[0001] 本发明涉及体外诊断技术领域，具体而言，涉及一种用于鉴定不同加德纳菌种的核酸组合物及试剂盒。

[0002] 细菌性阴道病(BV)是全球育龄妇女常见的生殖道感染性疾病之一，其特征为细菌多样性水平增加、BV相关厌氧菌的丰度增多、阴道乳酸杆菌丰度下降。BV与多种不良孕产结局有关，如增加早产风险、性传播感染等疾病的发生率。然而目前BV的发生机制仍未完全探明，其临床症状表现的差异表现以及微生物的复杂动态变化使得对BV的深入研究具有挑战性。

[0003] 加德纳菌是一种大小为1.5～2.5×0.5μm，多形性，无荚膜，无鞭毛，革兰氏染色不稳定的细菌，其是第一个被发现与BV相关的细菌，也是引起的细菌性阴道病(BV)的最主要病原菌之一。研究表明，BV患者中阴道加德纳菌的丰度会出现明显增加，说明其可能是BV发生发展过程中的关键微生物。然而，其他几项研究发现在接近一半以上的非BV女性中，也可以通过PCR检测到加德纳菌，导致阴道加德纳菌在BV病因中的作用更为扑朔迷离。随着测序技术的不断发展与应用，对于阴道加德纳菌的进一步研究发现，既往被归类为阴道加德纳菌属中唯一菌种的阴道加德纳菌已经被证明由至少13种物种组成，其中6个已经被命名：加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、皮奥氏加德纳菌(Gardnerella piotii)、斯威辛斯基加德纳菌(Gardnerella swidsinskii)、利奥波尔加德纳菌(Gardnerella leopoldii)、皮克加德纳菌(Gardnerella pickettii)和格林伍德加德纳菌(Gardnerella greenwoodii)。上述6种微生物目前已经被证实存在于女性阴道分泌物中，部分研究还初步揭示了加德纳菌属中不同菌种的患病率与其可能的致病机制，因此对于阴道加德纳菌属中上述6种微生物的检测对于深入探究细菌性阴道病的发生机制以及用药指导具有重要的指导作用。

[0004] 然而，目前研究报道中对于上述6种菌种的鉴定及定量分析一般基于16S测序或宏基因组测序技术，该类方法往往依赖于昂贵的测序仪器、高质量的生信分析结果及基因数据库，且检测通常需要2～5天，因此目前还远远不能满足临床诊断和治疗的需要。

[0005] 鉴于此，特提出本发明。

[0049] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0050] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0051] 实施例1

[0052] 本实施例提供了一种用于鉴定不同加德纳菌种的试剂盒，其包括：扩增加德纳菌、皮奥氏加德纳菌、斯威辛斯基加德纳菌、利奥波尔加德纳菌、皮克加德纳菌和格林伍德加德纳菌的引物和荧光探针，Hotstart HiTaq PCR Mix(MD009A，菲鹏生物股份有限公司)，表1为6种加德纳菌的引物和荧光探针的序列信息，如下所示：

[0053] 表1 6种加德纳菌的引物和荧光探针的序列信息

[0054]

[0055] 实施例2

[0056] 本实施例利用实施例1的试剂盒进行6种加德纳菌的临床样本检测，具体如下：

[0057] 根据临床微生物样本采集规范，从西安医学院第一附属医院收集临床检验完成后的阴道分泌物样本20例，按照下述流程进多重荧光探针法检测，并利用16S测序法确定样本中病原菌类型进行对比分析。

[0058] 1)阴道分泌物样本DNA提取：DNA提取流程完全依据细菌、真菌核酸提取试剂盒UPure Microbial DNA Kit(M2019，新百基生物)的说明书进行。

[0059] 2)按照如下配置PCR反应体系：

[0060] 表2PCR反应体系配置1

[0061]

[0062] 表3PCR反应体系配置2

[0063]

[0064]

[0065] 3)按照如下程序进行扩增：95℃5min；95℃30s；60℃40s，40个循环。为了监测PCR扩增过程，设置相应的阳性对照及阴性对照，分别以加德纳菌、皮奥氏加德纳菌、斯威辛斯基加德纳菌、利奥波尔加德纳菌、皮克加德纳菌和格林伍德加德纳菌人工合成质粒以及水作为扩增模板。

[0066] 4)利用上述扩增引物和探针(SEQ ID NO：1‑18)分别对7例临床样本进行PCR检测，根据PCR检测结果中的扩增曲线是否出现、扩增曲线对应荧光标记类型以及Ct值来反映样本当中上述6种微生物的检出情况。

[0067] 检测结果如表4所示：

[0068] 表4临床样本检测结果对比

[0069]

[0070]

[0071] 各样本中被16s测序技术检出的上述6种病原体均可被基于多重荧光探针法的阴道加德纳菌种水平检测方法检测到，由此可知本发明提供的方法能够有效的鉴定和检测阴道分泌物样本中加德纳菌、皮奥氏加德纳菌、斯威辛斯基加德纳菌、利奥波尔加德纳菌、皮克加德纳菌和格林伍德加德纳菌的存在情况，可用于上述6种病原体的快速、精准的检测，从而缩短临床诊断时间，实现个体化诊疗。

[0072] 实验例1

[0073] 基于多重荧光探针法的阴道加德纳菌种水平检测方法的特异性验证[0074] (1)引物特异性检验

[0075] 为了明确上述6种病原菌引物的特异性，针对上述扩增引物分别以加德纳菌、皮奥氏加德纳菌、斯威辛斯基加德纳菌、利奥波尔加德纳菌、皮克加德纳菌和格林伍德加德纳菌人工合成质粒、以及临床常见的其他几种病原菌如卷曲乳酸杆菌、惰性乳酸杆菌、阴道阿托波氏菌、巨型球菌2型等几种病原菌所提取的基因组DNA为模板，进行交叉反应。

[0076] 1)按照实施例2配置PCR反应体系：

[0077] 2)按照如下程序进行扩增：95℃5min；95℃30s；60℃40s，40个循环。为了监测PCR扩增过程，设置相应的阳性对照及阴性对照，分别以加德纳菌、皮奥氏加德纳菌、斯威辛斯基加德纳菌、利奥波尔加德纳菌、皮克加德纳菌和格林伍德加德纳菌人工合成质粒以及水作为扩增模板。

[0078] 3)根据PCR检测结果中的扩增曲线是否出现、扩增曲线对应荧光标记类型以及Ct值来反映样本当中上述6种微生物的检出情况及含量水平。

[0079] (2)实验结果

[0080] 如图2至图5所示，以加德纳菌、皮奥氏加德纳菌、斯威辛斯基加德纳菌、利奥波尔加德纳菌、皮克加德纳菌和格林伍德加德纳菌人工合成质粒为模板进行PCR扩增时，有符合目标产物荧光标记的“S”型扩增曲线产生，说明特异性引物(SEQ ID NO:1‑18)能够有效扩增加德纳菌、皮奥氏加德纳菌、斯威辛斯基加德纳菌、利奥波尔加德纳菌、皮克加德纳菌和格林伍德加德纳菌这6种病原菌特异性核酸片段(SEQ ID NO：19‑24)。以其他病原体物种为模板进行PCR扩增时，没有符合目标产物荧光标记的“S”型扩增曲线产生，表明特异性引物(SEQ ID NO:1‑18)不会发生非特异性扩增反应。同时，在阴性对照实验中，也未出现非特异性条带。因此，结果表明上述扩增引物(SEQ ID NO:1‑18)能够有效且特异性的检测上述6种病原菌，为本发明提供的阴道加德纳菌种水平特异性检测技术的临床应用提供了支撑。

[0081] 实验例2

[0082] 基于多重荧光探针法的阴道加德纳菌种水平检测方法的最低检测限与线性范围验证

[0083] 为了明确本发明中基于多重荧光探针法的阴道加德纳菌种水平检测方法的最低检测限与线性范围，以加德纳菌、皮奥氏加德纳菌、斯威辛斯基加德纳菌、利奥波尔加德纳菌、皮克加德纳菌和格林伍德加德纳菌的人工合成质粒为模拟样本，依据浓度‑拷贝数换算3
公式计算母液中质粒拷贝数浓度单位，对高浓度质粒溶液进行梯度稀释，获得终浓度为10
9
～10copies/mL的上述待检测微生物梯度浓度模拟样本，各模拟样本具体浓度值见表5，按照表5、6配制的各个梯度浓度模拟样本的PCR反应体系，每个梯度重复实验三次。

[0084] 表5稀释梯度与稀释浓度

[0085]

[0086] 表6PCR反应体系配制表3

[0087]

[0088]

[0089] 表7PCR反应体系配制表4

[0090]

[0091]

[0092] 4)按照如下程序进行扩增：95℃5min；95℃30s；60℃40s，40个循环，设置质粒稀释液为阴性对照品，以对PCR扩增过程及结果进行质控。上述反应在ABI 7500PCR仪上完成。

[0093] 5)读值：人为设定荧光阈值线Threshold为ΔRn＝50000后，读取各浓度梯度对应各靶标荧光扩增曲线的Ct值。

[0094] 6)获得各浓度梯度对应Ct值和拷贝数浓度，通过计算回归方程(Y＝aX+b)来计算不同靶标的线性范围。

[0095] 7)本方法中将线性范围中的最低浓度作为各靶标的最低检测限，依据表2、3所述配制模拟样本为各靶标最低检测限浓度的PCR反应体系，按照如下程序进行扩增：95℃5min；95℃30s；60℃40s，40个循环，重复实验20次，计算各靶标的检测Ct值、变异系数、靶标检出数量与检出率。

[0096] 结果分析：从图6可知，各靶标梯度稀释实验结果说明，在线性关系R2>0.990的情3 9
况下，加德纳菌的线性检测范围为3.20×10～3.20×10copies/mL，皮奥氏加德纳菌的线
4 9
性检测范围为3.24×10～3.24×10 copies/mL，斯威辛斯基加德纳菌的线性检测范围为
3 9 4
2.97×10～2.97×10copies/mL，利奥波尔加德纳菌的线性检测范围为3.10×10～3.10
9 4 9
×10copies/mL，皮克加德纳菌的线性检测范围为3.13×10～3.13×10copies/mL，格林
4 9
伍德加德纳菌的线性检测范围为3.24×10～3.24×10copies/mL。

[0097] 将线性范围中各靶标的最低浓度值作为本技术中各靶标的最低检测限，分别重复20次检测结果见表8。

[0098] 表8最低检测限重复验证实验结果

[0099]

[0100] 从表7中可以看出，各靶标检出率均高于95％(19/20)，检测结果Ct值变异系数(CV％)小于5％。

[0101] 通过以上实验结果证明，本发明中的核酸组合物在鉴定加德纳菌、皮奥氏加德纳菌、斯威辛斯基加德纳菌、利奥波尔加德纳菌、皮克加德纳菌和格林伍德加德纳菌时，具有较佳的特异性、灵敏度和重复性，因此将本发明的核酸组合物以及检测方法用于鉴定不同加德纳菌具有良好的应用前景。

[0102] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。