztai A，植物凝集素，1991.剑桥：剑桥大学出版社；Sharon N，Trends Biochemistry Sci，1993.18(6)221-226)。

[0003] 众所周知，糖基化是在酶的作用下，实现对蛋白质或脂质附加上糖类的过程。此过程为共转移(co-translational)与后转移修饰的步骤之一，发生于内质网，细胞表面蛋白发生糖基化的几率几乎超过50％。早在二十世纪的八十年代，有研究者发现，凝集素具有结合或杀死胚胎性的细胞癌和生殖系肿瘤细胞的能力，后来又发现，多潜能干细胞表面上的抗原常常显示为糖蛋白或糖脂(Andrews PW等，Hybridoma，1984.3(4)：347-61；Pera MF等，Differentiation，1988.39(2)：139-49)，这提示蛋白质特异性糖基化可能是细胞具有多潜能性的标志。

[0004] 上述研究结果表明凝集素可能具有与多能性的细胞相互作用的特征(Draber P等，Somat Cell MolGenet，1984.10：435-443；Kosmehl H等，Neoplasma1989.36：29-39)。而且，膜结合蛋白和对应配体的低聚糖化修饰常常介导细胞外分子或信号启动的胞内信号传导(Haltiwanger RS.Curr Opin Struct Biol2002.12(5)：593-8；Xia L等，Blood，
2004.104(10)：3091-6)。人们发现，在许多细胞相关的事件，例如细胞分化(Moody AM等，Cell，2001.107(4)：501-12)以及肿瘤(Reis CA等，J Clin Pathol，2010.63(4)：322-9)发生中，均可观察到蛋白糖基化的动态变化。

[0005] 在胚胎水平，例如，小鼠胚胎多个组织器官的上皮细胞膜上，研究者发现其上有结合特异性凝集素的位点(Carter WG等，J.Bio1.Chem，l975.250(7)：2756-62；Noguchi M等，J.Embryol.Exp.Morphol，1982.72：39-52)，进一步观察发现，不同类型的凝集素在识别胚胎不同组织上皮方面具有差异性，有趣的是，当用低剂量放射性射线照射小鼠胚胎后(0.25、0.50和0.75Gy)，细胞膜上结合SBA、PNA和DBA三种凝集素的表达量增加(Nievergelt-Egido MC等，Radiat Environ Biophys，1993.32(2)：119-28)，而且在胚胎不同区域，三种凝集素的结合强度不同。随后在胚胎期发育的胰腺上皮和管状细胞膜上，其他研究者进一步发现，上述细胞膜上有可特异性结合群集素的位点，这表明识别细胞膜上特异性糖表位的凝集素可能作为一 个指示细胞具有多能性的标志，可用于表征胰腺前体细胞(Kobayashi等，BBRC，2002.293(2)：691-7)。近期研究发现，路易斯寡糖(Lewis X antigen)在小鼠的胚胎干细胞、多潜能细胞和胚胎癌性细胞的细胞膜上均有表达，而不在人类相应的胚胎干细胞、内细胞团或胚胎癌性细胞上表达(Muramatstu TA等，Glycoconjugate Joumal，2004.21：41-45)，未来还需要进一步研究这一不一致性。 [0006] 采用细胞生物学和生物化学方法，来自多个研究者的实验研究发现，人类胚胎干细胞与其蛋白的糖基化密切相关(Xia L等，Blood，2004.104：3091-6；SatomaaT等，BMC Cell Biol，2009.10：42；Venable A等，BMCDev Biol 2005；5：15)。细胞膜上的特异性糖原表位可作为一个新的、特异性标志，用于反映小鼠胚胎的早期分化状态，其表达早于目前所发现的胚胎特异性抗原，如SSEAl，CD9和FA，而且，随着胚胎分化进程的发展，其膜上特异性糖原表位的表达逐渐降低并消失(Nash Rodney等，2006，stem cell.25(4)：974-82)。Wang等采用培养的胚胎干细胞或诱导多能干细胞为研究对象，当用凝集素芯片分析细胞抽提物后发现，特异性的凝集素可用来识别和分离胚胎干细胞(Wang YC等，Cell Research，
2011.1-13)。。

[0007] 在成体水平，例如，识别D-半乳糖的刀豆凝集素(PNA)可用来对啮齿动物的造血干细胞进行进一步分群(SalnerAL等，1982，J Natl Cancer Inst.68(4)：639-41)，甚至可用来从神经组织中识别和分离出PNA阳性的细胞群(Rietze RL等，Nature，2001.412(6848)：736-9)，分选的细胞可能是干细胞。最近的研究发现，CDl33+的人造血干细胞和祖细胞的N-糖基化模式与N-glycan结构和基因表达密切相关(Hemmoranta H等，Exp Hematol，2007.35(8)：1279-92)。

[0008] 肿瘤/癌与凝集素

[0009] 肿瘤是机体细胞失去对其生长的正常调控而形成的新生物，是细胞自身调控和其所处的微环境相互作用的结果，其治疗仍是一个世界难题。目前肿瘤研究领域的一个研究热点是癌干细胞(Cancer Stem Cells，CSCs)。早期由多伦多大学的分子生物学家John Dick研究者提出“癌干细胞”理论(JohnDick等，Nature，1994.17：645-648)，这一新理论表明，癌症的发生及难于根治的在于其内癌干细胞(CSCs)的存在，随后的多个癌症研究中的研究结果支持此理论(ReyaT等，Nature，2001.414：105-111)，源自其他组织的进一步研究证实了癌干细胞是存在的，它们在例如血液、乳腺、脑组织、肺组织和肠组织中存在(Ai-Hajj M等，PNAS，2003100：3938-3988)；He等，Nat Genet，2007.39：189-198；Kim CF等，Cell，2005.121：823-835；Lapidot T 等，Nature，1994.367：645-648；Ricci-Vitiani L 等，Nature，2006；Singh SK 等，Nature，2004.432：396-401；Yilmaz OH 等，Nature，2006.441：475-482)。“癌干细胞”的提出给肿瘤的治疗带来曙光，因而，如果能够识别癌干细胞将具有及其重要的临床意义，例如通过靶向癌干细胞从而治愈肿瘤等，将产生重大的应用价值和经济效益。然而，遗憾的是，现在尚没有很有效的方法从肿瘤组织中识别、分离出癌干细胞，这也意味着在治疗中，不可能准确而彻底地清除掉癌干细胞。这大大阻碍了针对肿瘤的有效治疗。研究发现，肿瘤细胞表面和其所处的微环境中大量糖链修饰改变以及凝集素受体功能异常在肿瘤发生发展和转移过程中发挥极其重要的作用。其中，糖链合成的调控以及糖链与凝集素的相互作用参与了肿瘤生物学行为的各个方面。凝集素已广泛应用于肿瘤细胞表面糖连接物的研究，其在肿瘤的生物学行为研究、诊断、治疗及其预后方面起着十分重要的作用。

[0010] 成体干细胞：

[0011] 成体干细胞是另外一种特殊干细胞群，越来越多的证据表明成体干细胞可见于多种成熟组织(Moore KA,Science，2006.311(5769)：1880-1885)，而成体干细胞研究的基础和其在临床上的应用先决条件和最关键条件之一是对干细胞的有效且精准筛选分离。当前，研究者已鉴定到多个成体干细胞相关的分子表面标志，例如Thy-llow、FLK2-Lineage-Sca-1+c-Kit+用 于 识 别 造 血 干 细 胞 (Hematopoietic stem cells,HSCs)(ChristemsenJL 等，PNAS，2001.98：14541-14546；UchidaN 等，Experimental hematology,1996.24：649-659)，ISL1+、Sca-1+或c-kit+(Laugwitz KL，等，Nature.2004.433(7026)：647-653；Okada S 等，Blood，1991.78(7)：1706-12；MatsuuraK等，J Biol Chem,2004.279(12)：11384-91)，a 6 bri10G7dim用于识别表皮干细胞(LiA等，PNAS，1998.95(7)：3902-7；Tani H 等，PNAS，2000.97(20)：10960-10965；Lavker RM等，PNAS，2000.97(25)：13473-75)，虽然在成体干细胞特异分子标志方面取得了一定进展，但从成体中分离干细胞仍是极具挑战性的任务，一方面在于其数量较少且更难于定位、筛选分离各种组织特异性干细胞，另外一方面在于缺少可靠的特异性分子标记物对其进行识别，目前特异的细胞表面标记很难达到共识，其有效性需要进一步分析。 [0012] 发明内容

[0013] 本实用新型的目的是克服现有技术中所存在的缺点，为了克服上述方法上的不足及提供进一步相关的优点，本实用新型所提供的一种采用凝集素用于识别、纯化啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的干细胞的试剂盒，具有使用方便、经济、易操作、可工业化生产、实用有效的优点，应用前景广泛。

[0014] 本实用新型所述的采用凝集素用于识别、纯化干细胞的试剂盒，包括试剂、试剂瓶、盒体(1)，所述试剂盒包括:

[0015] 1)细胞预处理试剂A，盛放于细胞预处理试剂瓶(2)内；

[0016] 2)识别、纯化试剂B，盛放于识别纯化试剂瓶(3)内；

[0017] 本实用新型所述的试剂盒还包括细胞洗涤试剂瓶(4)，其中盛放洗脱糖试剂C，从而使得所述纯化的含干细胞的样品不带任何外来标记。

[0018] 本实用新型所述的试剂盒的所述细胞预处理试剂瓶(2)内的细胞预处理试剂A可选择为红细胞沉淀剂，或者可选择为红细胞裂解液，其中，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。

[0019] 其中，所述细胞沉淀剂选择为质量浓度为0.1～20％的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种。

[0020] 其中，所述红细胞裂解液可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9％的生理盐水溶液的任一一种。

[0021] 本实用新型所述的试剂盒的识别纯化试剂瓶(3)内的识别、纯化试剂B为凝集素结合物，包括但不限于天然的或人工合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的任一一种。

[0022] 其中，所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种。

[0023] 其中，所述与凝集素结合的高分子量的生物大分子的分子量在一万道尔顿(Mw)至八十万道尔顿(Mw)之间，其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。 [0024] 其中，所述凝集素的浓度为0.001～40mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于120分钟，孵育温度为小于或等于38℃。

[0025] 其中，所述干细胞是来源啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的正常成体和或病变、肿瘤、癌前、癌性、癌转移组织，或来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。

[0026] 其中，所述细胞预处理试剂瓶(2)内的试剂A还可选择为泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种。

[0027] 其中，所述试剂盒还包括放置试剂瓶的卡位槽及封闭试剂瓶的封闭盖，其中卡位槽选择由泡沫塑料、纸板制成，所述试剂瓶的封闭盖可选择为压力、螺丝的任一一种。 [0028] 附图说明

[0029] 据此，本发明通过上述试剂盒实现从所述啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的样品中识别、纯化干细胞，并进一步获得不带任何外来标记的含所述干细胞的样品，本发明所述分离的干细胞群在基础与应用研究、组织工程、治疗、修复受损或病变组织、药物筛选等中的应用。

[0030] 本发明所述试剂盒具有普遍适用性，可用于准确且快速识别、纯化啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的干细胞。进一步，所述试剂盒具有使用简捷、经济、可工业化生产、特异性强、实用有效，应用前景广泛的优点。

[0031] 图1用于识别、纯化干细胞的试剂盒组成

[0032] 该图表明了识别、纯化干细胞的试剂盒的组成，它包括试剂瓶、试剂、盒体。 [0033] 所述试剂盒(1)包括：细胞预处理试剂瓶(2)，识别、纯化试剂瓶(3)，细胞洗涤试剂瓶(4)，所述试剂瓶分别盛放细胞预处理试剂A，识别、纯化试剂B，细胞洗涤试剂C，所述识别、纯化试剂瓶(3) 中包含的试剂为凝集素及其结合物。所述试剂瓶的封闭盖可选择为压力、螺丝或其他。

[0034] 实施例1

[0035] 本实用新型的用于识别、纯化干细胞试剂盒，包括试剂、试剂瓶、盒体。 [0036] 所述试剂盒(1)包括：细胞预处理试剂瓶(2)，识别、纯化试剂瓶(3)，细胞洗涤试剂瓶(4)，所述试剂瓶分别盛放细胞预处理试剂A，识别、纯化试剂B，细胞洗涤试剂C，所述试剂瓶(2)、(3)、(4)中的试剂分别为氯化铵红细胞裂解液、FITC荧光染料标记的双花扁豆凝集素(FITC-DBA)、N-乙酰半乳糖胺。

[0037] 进一步，所述试剂瓶的封闭盖选择为压力。

[0038] 其中，所述细胞识别、纯化试剂瓶(3)中的凝集素的浓度为5mg/ml。 [0039] 其中，所述细胞识别、纯化试剂与肺组织来源的细胞群接触的时间为30～60分钟，孵育的温度为37℃。

[0040] 其中，所述细胞用生理盐水进行洗涤。

[0041] 进一步，所述细胞洗涤离心丢弃上清后用生理盐水重悬细胞，之后通过流式细胞仪进行分选。

[0042] 进一步，加入细胞洗涤试剂瓶(4)内的细胞洗涤试剂C洗涤细胞，从而把凝集素结合物从所述纯化的细胞群上洗脱下来，获得不带任何外来标记的含干细胞的样品。 [0043] 进一步，所述试剂盒可作用的对象为啮齿动物、人或其他哺乳动物的肺细胞群。 [0044] 其中，所述使用说明书用于说明从肺细胞群中识别、纯化肺干细胞的使用方法。 [0045] 其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量≤0.5EU/mL表示试剂盒合格。

[0046] 实施例2

[0047] 本实用新型的用于识别、纯化干细胞试剂盒，包括试剂、试剂瓶、盒体。 [0048] 所述试剂盒(1)包括：细胞预处理试剂瓶(2)，识别、纯化试剂瓶(3)，细胞洗涤试剂瓶(4)，所述试剂瓶分别盛放细胞预处理试剂A，识别、纯化试剂B，细胞洗涤试剂C，所述试剂瓶(2)、(3)、(4)中的试剂分别为右旋糖酐、结合牛血清白蛋白的蜗牛凝集素(HP)、N-乙酰半乳糖胺。

[0049] 进一步，所述试剂瓶的封闭盖选择为螺丝。

[0050] 其中，所述细胞识别、纯化试剂瓶(3)中的凝集素的浓度为1.2mg/ml。 [0051] 其中，所述细胞识别、纯化试剂与骨髓细胞群接触的时间为45分钟，孵育的温度为37℃。

[0052] 其中，吸取下层细胞沉淀，进一步，加入细胞洗涤试剂瓶(4)内的细胞洗涤试剂C洗涤细胞，从而把凝集素结合物从所述纯化的细胞群上洗脱下来，获得不带任何外来标记的含干细胞的样品。

[0053] 进一步，所述试剂盒可作用的对象为啮齿动物、人或其他哺乳动物的骨髓细胞群。 [0054] 其中，所述使用说明书用于说明从骨髓细胞群中识别、纯化干细胞的使用方法。 [0055] 其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量≤0.5EU/mL表示试剂盒合格。

[0056] 实施例3

[0057] 本实用新型的用于识别、纯化干细胞试剂盒，包括试剂、试剂瓶、盒体。 [0058] 所述试剂盒(1)包括：细胞预处理试剂瓶(2)，识别、纯化试剂瓶(3)，细胞洗涤试剂瓶(4)，所述试剂瓶分别盛放细胞预处理试剂A，识别、纯化试剂B，细胞洗涤试剂C，所述试剂瓶(2)、(3)、(4)中的试剂分别为Ficoll、结合牛血清白蛋白的荆豆凝集素(UEA)、海藻糖。

[0059] 进一步，所述试剂瓶的封闭盖选择为压力。

[0060] 其中，所述细胞识别、纯化试剂瓶(3)中的凝集素的浓度为2.1mg/ml。 [0061] 其中，所述细胞识别、纯化试剂与脐带血细胞群接触的时间为45分钟，孵育的温度为37℃。

[0062] 其中，吸取下层细胞沉淀，进一步，加入细胞洗涤试剂瓶(4)内的细胞洗涤试剂C洗涤细胞，从而把凝集素结合物从所述纯化的细胞群上洗脱下来，获得不带任何外来标记的含干细胞的样品。

[0063] 进一步，所述试剂盒可作用的对象为脐带血细胞群。

[0064] 其中，所述使用说明书用于说明从脐带血细胞群中识别、纯化干细胞的使用方法。 [0065] 其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量≤0.5EU/mL表示试剂盒合格。

[0066] 实施例4

[0067] 本实用新型的用于识别、纯化干细胞试剂盒，包括试剂、试剂瓶、盒体。 [0068] 所述试剂盒(1)包括：细胞预处理试剂瓶(2)，识别、纯化试剂瓶(3)，所述试剂瓶分别盛放细胞预处理试剂A，识别、纯化试剂B，所述试剂瓶(2)、(3)中的试剂分别为0.2％氯化钠、结合TRITC荧光染料的SJ凝集素。

[0069] 进一步，所述试剂瓶的封闭盖选择为螺丝。

[0070] 其中，所述细胞识别、纯化试剂瓶(3)中的凝集素的浓度为0.03mg/ml。 [0071] 其中，所述细胞识别、纯化试剂与肝癌细胞群接触的时间为100分钟，孵育的温度为4℃。

[0072] 其中，所述细胞用生理盐水进行洗涤。

[0073] 进一步，所述细胞洗涤离心丢弃上清后用生理盐水重悬细胞，之后通过流式细胞仪进行分选。

[0074] 进一步，所述试剂盒可作用的对象为啮齿动物、人或其他哺乳动物来源的肝癌细胞群。

[0075] 其中，所述使用说明书用于说明从肝癌细胞群中识别、纯化肝癌干细胞的使用方法。

[0076] 其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量≤0.5EU/mL表示试剂盒合格。

[0077] 实施例5

[0078] 本实用新型的用于识别、纯化干细胞试剂盒，包括试剂、试剂瓶、盒体。 [0079] 所述试剂盒(1)包括：细胞预处理试剂瓶(2)，识别、纯化试剂瓶(3)，细胞洗涤试剂瓶(4)，所述试剂瓶分别盛放细胞预处理试剂A，识别、纯化试剂B，细胞洗涤试剂C，所述试剂瓶(2)、(3)、(4)中的试剂分别为氯化铵裂解液、明胶结合的PT和RC凝集素、N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖。

[0080] 进一步，所述试剂瓶的封闭盖选择为压力或螺丝。

[0081] 其中，所述细胞识别、纯化试剂瓶(3)中的凝集素的浓度为4.8mg/ml。 [0082] 其中，所述细胞识别、纯化试剂与肝脏、肺脏细胞群接触的时间为30～45分钟，孵育的温度为37℃。

[0083] 其中，吸取下层细胞沉淀，进一步，加入细胞洗涤试剂瓶(4)内的细胞洗涤试剂C洗涤细胞，从而把凝集素结合物从所述纯化的细胞群上洗脱下来，获得不带任何外来标记的含干细胞的样品。

[0084] 进一步，所述试剂盒可作用的对象为动物、人或其他哺乳动物来源的肝脏、肺脏细胞群。

[0085] 其中，所述使用说明书用于说明从肝脏、肺脏细胞群中识别、纯化干细胞的使用方法。

[0086] 其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量≤0.5EU/mL表示试剂盒合格。

[0087] 实施例6

[0088] 本实用新型的用于识别、纯化干细胞试剂盒，包括试剂、试剂瓶、盒体。 [0089] 所述试剂盒(1)包括：细胞预处理试剂瓶(2)，识别、纯化试剂瓶(3)，细胞洗涤试剂瓶(4)，所述试剂瓶分别盛放细胞预处理试剂A，识别、纯化试剂B，细胞洗涤试剂C，所述试剂瓶(2)、(3)、(4)中的试剂分别为0.2％氯化钠、FITC荧光染料标记的SJ凝集素、N-乙酰葡萄糖胺。

[0090] 进一步，所述试剂瓶的封闭盖选择为压力或螺丝。

[0091] 其中，所述细胞识别、纯化试剂瓶(3)中的凝集素的浓度为7.6mg/ml。 [0092] 其中，所述细胞识别、纯化试剂与心脏组织来源的细胞群接触的时间为45～60分钟，孵育的温度为16℃。

[0093] 其中，所述细胞用生理盐水进行洗涤。

[0094] 进一步，所述细胞洗涤离心丢弃上清后用生理盐水重悬细胞，之后通过流式细胞仪进行分选。

[0095] 进一步，加入细胞洗涤试剂瓶(4)内的细胞洗涤试剂C洗涤细胞，从而把凝集素结合物从所述纯化的细胞群上洗脱下来，获得不带任何外来标记的含干细胞的样品。 [0096] 进一步，所述试剂盒可作用的对象为啮齿动物、人或其他哺乳动物的心脏细胞群。 [0097] 其中，所述使用说明书用于说明从心脏细胞群中识别、纯化心脏干细胞的使用方法。

[0098] 其中，整个操作过程保持在无菌工作环境中进行操作，其中，内毒素检测含量≤0.5EU/mL表示试剂盒合格。

[0099] 显然在不违反本实用新型的领域及范畴下，可以对上述用于富集、提纯干细胞的试剂盒进行成分的修饰及或增加，本实用新型是以上述实施例进行试剂盒的说明，并不是用于限制试剂盒的使用，对此进行的任何等同替换、修改、增加均落在本实用新型的试剂盒保护范畴内。